江俊 吳玉銘 何夢(mèng)嬌 鄭寶玉 許雄程 李艷芬 陳玉玲 駱凱*

1．福建醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院，福建福州350002

2．中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院安徽省立醫(yī)院，安徽合肥230000

3．福建醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)研究院，福建福州350002

4．溫州醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院，浙江溫州325027

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是一種骨代謝疾病，以骨結(jié)構(gòu)異常、骨脆性增高和骨量減少為主要臨床表現(xiàn)，易出現(xiàn)骨折，嚴(yán)重影響中老年人的生活質(zhì)量。更年期婦女隨著體內(nèi)雌激素水平的下降，骨量迅速丟失，易出現(xiàn)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松(postmenopausal osteoporosis，PMO)［1］。研究顯示［2－3］PMO 與牙周炎存在明顯相關(guān)性，可加速牙周組織的破壞。如何實(shí)現(xiàn)PMO狀態(tài)下的牙周組織再生是當(dāng)前牙周病臨床治療所面臨的眾多挑戰(zhàn)之一。近年來(lái)，組織工程技術(shù)與基因工程技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用為實(shí)現(xiàn)牙周組織的修復(fù)再生提供了新的思路。牙骨質(zhì)蛋白1(cementum protein 1，CEMP1)作為牙骨質(zhì)特異性蛋白之一，可促進(jìn)非礦化細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，有望應(yīng)用于牙周組織的再生［4］。因此，本研究擬通過(guò)構(gòu)建人CEMP1基因重組慢病毒過(guò)表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)染PMO大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞(bone marrow stromal cells，BMSCs)，使CEMP1在PMO大鼠BMSCs中穩(wěn)定表達(dá)，同時(shí)將過(guò)表達(dá)CEMP1的BMSCs與β磷酸三鈣(β－tricalcium phosphate，β－TCP)復(fù)合培養(yǎng)，觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，為后續(xù)利用CEMP1實(shí)現(xiàn)骨質(zhì)疏松狀態(tài)下的牙周組織再生奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:3月齡 SPF級(jí)Sprague－Dawley(SD)雌性大鼠，體重280～300 g，動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(滬)2012－0002。按嚙齒類動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)于南京軍區(qū)福州總醫(yī)院比較醫(yī)學(xué)科，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 主要試劑與儀器:DMEM低糖培養(yǎng)基、胎牛血清(Hyclone，美國(guó));0.25%胰蛋白酶(Gibico BRL，美國(guó));重組慢病毒 LV－CEMP1－EGFP(本實(shí)驗(yàn)室保存);抗壞血酸、β－磷酸甘油、地塞米松和茜素紅(Sigma，美國(guó));堿性磷酸酯酶顯色試劑盒、堿性磷酸酶檢測(cè)試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司);Prime ScriptTMRT Reagent Kit和 SYBR Primix Ex TaqTM試劑盒(Takara，日本);Trizol試劑盒(Invitrogen，美國(guó));β－TCP(上海貝奧路生物材料有限公司);CEMP1多克隆抗體(Abcam公司);生物安全柜(力申科學(xué)儀器有限公司，上海);細(xì)胞培養(yǎng)箱(Heraeus，德國(guó));iMARK 酶標(biāo)儀(Bio－Rad，美國(guó));實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Roche LightCycler 480，德國(guó));相差熒光顯微鏡(Olympus，日本);電泳裝置(Bio－Rad，美國(guó));掃描電鏡 (FEI Nova Nano SEM230，美國(guó))。

1.2 方法

1.2.1 PMO大鼠BMSCs的獲取及體外培養(yǎng):參照課題組前期方法［5］建立骨質(zhì)疏松大鼠模型，模型建立成功后將大鼠經(jīng)麻醉頸椎脫臼處死。無(wú)菌條件下取出大鼠雙側(cè)股骨和脛骨，剪去骨端兩側(cè)，采用細(xì)胞培養(yǎng)液反復(fù)沖洗骨髓腔，直到骨頭發(fā)白為止。將獲取的細(xì)胞懸液經(jīng)1 000 r/min，離心5 min，棄上清，DMEM低糖培養(yǎng)液(含青霉素100 U/mL，鏈霉素100 mg/L，10%FBS)重懸，置于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中。第3天首次半量換液，之后按常規(guī)進(jìn)行換液。待細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%時(shí)進(jìn)行消化傳代，實(shí)驗(yàn)選擇P3以內(nèi)細(xì)胞進(jìn)行。

1.2.2 PMO大鼠BMSCs體外成骨分化能力檢測(cè):PMO大鼠BMSCs以每孔1×105個(gè)接種于6孔板，以成骨誘導(dǎo)液(基礎(chǔ)培養(yǎng)液中加入50 μg/mL維生素C、10 mmol/L β－磷酸甘油、10 nmol/L 地塞米松)進(jìn)行培養(yǎng)，每3天換液。誘導(dǎo)7 d后收集細(xì)胞進(jìn)行ALP染色，誘導(dǎo)21 d后進(jìn)行礦化結(jié)節(jié)茜素紅染色。

1.2.3 PMO大鼠BMSCs基因轉(zhuǎn)染檢測(cè):將PMO大鼠BMSCs以1×104/cm2密度進(jìn)行接種，待細(xì)胞生長(zhǎng)至約70%融合時(shí)參照課題組前期方法［6］進(jìn)行目的基因轉(zhuǎn)染。實(shí)驗(yàn)分組如下:轉(zhuǎn)染組(LV－CEMP1－EGFP)、空載體組 (LV－EGFP)和空白對(duì)照組(BC)。目的基因轉(zhuǎn)染后通過(guò)倒置熒光顯微鏡對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行觀察，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR及免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)CEMP1的表達(dá)情況。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)引物序列見(jiàn)表1。

表1 PCR反應(yīng)引物序列及產(chǎn)物大小Table 1 Specific primers of PCR and product size

1.2.4 基因轉(zhuǎn)染PMO大鼠BMSCs與β－TCP復(fù)合培養(yǎng):β－TCP預(yù)濕后置于37℃培養(yǎng)箱中備用，將LV－CEMP1－EGFP轉(zhuǎn)染的PMO大鼠 BMSCs消化后，調(diào)整細(xì)胞密度至1×107個(gè)/mL接種于β－TCP表面，每平方厘米接種50 μL。37°C培養(yǎng)箱中靜置2 h后緩慢加入培養(yǎng)液，24 h后進(jìn)行倒置熒光顯微鏡和掃描電鏡觀察。

2 結(jié)果

2.1 PMO大鼠BMSCs原代培養(yǎng)及成骨分化能力檢測(cè)

BMSCs原代培養(yǎng)3 d時(shí)，鏡下仍有較多的紅細(xì)胞存在，也可見(jiàn)到少量梭形貼壁細(xì)胞。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞呈集落樣生長(zhǎng)，形態(tài)表現(xiàn)為紡錘形或多角形。培養(yǎng)10 d左右，細(xì)胞即可達(dá)到80%～90%，可進(jìn)行傳代(圖1a)。成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)7 d時(shí)細(xì)胞ALP染色呈棕黑色(圖1b)，成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)21 d時(shí)即可觀察到茜素紅染色呈橘紅色的礦化結(jié)節(jié)(圖1c)。

圖1PMO大鼠BMSCs體外培養(yǎng)及成骨分化檢測(cè)(×100)a:原代培養(yǎng)的BMSCs;b:ALP染色;c:鈣結(jié)節(jié)茜素紅染色。Fig．1 Morphological observation and osteogenic differentiation of PMO rat BMSCs(×100)

2.2 CEMP1基因轉(zhuǎn)染PMO大鼠BMSCs檢測(cè)

PMO大鼠BMSCs經(jīng)慢病毒轉(zhuǎn)染24 h即可觀察到綠色熒光，隨著時(shí)間的增加，細(xì)胞熒光逐漸加強(qiáng)，細(xì)胞形態(tài)未出現(xiàn)明顯的改變，BC組未見(jiàn)熒光表達(dá)(圖2)。通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染72 h后LV－CEMP1－EGFP組熒光表達(dá)率為86.9%，見(jiàn)圖2e。

2.3 基因轉(zhuǎn)染后PMO大鼠BMSCs中CEMP1基因表達(dá)檢測(cè)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示CEMP1基因轉(zhuǎn)染PMO大鼠 BMSCs后，僅 LV－CEMP1－EGFP組有CEMP1基因的擴(kuò)增曲線，而LV－EGFP組和BC組均未見(jiàn)該基因擴(kuò)增曲線(圖3)。

圖2 LV－CEMP1－EGFP轉(zhuǎn)染PMO大鼠BMSCs檢測(cè)(×100)a＆b:LV－CEMP1－EGFP 組;c＆d:BC 組;e:LVCEMP1－EGFP組轉(zhuǎn)染率。Fig．2 Detection of PMO rat BMSCs after LV－CEMP1－EGFP transfection(×100)

圖3PMO大鼠BMSCs中CEMP1 mRNA的表達(dá) a:GAPDH擴(kuò)增曲線;b:LV－CEMP1－EGFP轉(zhuǎn)染組目的基因擴(kuò)增曲線;c:空載體LV－EGFP轉(zhuǎn)染組;d:BC組。Fig．3 Detection of CEMP1mRNA expression by Real time PCR

2.4 基因轉(zhuǎn)染后PMO大鼠BMSCs中CEMP1蛋白表達(dá)檢測(cè)

Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示，LV－EGFP組和BC組均未見(jiàn)CEMP1蛋白表達(dá)，僅LV－CEMP1－EGFP組可檢測(cè)到CEMP1蛋白的表達(dá)(圖4)。免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示，LV－CEMP1－EGFP組細(xì)胞可見(jiàn)明顯棕色染色(圖5a)，而LV－EGFP組和BC組細(xì)胞均未見(jiàn)明顯著色(圖5b～圖5c)。

2.5 基因轉(zhuǎn)染PMO大鼠BMSCs與β－TCP復(fù)合培養(yǎng)

轉(zhuǎn)染LV－CEMP1－EGFP的 PMO大鼠 BMSCs與β－TCP復(fù)合培養(yǎng)24 h，倒置熒光顯微鏡下觀察可見(jiàn)有綠色熒光的細(xì)胞附著于β－TCP的不同層面(圖6a、圖6b)，在掃描電鏡下觀察可見(jiàn)材料表面細(xì)胞充分伸展，狀態(tài)較好(圖6c)。

圖4 轉(zhuǎn)染后PMO大鼠BMSCs中CEMP1蛋白的表達(dá)1:BC組;2:空載體 LV－EGFP轉(zhuǎn)染組;3:LV－CEMP1－EGFP轉(zhuǎn)染組。Fig．4 Western Blot of CEMP1 protein expression in PMO rat BMSCs after gene transfection

圖5 轉(zhuǎn)染后PMO大鼠BMSCs中CEMP1蛋白免疫細(xì)胞化學(xué)染色(×100)a:LV－CEMP1－EGFP轉(zhuǎn)染組;b:空載體LV－EGFP轉(zhuǎn)染組;c:BC組。Fig．5 Immunohistochemical staining of CEMP1 protein expression in PMO rat BMSCs after gene transfection(×100)

圖6 基因轉(zhuǎn)染PMO大鼠BMSCs與β－TCP復(fù)合培養(yǎng)(×100)a＆b:LV－CEMP1－EGFP 轉(zhuǎn)染細(xì)胞與 β－TCP復(fù)合培養(yǎng)倒置熒光顯微鏡觀察;c:LV－CEMP1－EGFP轉(zhuǎn)染細(xì)胞與β－TCP復(fù)合培養(yǎng)掃描電鏡觀察;d:β－TCP掃描電鏡觀察。Fig．6 Co－ culture of PMO rat BMSCs with β － TCP after gene transfection(×100)

3 討論

BMSCs具有多向分化能力，且取材相對(duì)容易，常用于組織工程技術(shù)和基因治療中，可實(shí)現(xiàn)牙周組織的修復(fù)再生［7－9］。但現(xiàn)有的研究［10］認(rèn)為 PMO 患者的BMSCs更易于向脂肪細(xì)胞分化，成脂能力更高，而細(xì)胞的成骨分化能力相應(yīng)的有所減弱。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)［11］也證實(shí)與假手術(shù)組相比，PMO大鼠BMSCs的增殖與遷移能力顯著降低，細(xì)胞的凋亡活性增加。因此，如何提升PMO狀態(tài)下BMSCs的成骨分化能力是學(xué)者們亟待解決的問(wèn)題。

CEMP1是從成牙骨質(zhì)細(xì)胞瘤中發(fā)現(xiàn)的一種牙骨質(zhì)特異性蛋白［12］，可促進(jìn)牙周膜細(xì)胞向成牙骨質(zhì)表型分化，促進(jìn)牙骨質(zhì)的再生［13－15］。轉(zhuǎn)染 CEMP1基因的人牙齦成纖維細(xì)胞的成骨及成牙骨質(zhì)相關(guān)基因表達(dá)增高，堿性磷酸酶活性增強(qiáng)，礦化結(jié)節(jié)形成能力得到顯著提升［16］。上述研究提示，CEMP1可提高細(xì)胞的成骨分化能力，有望應(yīng)用于牙周組織再生研究。因此本研究利用慢病毒載體將CEMP1轉(zhuǎn)染至PMO大鼠BMSCs，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染細(xì)胞高表達(dá)CEMP1，這為后續(xù)探討CEMP1基因修飾PMO大鼠BMSCs實(shí)現(xiàn)牙周組織再生研究創(chuàng)造了條件。

β－TCP屬于人工合成材料，可作為組織工程支架材料構(gòu)建工程化復(fù)合物，實(shí)現(xiàn)骨組織再生［17］。研究［18］發(fā)現(xiàn)將重組人骨形成蛋白－2復(fù)合于β－TCP后植入兔肌肉內(nèi)8周，即可觀察到明顯的新生骨樣組織。課題組以往研究［19］成功將犬頜骨骨膜細(xì)胞與β－TCP復(fù)合培養(yǎng)構(gòu)建組織工程復(fù)合物，實(shí)現(xiàn)犬的牙周組織再生。因此，本研究選擇多孔β－TCP作為種子細(xì)胞的支架材料。研究結(jié)果顯示CEMP1基因修飾的PMO大鼠BMSCs在β－TCP上生長(zhǎng)良好，形態(tài)正常，細(xì)胞間連接緊密，提示β－TCP對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)沒(méi)有影響，生物相容性較好。

牙周炎與OP同為中老年人的常見(jiàn)病、多發(fā)病。如何實(shí)現(xiàn)OP患者牙周組織的再生是當(dāng)前牙周臨床醫(yī)生所關(guān)注的重點(diǎn)?；蚬こ碳夹g(shù)和組織工程技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用使理想的牙周組織再生成為可能。本實(shí)驗(yàn)首次以O(shè)P狀態(tài)的BMSC為靶細(xì)胞轉(zhuǎn)染CEMP1并與β－TCP復(fù)合，構(gòu)建CEMP1修改的工程化復(fù)合物。結(jié)果顯示，PMO大鼠BMSCs轉(zhuǎn)染LV－CEMP1－EGFP后能穩(wěn)定高效表達(dá)CEMP1，且在β－TCP表面及內(nèi)部附著并生長(zhǎng)良好，分泌胞外基質(zhì)。表明在本實(shí)驗(yàn)條件下可成功構(gòu)建以 β－TCP為支架的CEMP1基因修飾的工程化復(fù)合物，但該復(fù)合物的體內(nèi)成骨能力及能否實(shí)現(xiàn)OP狀態(tài)下牙周組織再生仍需后續(xù)進(jìn)一步的研究探討。