李朝陽(yáng)，肖鈞文，左深君，曹子藤，李垣鑫，田向榮

（1.湖南吉首大學(xué)生物資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，湖南 吉首 416000；2.植物資源保護(hù)與利用湖南省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 吉首416000）

鎘是“五毒”重金屬元素（Cd、Hg、Pb、Cr、As）之首，屬于環(huán)境優(yōu)先污染物，在水中的溶解度很大，遷移性也很強(qiáng)。受工礦業(yè)生產(chǎn)排污和農(nóng)耕施肥等人類(lèi)活動(dòng)影響，Cd已經(jīng)成為我國(guó)農(nóng)田土壤污染最廣的重金屬元素[1]，被列為當(dāng)前農(nóng)業(yè)面源污染防治的重要對(duì)象之一。Cd易被植物吸收，過(guò)量的Cd在植物體內(nèi)積累會(huì)影響植物正常的生長(zhǎng)發(fā)育，主要表現(xiàn)在對(duì)質(zhì)膜的損傷以及植物細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的影響[2-3]。植物一方面可通過(guò)不同器官和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)對(duì)Cd進(jìn)行區(qū)隔化來(lái)減輕其對(duì)自身的毒害[4]，如細(xì)胞壁對(duì)Cd的固定作用以及胞內(nèi)的液泡區(qū)室化機(jī)制等[5-6]；另一方面則是通過(guò)抗氧化體系的調(diào)節(jié)作用來(lái)減輕活性氧暴發(fā)對(duì)植物的傷害[7]。

苔蘚植物有許多能適應(yīng)逆境的生理特征，如只由單層或者幾層細(xì)胞構(gòu)成、比表面積大、細(xì)胞膜上有很多陽(yáng)離子交換位點(diǎn)、能從葉片表面直接吸收營(yíng)養(yǎng)物和其他金屬離子等[8]，因此常被用來(lái)監(jiān)測(cè)環(huán)境中的污染物及污染程度[9]。研究表明細(xì)胞壁是苔蘚植物累積重金屬的主要場(chǎng)所[10]，抗氧化體系在蘚類(lèi)植物抵抗Cd毒過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用[11-12]，然而Cd在蘚體的亞細(xì)胞分布與抗氧化體系間的內(nèi)在聯(lián)系卻較少有人關(guān)注。濕地匍燈蘚（Plagiomniumacutum）是一種寬幅生態(tài)植物，我們前期研究發(fā)現(xiàn)它對(duì)Cd和Pb都有較強(qiáng)的吸收能力，并在2 h內(nèi)就能對(duì)重金屬脅迫作出反應(yīng)，與青蘚和尖葉擬船葉蘚比較，低Cd（1 mg·L-1）脅迫下該蘚類(lèi)細(xì)胞表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐性，在遭受Cd、Pb復(fù)合脅迫時(shí)，濕地匍燈蘚采取了優(yōu)先選擇吸收Pb的避重就輕吸收策略，因此濕地匍燈蘚是研究重金屬脅迫的良好材料[13-15]?；诖耍疚睦^續(xù)以濕地匍燈蘚為試驗(yàn)材料，研究其在不同濃度的Cd脅迫下葉綠體的變化、Cd在亞細(xì)胞中的分布及活性氧代謝特征，從微觀水平探討濕地匍燈蘚對(duì)Cd脅迫的響應(yīng)機(jī)制，以期更深入地探索蘚類(lèi)植物防御重金屬傷害和耐重金屬脅迫的機(jī)理，為重金屬污染治理和修復(fù)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

濕地匍燈蘚采于湖南吉首大學(xué)校園綠化區(qū)（28°17'27″N，109°43'12″E）。材料采回后立即用超純水清洗干凈，將表面水分用濾紙吸干后，進(jìn)行Cd脅迫處理。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)根據(jù)課題組對(duì)花垣礦區(qū)Cd的本底值調(diào)查結(jié)果（0.3～9 mg·kg-1）和文獻(xiàn)[16]設(shè)置Cd濃度分別為0、1、5、10 mg·L-1共4個(gè)梯度，采用CdCl2·2.5H2O（分析純）進(jìn)行處理，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。試驗(yàn)采用浸沒(méi)培養(yǎng)方法進(jìn)行，具體過(guò)程為：將鮮質(zhì)量為2.0 g的蘚體放入150 mL上述Cd濃度處理液中，常溫下培養(yǎng)7 d后，將材料取出，先用純水將其洗凈，再用超純水沖洗2～3遍后，分別測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo)。

1.3 葉綠體觀察

剪取枝頂相同部位的葉片，壓制成水封片后采用光學(xué)顯微鏡（Leica DM2000）于高倍鏡下觀察葉細(xì)胞形態(tài)變化（目鏡10×，物鏡100×），選擇葉片同一個(gè)部位進(jìn)行觀察。

1.4 亞細(xì)胞組分分離

亞細(xì)胞組分分離參照Weigel[17]及Rathore等[18]的方法并進(jìn)行改進(jìn)。材料加入預(yù)冷后的勻漿液少許，冰浴研磨勻漿，勻漿液全部轉(zhuǎn)入10 mL的離心管中，并用勻漿液補(bǔ)足體積至10 mL后離心（2200 r·min-1，30 s），下部沉淀以及底層碎片即為細(xì)胞壁組分F1（包括胞間隙），將上清液在5500 r·min-1的條件下離心45 min，沉在底層的碎片為細(xì)胞器組分F2，其上層清液即胞質(zhì)組分F3（包括液泡和細(xì)胞質(zhì)）。

1.5 測(cè)定方法

超氧陰離子自由基（O-2·）產(chǎn)生速率參考Elstner等[19]方法測(cè)定；H2O2含量采用 Patterson等[20]方法測(cè)定；蛋白質(zhì)含量測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法[17]；谷胱甘肽還原酶（GR）和抗壞血酸過(guò)氧化物酶（APX）活性測(cè)定參考黃愛(ài)纓等[21]方法進(jìn)行；參考文獻(xiàn)[22]對(duì)抗壞血酸含量進(jìn)行測(cè)定，脫氫型抗壞血酸（DHA）可由二硫蘇糖醇還原成還原型抗壞血酸（ASA），測(cè)得總抗壞血酸（ASC），然后從中減去ASA得到DHA的含量；各亞細(xì)胞組分的Cd含量參考文獻(xiàn)[23]方法進(jìn)行。

1.6 數(shù)據(jù)分析與作圖

采用SPSS17.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和差異顯著性分析，用WPS作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cd脅迫對(duì)濕地匍燈蘚細(xì)胞的損傷

由圖1可看出，對(duì)照組細(xì)胞大小均勻，細(xì)胞壁邊界清晰，葉綠體鮮綠色，均勻分布于細(xì)胞內(nèi)，胞內(nèi)無(wú)空隙（圖1a）。當(dāng)遭受到1 mg·L-1Cd脅迫時(shí)，濕地匍燈蘚細(xì)胞出現(xiàn)中毒癥狀，細(xì)胞大小不一，形狀變得不規(guī)則，細(xì)胞壁木質(zhì)化明顯，細(xì)胞內(nèi)形成較大的空泡，葉綠體縮小成球狀并被擠到細(xì)胞的邊緣（圖1b）。當(dāng)Cd濃度增加到5 mg·L-1時(shí)，細(xì)胞出現(xiàn)劇烈腫脹，細(xì)胞間隙變大，葉綠體被嚴(yán)重?cái)D壓變形，部分細(xì)胞的葉綠體出現(xiàn)解體（圖1c）。當(dāng)Cd濃度增加到10 mg·L-1時(shí)，細(xì)胞完全變形，細(xì)胞壁木質(zhì)化程度更加嚴(yán)重，葉綠體進(jìn)一步縮小成顆粒并聚集成團(tuán)，細(xì)胞空泡化嚴(yán)重（圖1d），表明植物體已經(jīng)受到了較嚴(yán)重的傷害。

圖1 Cd對(duì)濕地匍燈蘚細(xì)胞的損傷（×1000）Figure 1 The damage of cells in Plagiomniumacutum under Cd stress

2.2 Cd在濕地匍燈蘚亞細(xì)胞組分中的分布

為了揭示濕地匍燈蘚細(xì)胞損傷的原因，分析了Cd在蘚體內(nèi)的分布情況。由表1可知，隨Cd脅迫濃度的增加，濕地匍燈蘚各亞細(xì)胞組分中的Cd含量也顯著增加，與環(huán)境Cd含量存在顯著的濃度效應(yīng)關(guān)系。大部分Cd都集中分布在濕地匍燈蘚的細(xì)胞壁（F1）中，占Cd吸收總量的58.4%～76.5%；細(xì)胞器（F2）中含量次之，分布比例為19.2%～27.3%，細(xì)胞質(zhì)（F3）中占比最少，僅為4.3%～16.5%。隨著Cd脅迫濃度增加，F(xiàn)2和F3中的Cd含量逐漸增加，F(xiàn)1中的Cd分配比例減少，由76.5%降低至58.4%，F(xiàn)2和F3中的Cd分配比例則顯著上升，F(xiàn)2中的分配比例由19.2%增加到27.3%，F(xiàn)3中的分配比例則從4.3%急劇升高到16.5%，盡管10 mg·L-1Cd處理時(shí)略有回落，仍高達(dá)14.3%，表明濕地匍燈蘚細(xì)胞壁是Cd的主要吸收?qǐng)鏊S著Cd濃度加大，細(xì)胞壁阻留Cd的能力達(dá)到飽和，Cd進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，并主要停留于細(xì)胞器內(nèi)。

2.3 Cd脅迫對(duì)濕地匍燈蘚O-2·和H2O2含量的影響

為了進(jìn)一步闡明細(xì)胞受損傷的原因，對(duì)Cd脅迫下蘚體內(nèi)活性氧自由基（O-2·和H2O2）的累積情況進(jìn)行了分析，結(jié)果如圖2所示。總體而言，蘚體內(nèi)的O-2·累積量隨Cd濃度的增加呈現(xiàn)先降后升的趨勢(shì)，當(dāng)Cd濃度低于5 mg·L-1時(shí)，蘚體內(nèi)的O-2·累積量出現(xiàn)隨Cd濃度增加而降低的現(xiàn)象，并在5 mg·L-1時(shí)達(dá)到最低值，比對(duì)照組減少了15.8%，然而當(dāng)Cd濃度增加到10mg·L-1時(shí)，蘚體內(nèi)的O-2·累積量出現(xiàn)了激增，比對(duì)照組增加了7.9%。

表1 不同濃度Cd處理濕地匍燈蘚亞細(xì)胞組分Cd含量（μg·L-1）Table 1 Contents of Cd in subcellular fractions of Plagiomnium acutum under Cd treatments（mean±SE，n=3）（μg·L-1）

由圖2可以看出，H2O2含量隨Cd脅迫濃度增加而持續(xù)增大，盡管在1 mg·L-1時(shí)H2O2累積量低于對(duì)照，但當(dāng)Cd濃度由5 mg·L-1增加到10 mg·L-1時(shí)，蘚體H2O2含量分別比對(duì)照增加了3.4%和13.7%。

2.4 Cd脅迫對(duì)濕地匍燈蘚APX和GR酶活性的影響

圖2 Cd脅迫對(duì)濕地匍燈蘚O-2·和H2O2含量的影響Figure 2 Effects of Cd stress on O-2·and H2O2 contents in Plagiomniumacutum

APX和GR均為蘚體內(nèi)重要的氧化還原酶類(lèi)，APX能以AsA作為電子供體使H2O2轉(zhuǎn)化為H2O，而GR則是通過(guò)參與AsA-GSH循環(huán)在清除機(jī)體產(chǎn)生的活性氧中發(fā)揮作用。圖3結(jié)果表明，Cd脅迫使蘚體內(nèi)兩種酶活性均顯著增強(qiáng)，不同的是，APX活性隨Cd脅迫濃度增加而逐漸下降，而GR活性則表現(xiàn)為逐漸增強(qiáng)。當(dāng)Cd濃度從 1 mg·L-1增加到 10 mg·L-1時(shí)，APX活性分別比對(duì)照增加了947%、810%和712%，GR活性分別比對(duì)照增加了430%、765%和1124%。APX活性隨Cd脅迫濃度增加逐漸降低表明其保護(hù)作用是有限的，當(dāng)環(huán)境Cd超過(guò)一定濃度后其保護(hù)作用逐漸減弱。GR酶活性隨Cd濃度增加而逐漸增加表明其在濕地匍燈蘚抵抗Cd毒過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。

2.5 Cd脅迫對(duì)濕地匍燈蘚抗壞血酸含量的影響

為了進(jìn)一步考察濕地匍燈蘚對(duì)活性氧清除機(jī)制，對(duì)其抗壞血酸含量變化進(jìn)行了分析，結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可以看出，濕地匍燈蘚體內(nèi)ASC和ASA含量均隨Cd脅迫濃度增加顯著升高，呈現(xiàn)出顯著的劑量效應(yīng)關(guān)系。與對(duì)照相比，隨Cd脅迫濃度增加，ASC和ASA含量分別增加了37.5%和42.7%、46.9%和72.7%、71.3%和89.2%，其中ASA增長(zhǎng)的幅度顯著高于ASC，同時(shí)ASA/DHA比值持續(xù)增加，最高達(dá)到了1.3，表明Cd脅迫促進(jìn)了濕地匍燈蘚ASA的生成，ASA在蘚體解除Cd毒害中可能發(fā)揮了重要作用。

圖3 Cd脅迫對(duì)濕地匍燈蘚APX和GR活性的影響Figure 3 Effects of Cd stress on APX and GRactivities in Plagiomniumacutum

2.6 Cd脅迫下各指標(biāo)間的相關(guān)性分析

為了研究濕地匍燈蘚體內(nèi)活性氧產(chǎn)生、抗氧化體系與Cd亞細(xì)胞分布間的聯(lián)系，對(duì)所測(cè)定的指標(biāo)進(jìn)行了Pearson相關(guān)性分析，結(jié)果如表2所示。在55對(duì)相關(guān)性分析中，顯著性相關(guān)4對(duì)（P＜0.05），均為正相關(guān)；極顯著性相關(guān)30對(duì)（P＜0.01），其中正相關(guān)27對(duì)，負(fù)相關(guān)3對(duì)。表明所分析的各指標(biāo)間相互聯(lián)系較為緊密。O-·的產(chǎn)生與所有指標(biāo)的相關(guān)性都不顯著，但H2O2含2量卻與各亞細(xì)胞組分Cd含量及GR活性極顯著正相關(guān)（P＜0.01），與 ASC和 ASA 含量顯著正相關(guān)（P＜0.05）。APX活性與GR活性、ASC和ASA含量極顯著正相關(guān)（P＜0.01），與DHA含量顯著正相關(guān)（P＜0.05），與各亞細(xì)胞組分Cd含量極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01）。GR活性除了與APX活性和H2O2含量極顯著正相關(guān)外（P＜0.01），還與ASC、ASA和DHA含量以及各亞細(xì)胞組分Cd含量均極顯著正相關(guān)（P＜0.01）。

3 討論

葉綠體對(duì)環(huán)境變化反應(yīng)很靈敏，宇克莉等[24]采用透射電鏡觀察Cd脅迫下的玉米細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn)，10-5mol·L-1Cd2+處理10 d后葉綠體數(shù)量顯著減少，且葉綠體膨脹呈圓球形，基粒類(lèi)囊體排列紊亂；魏海英等[10]采用100 mg·L-1Cd處理大羽蘚7 d后觀察到葉綠體雙層膜破裂，類(lèi)囊體片層膨脹減少，僅使線(xiàn)粒體外膜有破損和嵴突膨脹。本研究同樣發(fā)現(xiàn)隨Cd脅迫濃度增加，葉綠體受傷害程度也顯著增加，具體表現(xiàn)為葉綠體急劇的皺縮，與上述結(jié)果相一致。

圖4 Cd脅迫對(duì)濕地匍燈蘚抗壞血酸含量的影響Figure 4 Effects of Cd stress on ascorbic acid pool in Plagiomniumacutum

表2 Cd脅迫下各指標(biāo)間的相關(guān)性分析Table 2 The correlation analysis between all indicators under Cd stress

細(xì)胞壁是重金屬離子跨膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)的第一道屏障，是植物響應(yīng)重金屬脅迫的功能信號(hào)分子和代謝的場(chǎng)所[5，25]。耐Cd植物的一個(gè)顯著特征就是細(xì)胞壁對(duì)Cd的過(guò)量累積，同時(shí)植物還可通過(guò)調(diào)整Cd在細(xì)胞各組分中的分布來(lái)適應(yīng)Cd脅迫[26]。如與Cd敏感型植物相比，耐性植物的Cd多數(shù)被細(xì)胞壁所固定[27]。本研究發(fā)現(xiàn)，Cd在濕地匍燈蘚體內(nèi)的分布趨勢(shì)為細(xì)胞壁＞細(xì)胞器＞細(xì)胞質(zhì)（表2），Cd主要累積在蘚體的細(xì)胞壁上，但隨著環(huán)境Cd濃度增加，細(xì)胞器內(nèi)Cd占比增加，從19.2%升高至27.3%，與楊衛(wèi)東等[28]的結(jié)果相一致。有研究認(rèn)為葉綠體是最易累積Cd的細(xì)胞器，如藻類(lèi)植物的葉綠體內(nèi)Cd含量高達(dá)總量的40%[29]。本研究中，葉綠體損傷隨各亞細(xì)胞組分中的Cd含量增加而增加，說(shuō)明蘚類(lèi)植物的葉綠體也很可能是累積Cd的主要場(chǎng)所之一，是Cd毒性的直接作用位點(diǎn)。

Cd是非氧化還原態(tài)金屬，低濃度下進(jìn)入到細(xì)胞后可以被體內(nèi)非酶物質(zhì)如ASA或GSH螯合，葉綠體是細(xì)胞活性氧產(chǎn)生的主要部位之一[30]，然而只有在葉綠體嚴(yán)重受損后，才會(huì)激活膜中的NADPH氧化酶，促進(jìn)O-2·和H2O2的形成[31-32]。本研究發(fā)現(xiàn)，蘚體內(nèi)的O-2·含量隨Cd濃度增加呈現(xiàn)先降后升趨勢(shì)，H2O2含量則隨Cd濃度增加而顯著增加（圖2），該結(jié)果與龐杰等[33]的結(jié)果相一致。相關(guān)性分析表明，O-2·的產(chǎn)生與所有指標(biāo)的相關(guān)性都不顯著，但H2O2含量卻與各亞細(xì)胞組分Cd含量及GR活性極顯著正相關(guān)（P＜0.01）。孫光聞等[34]認(rèn)為這種現(xiàn)象的出現(xiàn)是過(guò)多的O-2·不能被及時(shí)清除而質(zhì)子化成為毒性更強(qiáng)的OH自由基所致。本文推測(cè)可能是低濃度下Cd刺激細(xì)胞器內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)的啟動(dòng)，將體內(nèi)原有的活性氧清除，導(dǎo)致其低于對(duì)照，本研究中顯著高于對(duì)照的APX和GR活性也可以在一定程度上支持這個(gè)假設(shè)，表明低濃度Cd脅迫下濕地匍燈蘚的活性氧代謝與種子植物相比有其特殊性，可能對(duì)低濃度Cd有較強(qiáng)的耐受能力。

Smeets等[35]認(rèn)為抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)是Cd脅迫下刺激H2O2轉(zhuǎn)化的主要途徑。APX和GR是該循環(huán)中重要的氧化還原酶類(lèi)，APX主要存在于質(zhì)體，尤其是葉綠體中[36]，該酶催化了該循環(huán)的第一步反應(yīng)，同時(shí)將H2O2轉(zhuǎn)化成H2O。本研究中，APX活性與兩種活性氧含量不相關(guān)，卻與ASC和ASA極顯著正相關(guān)（P＜0.01），與DHA顯著正相關(guān)（P＜0.05），說(shuō)明葉綠體受損傷后Cd進(jìn)入葉綠體內(nèi)，使受損部分的APX變性失活。GR為該循環(huán)的限速酶，主要位于線(xiàn)粒體內(nèi)[37]，以NADPH為電子供體促使GSSG還原成GSH。本研究中GR活性與O-2·含量不相關(guān)，卻與H2O2含量以及各亞細(xì)胞組分Cd含量均極顯著正相關(guān)（P＜0.01），也與ASC、ASA和DHA含量極顯著正相關(guān)（P＜0.01），并與APX酶活性極顯著正相關(guān)（P＜0.01），說(shuō)明亞細(xì)胞組分中Cd含量和H2O2含量增加以及葉綠體受損是GR活性增加的主要原因，兩種酶具有協(xié)同效應(yīng)。

ASA是體內(nèi)清除活性氧的重要物質(zhì)之一，H2O2可以誘導(dǎo)ASA含量增加[33]，ASC、ASA和DHA均與3種亞細(xì)胞組分中的Cd含量極顯著正相關(guān)（P＜0.01），其中ASC和ASA還與H2O2含量顯著正相關(guān)（P＜0.05），這與龐杰等[33]結(jié)果相一致。該結(jié)果也從側(cè)面進(jìn)一步證明了Cd脅迫產(chǎn)生的H2O2主要依賴(lài)抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)體系（Halliwell-Asada途徑）完成，這與吳旭紅等[38]的研究結(jié)果相一致。暗示Halliwell-Asada途徑可能是濕地匍燈蘚體內(nèi)主要的活性氧清除機(jī)制。

4 結(jié)論

（1）濕地匍燈蘚的細(xì)胞壁是累積重金屬Cd的主要場(chǎng)所，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的Cd則主要累積在細(xì)胞器里，尤其可能累積在葉綠體，致使以葉綠體為主要反應(yīng)場(chǎng)所的APX變性失活，引起體內(nèi)活性氧代謝紊亂。

（2）低濃度Cd脅迫下濕地匍燈蘚的活性氧代謝不同于種子植物，Halliwell-Asada途徑可能是濕地匍燈蘚體內(nèi)主要的活性氧清除機(jī)制，APX和GR在此過(guò)程中具有協(xié)同效應(yīng)。

（3）濕地匍燈蘚對(duì)低濃度Cd有較強(qiáng)的耐受能力。