王 滔，班龍科，張 瑾，卞志強(qiáng)，潘法康

（安徽建筑大學(xué)環(huán)境與能源工程學(xué)院，安徽省水污染控制與廢水資源化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合肥230601）

農(nóng)藥在糧食生產(chǎn)和農(nóng)業(yè)發(fā)展中使用量很大，我國(guó)以占全球7%的耕地面積養(yǎng)活了占全球22%的人口，其中農(nóng)藥發(fā)揮著關(guān)鍵作用[1]。施用的農(nóng)藥中只有10%能得到利用，而其余部分則會(huì)通過(guò)下滲和雨水沖刷等方式殘留在環(huán)境中。殘留農(nóng)藥可能通過(guò)食物鏈的傳遞作用進(jìn)入人體，對(duì)人類健康構(gòu)成威脅[2-3]。三嗪類農(nóng)藥主要用于防除禾本科雜草和闊葉雜草，是國(guó)內(nèi)外應(yīng)用廣泛的高效除草劑之一，且該類藥物具有水溶性強(qiáng)、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定的特點(diǎn)，因而會(huì)對(duì)環(huán)境產(chǎn)生更持久的不利影響[4-7]。有研究表明，三嗪類農(nóng)藥是黃、淮海及松遼流域等不同水域中的主要檢出農(nóng)藥[5]。

傳統(tǒng)農(nóng)殘檢測(cè)通常是按照標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)目逐個(gè)檢測(cè)，這種方法可能會(huì)低估農(nóng)藥殘留的風(fēng)險(xiǎn)[8-9]。由于環(huán)境中的農(nóng)藥會(huì)以各種形式和濃度共存，形成復(fù)雜的混合物并產(chǎn)生聯(lián)合毒性，從而會(huì)對(duì)生物產(chǎn)生更大的風(fēng)險(xiǎn)，因此開展農(nóng)藥聯(lián)合毒性作用分析的研究就顯得尤為重要[10-12]。除濃度加和模型以外，等效線分析法也是比較經(jīng)典的聯(lián)合毒性作用評(píng)估方法，可全面考察某指定效應(yīng)下混合物的毒性相互作用情況[13-14]。傳統(tǒng)等效線圖法適用于二元混合物聯(lián)合毒性評(píng)估，有學(xué)者在此基礎(chǔ)上還構(gòu)建了適用于三元混合物的三維等效圖法，并能直觀地反映三元混合物聯(lián)合毒性特征[15]。

因此，本研究選擇在多種農(nóng)作物中均被檢出過(guò)的3種三嗪類農(nóng)藥[4，16]：苯嗪草酮（Metamitron，Met）、草凈津（Bladex，Bla）、特丁通（Terbumeton，Ter）為混合物組分，以蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa，C.pyrenoidosa）為實(shí)驗(yàn)生物，分別采用直接均分射線法（Equipartition ray，Equ-Ray）和均勻設(shè)計(jì)射線法（Uniform design ray，UD-Ray）設(shè)計(jì)具有代表性的二元及三元混合物體系，應(yīng)用微板毒性分析法（Microplate toxicity analysis，MTA）考察三嗪類農(nóng)藥及其混合物體系的毒性，通過(guò)濃度加和（Concentration addition，CA）模型分析混合物毒性相互作用，并建立二維和三維等效圖進(jìn)一步評(píng)估混合物聯(lián)合毒性，通過(guò)葉綠素a含量的測(cè)定考察三嗪類農(nóng)藥對(duì)蛋白核小球藻的生理毒性作用，以期為科學(xué)評(píng)價(jià)三嗪類農(nóng)藥的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為三嗪類農(nóng)藥在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的科學(xué)應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 藻種、儀器及藥品

1.1.1 藻種與儀器

實(shí)驗(yàn)藻種蛋白核小球藻（C.pyrenoidosa）購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)淡水藻種庫(kù)（FACHB），藻種的培養(yǎng)與保存方法參見文獻(xiàn)[17]。

主要實(shí)驗(yàn)儀器：Synery-2酶標(biāo)儀（美國(guó)伯騰儀器有限公司）、MGC-250光照培養(yǎng)箱（上海一恒科技有限公司）、YXQ-LS-100A立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司）、721型分光光度計(jì)（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）。

1.1.2 藥品

農(nóng)藥：苯嗪草酮（Met）、草凈津（Bla）及特丁通（Ter）均購(gòu)自上海原葉生物科技有限公司。表1列出了3種農(nóng)藥的基本理化性質(zhì)，圖1為3種農(nóng)藥的化學(xué)結(jié)構(gòu)。3種藥物濃度均在溶解度范圍內(nèi)，使用超純水配制藥物儲(chǔ)備液，并于4℃冰箱儲(chǔ)存、備用。

1.2 混合物設(shè)計(jì)

在化學(xué)混合物中，各組分毒性大小及組分間毒性相互作用決定了混合物的整體毒性，且毒性大小及組分間毒性相互作用與暴露時(shí)間和濃度有關(guān)。為系統(tǒng)考察混合物的毒性作用規(guī)律，分別采用Equ-Ray和UD-Ray設(shè)計(jì)農(nóng)藥二元及三元混合物體系[18-20]，表2為各混合物射線的組分及其濃度比Pi值。

表1 3種三嗪類農(nóng)藥的理化性質(zhì)Table 1 The physiochemical propertiesof three triazine pesticides

圖1 3種三嗪類農(nóng)藥的化學(xué)結(jié)構(gòu)Figure 1 The chemical structures of three triazine pesticides

1.3 時(shí)間毒性測(cè)定與計(jì)算

應(yīng)用基于蛋白核小球藻的微板毒性分析法，測(cè)定農(nóng)藥及其混合物對(duì)C.pyrenoidosa的時(shí)間毒性，采用透明的96孔微板作為實(shí)驗(yàn)載體[21-23]。微板實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法：在微板最外側(cè)36個(gè)孔中，均加入200μL超純水，以減少邊緣效應(yīng)的影響；在第3列和第8列共12個(gè)孔中，從上至下依次加入按稀釋因子設(shè)計(jì)的不同濃度藥物溶液100μL；第4列和第5列為第3列的平行實(shí)驗(yàn)；第10列和11列為第8列的平行實(shí)驗(yàn)；在第2、6、7、11列共24個(gè)孔中均加入100μL超純水作為空白對(duì)照組；最后在處理組和空白組共60個(gè)孔中均加入吸光度為0.20～0.30的100μL藻液，使每個(gè)微孔中總體積為200μL，加透明蓋以減少溶劑揮發(fā)。重復(fù)以上操作 3次[17]。

將加入藥物和C.pyrenoidosa的微板置于（25±1）℃、5000 lx的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別在12、24、48、72 h和96 h后取出，應(yīng)用酶標(biāo)儀測(cè)定690 nm波長(zhǎng)下的吸光度，并計(jì)算各暴露時(shí)間下藥物對(duì)C.pyrenoidosa的生長(zhǎng)抑制率。

蛋白核小球藻抑制率的計(jì)算公式如下：

式中：I為抑制率；OD0為對(duì)照組的吸光值；OD為實(shí)驗(yàn)組的吸光值。

1.4 時(shí)間毒性數(shù)據(jù)擬合

為反映C.pyrenoidosa在不同暴露時(shí)間、不同藥物濃度下的生長(zhǎng)變化規(guī)律，采用時(shí)間-濃度-效應(yīng)三維曲線的方法。對(duì)于不同暴露時(shí)間的濃度-效應(yīng)數(shù)據(jù)，采用Logit函數(shù)進(jìn)行擬合，并根據(jù)擬合相關(guān)系數(shù)（Correlation coefficient，R2）與 均 方 根 誤 差（Root mean square error，RMSE）判斷擬合效果，R2越接近 1 且RMSE越接近0，說(shuō)明擬合效果越好[21]。毒性實(shí)驗(yàn)中的實(shí)驗(yàn)誤差無(wú)法避免，因此在描述擬合函數(shù)不確定度時(shí)，利用觀測(cè)置信區(qū)間（Observed confident interval，OCI）來(lái)表征毒性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確程度[24]。

非線性Logit函數(shù)公式如下：

式中：E為毒性效應(yīng)即生長(zhǎng)抑制率；c為藥物的濃度，mol·L-1；α和β分別為位置和斜率參數(shù)。

1.5 混合物毒性相互作用分析

1.5.1 濃度加和模型

混合物毒性相互作用的識(shí)別具有重要意義，目前國(guó)內(nèi)外常采用CA作為加和參考模型，且該模型可用于評(píng)估多數(shù)農(nóng)藥的混合物毒性[25-27]。當(dāng)CA預(yù)測(cè)曲線位于OCI內(nèi)，毒性相互作用表現(xiàn)為加和作用；當(dāng)位于OCI以下時(shí)，則為協(xié)同作用；當(dāng)位于OCI以上時(shí)，則為拮抗作用[28]。

CA模型數(shù)學(xué)表達(dá)式如下：

表2 混合物體系的組分及其濃度比Table 2 The components and their concentration ratios of three binary and one ternary mixture systems

式中：Ci表示混合物產(chǎn)生x%效應(yīng)時(shí)第i組分的濃度，mol·L-1；ECx，i表示混合物中第 i個(gè)組分單獨(dú)作用時(shí)產(chǎn)生x%效應(yīng)時(shí)的濃度，mol·L-1。

1.5.2 二維等效圖

對(duì)于二元混合物系統(tǒng)，利用二維等效線圖法可全面考察某指定效應(yīng)下不同混合比射線的毒性相互作用。利用濃度-效應(yīng)曲線（Concentration response curve，CRC）函數(shù)計(jì)算某一等效應(yīng)下混合物濃度，根據(jù)擬合曲線的95%OCI確定該效應(yīng)的置信上下限濃度，以兩組分的毒性單位（Toxic unit，TU）為坐標(biāo)繪制二維濃度圖，等效點(diǎn)及其置信區(qū)間形成等效線段，基于CA模型繪制加和等效線。通過(guò)等效線段與加和等效線的位置關(guān)系可判斷毒性相互作用的類型，且等效線段偏離程度越大，毒性相互作用越明顯。若等效線段位于加和等效線下方，表示二元混合物組分間毒性相互作用為協(xié)同作用；若位于加和等效線上方，則為拮抗作用；若與加和等效線相交，則呈現(xiàn)為加和作用。

1.5.3 三維等效圖

對(duì)于三元混合物系統(tǒng)，利用三維等效線圖法可考察任意效應(yīng)水平下組分間的毒性相互作用，其構(gòu)建方法參見文獻(xiàn)[15]。三維等效圖中三角平面為濃度加和等效面，各條線段對(duì)應(yīng)于不同混合物射線的半數(shù)效應(yīng)濃度及置信區(qū)間。如果線段位于三角平面右上方，說(shuō)明混合物毒性相互作用為拮抗作用；若線段與三角平面相交，則為加和作用；若線段位于三角平面左下方，則為協(xié)同作用[27]。

1.6 C.pyrenoidosa中葉綠素a含量的測(cè)定

光合作用是植物體內(nèi)最重要的生命活動(dòng)，葉綠素也是各種浮游藻類中廣泛存在的色素，因而其含量能客觀反映植物的生長(zhǎng)情況和光合作用水平[29]。對(duì)于C.pyrenoidosa，其體內(nèi)的葉綠素a含量變化比葉綠素b對(duì)污染物的響應(yīng)更為敏感[30]，因此本文選擇葉綠素a含量為指標(biāo)，考察不同藥物作用下葉綠素a含量隨暴露時(shí)間和暴露濃度的變化情況。

葉綠素a含量的測(cè)定方法：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的蛋白核小球藻藻液10 mL，用0.45μm的混合纖維素膜進(jìn)行過(guò)濾，將帶有藻細(xì)胞的濾膜置于冰箱冷凍過(guò)夜，取出后迅速加入體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇溶液萃取2 min，將萃取液超聲破碎15 min，于暗處?kù)o置4 h后以5000 r·min-1冷凍離心5 min，取上清液置于比色皿中，分別在665 nm和649 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值[30-31]。

葉綠素a含量計(jì)算公式如下：

式中：Pchla為葉綠素a含量，mg·L-1；OD665為665 nm波長(zhǎng)下的吸光值；OD649為649 nm波長(zhǎng)下的吸光值；V1為定容體積，mL；V2為樣品的體積，mL；L為比色皿光程長(zhǎng)度，cm。

每組藥物在10%、30%、50%及70%4個(gè)效應(yīng)濃度下進(jìn)行毒性實(shí)驗(yàn)，并以加入超純水的藻液作為空白對(duì)照，分別在暴露時(shí)間48 h和96 h測(cè)定葉綠素a的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 3種農(nóng)藥對(duì)C.pyrenoidosa的毒性效應(yīng)

通過(guò)MTA法測(cè)得3種三嗪類農(nóng)藥對(duì)C.pyrenoidosa的濃度-效應(yīng)數(shù)據(jù)，利用Logit函數(shù)進(jìn)行最小二乘擬合，其擬合參數(shù)α、β值以及統(tǒng)計(jì)結(jié)果（R2和RMSE）見表3，擬合曲線（CRCs）以及實(shí)驗(yàn)觀測(cè)數(shù)據(jù)見圖2。

從表3可看出，Logit函數(shù)能較好擬合3種農(nóng)藥對(duì)C.pyrenoidosa在不同暴露時(shí)間的濃度-效應(yīng)數(shù)據(jù)，R2除在暴露時(shí)間12 h外均大于0.97，RMSE均小于0.1。在暴露時(shí)間12 h時(shí)的擬合效果稍差，可能是由于C.pyrenoidosa處于生長(zhǎng)適應(yīng)階段，也可能需要其他更適合的函數(shù)進(jìn)行擬合。

表3 3種三嗪類農(nóng)藥的Logit函數(shù)擬合參數(shù)、統(tǒng)計(jì)量、半數(shù)效應(yīng)濃度（EC50）及其負(fù)對(duì)數(shù)（p EC50）Table 3 The Logit function fitting parameters and statistics，mean effect concentration and its negative logarithmfor the three triazine pesticides

不同農(nóng)藥對(duì)C.pyrenoidosa的毒性大小不同，且隨暴露時(shí)間延長(zhǎng)，毒性大小順序也會(huì)發(fā)生改變。以EC50負(fù)對(duì)數(shù)值p EC50為毒性大小指標(biāo)，暴露時(shí)間12 h時(shí)，毒性大小順序?yàn)镸et＞Bla＞Ter；暴露時(shí)間24 h時(shí)，毒性大小順序?yàn)門er＞Bla＞Met；暴露時(shí)間為48、72、96 h時(shí)，毒性大小順序保持不變，為Bla＞Ter＞Met。3種農(nóng)藥在48 h及以后的EC50值變化不大，說(shuō)明3種農(nóng)藥具有明顯的急性毒性，即生物在接觸藥物后，農(nóng)藥產(chǎn)生毒性較快，且迅速達(dá)到最大，此后隨暴露時(shí)間延長(zhǎng)，而不再有明顯的增加。

3種農(nóng)藥對(duì)C.pyrenoidosa的時(shí)間-濃度-效應(yīng)曲線如圖2所示。從圖中可以看出，C.pyrenoidosa在3種農(nóng)藥單獨(dú)作用下，抑制率隨時(shí)間和濃度的變化規(guī)律稍有差異。在低濃度Met的各個(gè)暴露時(shí)間，農(nóng)藥對(duì)C.pyrenoidosa的抑制率都接近為0，而在中濃度和高濃度區(qū)域的抑制率則明顯增加，尤其在暴露72 h和96 h時(shí)，高濃度區(qū)域的抑制率接近100%。農(nóng)藥Bla和Ter單獨(dú)作用于C.pyrenoidosa時(shí)的抑制率變化規(guī)律相似，即在低濃度農(nóng)藥暴露下，農(nóng)藥對(duì)C.pyrenoidosa的抑制率隨暴露時(shí)間延長(zhǎng)先增加后降低，在中濃度和高濃度區(qū)域的抑制率，則隨暴露時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸增加。

2.2 農(nóng)藥二元混合物對(duì)蛋白核小球藻的毒性相互作用

采用Equ-Ray法設(shè)計(jì)3組農(nóng)藥二元混合物體系，基于CA模型對(duì)不同暴露時(shí)間的混合毒性進(jìn)行預(yù)測(cè)。在混合物暴露12 h和24 h時(shí)，C.pyrenoidosa處于生長(zhǎng)適應(yīng)階段，生物代謝反應(yīng)緩慢，無(wú)法用CA模型準(zhǔn)確判斷毒性相互作用。圖3為3組二元混合物體系暴露48、72 h和96 h時(shí)的實(shí)驗(yàn)觀測(cè)值及其95%OCI、擬合曲線及CA預(yù)測(cè)曲線。

從圖3可看出，Met-Bla二元混合物體系中，Met所占濃度比例從R1射線到R5射線逐漸增加。在同一暴露時(shí)間下，隨Met濃度比增加，CA預(yù)測(cè)曲線與濃度-效應(yīng)擬合曲線之間的偏離程度越來(lái)越大，毒性相互作用由部分加和、部分協(xié)同逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)檎麄€(gè)濃度區(qū)域的協(xié)同作用。對(duì)于同一條混合物射線，隨暴露時(shí)間延長(zhǎng)，CA預(yù)測(cè)曲線偏離95%OCI程度越來(lái)越大，協(xié)同作用越來(lái)越明顯。表明Met-Bla二元混合物毒性相互作用具有明顯的時(shí)間依賴性和濃度比依賴性。

Met-Ter二元混合物體系中，Ter所占濃度比從R1射線到R5射線逐漸增加。在同一暴露時(shí)間下，隨Ter濃度比增加，CA預(yù)測(cè)曲線與濃度-效應(yīng)擬合曲線之間的距離整體呈減小趨勢(shì)，毒性相互作用為協(xié)同作用且逐漸減弱。對(duì)于同一條混合物射線，隨暴露時(shí)間延長(zhǎng)，CA預(yù)測(cè)曲線偏離95%OCI程度越來(lái)越大，協(xié)同作用越來(lái)越明顯。表明Met-Ter二元混合物毒性相互作用具有時(shí)間依賴性和濃度比依賴性。

圖2 3種農(nóng)藥對(duì)C.pyrenoidosa的時(shí)間-濃度-效應(yīng)曲線Figure 2 The time-concentration-effect curve of three triazine pesticides on C.pyrenoidosa

圖3 二元混合物體系代表性射線的效應(yīng)數(shù)據(jù)、擬合曲線、95%置信區(qū)間曲線及CA預(yù)測(cè)線Figure 3 The effect data，fitted curve，95%confidential intervals and predicted curve by CA of representative ray of binary mixture systems

續(xù)圖3二元混合物體系代表性射線的效應(yīng)數(shù)據(jù)和擬合曲線、95%置信區(qū)間曲線及CA預(yù)測(cè)線Continued figure 3 The effect data，fitted curve，95%confidential intervals and predicted curve by CA of representative ray of binary mixture systems

續(xù)圖3二元混合物體系代表性射線的效應(yīng)數(shù)據(jù)和擬合曲線、95%置信區(qū)間曲線及CA預(yù)測(cè)線Continued figure 3 The effect data，fitted curve，95%confidential intervals and predicted curve by CA of representative ray of binary mixture systems

Bla-Ter二元混合物體系中，Ter所占濃度比從R1射線到R5射線逐漸增加。在同一暴露時(shí)間下，隨Bla濃度比增加，CA預(yù)測(cè)曲線與濃度-效應(yīng)擬合曲線間的位置關(guān)系沒(méi)有明顯變化規(guī)律。對(duì)于同一條混合物射線，隨暴露時(shí)間延長(zhǎng)，CA預(yù)測(cè)曲線偏離95%OCI程度越來(lái)越大，毒性相互作用由加和作用逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)閰f(xié)同作用。表明Bla-Ter二元混合物毒性相互作用具有明顯的時(shí)間依賴性。

選擇暴露時(shí)間96 h的半數(shù)效應(yīng)濃度EC50繪制農(nóng)藥二元混合物的二維等效圖（圖4），考察50%效應(yīng)時(shí)不同混合比射線的毒性相互作用。由圖4可看出，所有農(nóng)藥二元混合物體系各條射線的等效線段均位于濃度加和等效線下方，呈現(xiàn)出顯著的協(xié)同作用，尤其是Met-Bla混合物R3射線的等效線段偏離程度最大，所呈現(xiàn)的協(xié)同作用最強(qiáng)。這一結(jié)果和農(nóng)藥二元混合物射線CA預(yù)測(cè)結(jié)果基本吻合，且能更直觀地反映指定效應(yīng)下所有射線的毒性相互作用情況。

2.3 農(nóng)藥三元混合物對(duì)蛋白核小球藻的毒性相互作用

采用UD-Ray法設(shè)計(jì)農(nóng)藥三元混合物體系，基于CA模型對(duì)農(nóng)藥三元混合物在不同暴露時(shí)間的混合毒性進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)三元混合物5條射線具有相似的規(guī)律，且沒(méi)有隨時(shí)間發(fā)生明顯變化。圖5為Met-Bla-Ter三元混合物具代表性射線的實(shí)驗(yàn)觀測(cè)值及其95%OCI、擬合曲線、CA預(yù)測(cè)曲線。

從圖5中可以明顯看出，農(nóng)藥三元混合物R1、R2和R5射線的CA預(yù)測(cè)曲線均落在實(shí)驗(yàn)觀測(cè)95%置信區(qū)間以內(nèi)，毒性相互作用表現(xiàn)為加和作用，且隨著暴露時(shí)間延長(zhǎng)，毒性相互作用未發(fā)生改變。本研究中CA模型也可較準(zhǔn)確預(yù)測(cè)3種農(nóng)藥的混合物對(duì)蛋白核小球藻的毒性。

選擇暴露時(shí)間96 h的半數(shù)效應(yīng)濃度EC50繪制農(nóng)藥三元混合物的三維等效圖（圖6）。由圖可看出，農(nóng)藥三元混合物體系中，濃度加和等效面與混合物射線的EC50置信區(qū)間線相交，表明農(nóng)藥混合物射線在EC50水平下呈加和作用。這一結(jié)果與農(nóng)藥三元混合物射線的CA預(yù)測(cè)線及CRC間關(guān)系相吻合，進(jìn)一步說(shuō)明三維等效圖法分析結(jié)果的可靠性。

2.4 農(nóng)藥及其混合物對(duì)蛋白核小球藻葉綠素含量的影響

選擇3種農(nóng)藥及其二元混合物R3射線、三元混合物R5射線進(jìn)行葉綠素測(cè)定實(shí)驗(yàn)，在擬合曲線CRCs相關(guān)參數(shù)的基礎(chǔ)上，計(jì)算不同藥物對(duì)C.pyrenoidosa產(chǎn)生10%、30%、50%及70%抑制效應(yīng)時(shí)的濃度。分別在暴露時(shí)間48 h和96 h測(cè)定C.pyrenoidosa中葉綠素a的含量，并根據(jù)對(duì)照組含量，計(jì)算不同暴露時(shí)間及不同抑制效應(yīng)下的葉綠素a減少率，結(jié)果如圖7所示。

圖6 農(nóng)藥三元混合物射線在EC50下的三維等效圖Figure 6 Three-dimensional isobiologram of pesticide ternary mixture rays responding to the effect of 50%

圖4 農(nóng)藥二元混合物射線在EC50下的二維等效圖Figure 4 Two-dimensional isobiolograms of pesticide binary mixture rays responding to the effect of 50%

圖5 三元混合物體系代表性射線的效應(yīng)數(shù)據(jù)、擬合曲線、95%置信區(qū)間曲線和CA預(yù)測(cè)線Figure 5 The effect data，fitted curve，95%confidential intervalsand predicted curve by CA of representative ray of ternary mixture systems

從圖7可明顯看出，C.pyrenoidosa分別在48 h和96 h暴露時(shí)間下，隨著藥物效應(yīng)濃度的增加，葉綠素a含量逐漸減小，且在對(duì)照組基礎(chǔ)上計(jì)算出的減少率逐漸變大，這與各組藥物對(duì)應(yīng)的CRCs曲線變化趨勢(shì)基本一致。

雖然葉綠素a減少率與濃度效應(yīng)曲線變化規(guī)律相似，但在不同組藥物的作用下，減少率變化的程度明顯不同。在農(nóng)藥Met及Met-Ter暴露下，各效應(yīng)濃度時(shí)的葉綠素a減少率均小于其抑制效應(yīng)，以農(nóng)藥Met-Ter暴露96 h為例，效應(yīng)濃度10%、30%、50%和70%對(duì)應(yīng)的葉綠素a減少率分別為6.66%、10.66%、30.46%和60.85%。在農(nóng)藥Met-Bla暴露下，各效應(yīng)濃度時(shí)的葉綠素a減少率均大于其抑制效應(yīng)，效應(yīng)濃度10%、30%、50%和70%對(duì)應(yīng)的葉綠素a減少率分別為10.76%、40.28%、60.53%和81.34%。而在農(nóng)藥Bla、Ter、Bla-Ter和Met-Bla-Ter暴露下，各效應(yīng)濃度時(shí)的葉綠素a減少率與相應(yīng)抑制效應(yīng)基本一致。

3 討論

李威等[30]在研究中發(fā)現(xiàn)，5氟尿嘧啶對(duì)藻類的毒性沒(méi)有明顯的時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系。陶夢(mèng)婷等[32]也發(fā)現(xiàn)，草甘膦低濃度暴露對(duì)青?；【亩拘詻](méi)有時(shí)間依賴性。本研究中，3種農(nóng)藥對(duì)C.pyrenoidosa的毒性也具有一定的時(shí)間和濃度依賴性，即整體上呈現(xiàn)為隨暴露時(shí)間的延長(zhǎng)和暴露濃度的增加，毒性逐漸增強(qiáng)。但在低濃度區(qū)域的毒性變化卻沒(méi)有時(shí)間依賴性，這可能是生物適應(yīng)等原因所致[33]。沈國(guó)興等[34]的研究也發(fā)現(xiàn)，許多農(nóng)藥在高濃度作用下會(huì)對(duì)藻類產(chǎn)生毒害作用，而在低濃度時(shí)則無(wú)毒性效應(yīng)，并且提出農(nóng)藥對(duì)藻類同時(shí)存在毒害和降解兩個(gè)過(guò)程，在低濃度時(shí)降解占主導(dǎo)地位表現(xiàn)為無(wú)毒性效應(yīng)，在高濃度時(shí)毒害作用占主導(dǎo)地位表現(xiàn)為毒性效應(yīng)。C.pyrenoidosa在低濃度Met暴露下幾乎沒(méi)有毒性作用，而在低濃度Bla和Ter暴露下，毒性作用隨暴露時(shí)間延長(zhǎng)先增強(qiáng)后逐漸減弱；在中濃度和高濃度區(qū)域有一定的時(shí)間和濃度依賴性，Met對(duì)C.pyrenoidosa的毒性出現(xiàn)突然增強(qiáng)，而Bla和Ter對(duì)C.pyrenoidosa的毒性則逐漸增強(qiáng)。這與陶夢(mèng)婷等[32]在農(nóng)藥對(duì)青?；【拘宰饔醚芯恐械慕Y(jié)果類似。

多種化合物同時(shí)作用于生物會(huì)產(chǎn)生聯(lián)合毒性，可能通過(guò)作用于相同的靶器官產(chǎn)生加和作用[35]，通過(guò)組分間結(jié)構(gòu)互補(bǔ)性產(chǎn)生協(xié)同作用[36]，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)作用位點(diǎn)產(chǎn)生拮抗作用[37]。在考察三嗪類農(nóng)藥混合物毒性基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究了混合物毒性相互作用隨時(shí)間和組分濃度的變化。農(nóng)藥二元混合物體系Met-Bla和Met-Ter的毒性相互作用，均具有明顯的時(shí)間依賴性和濃度比依賴性，Bla-Ter體系只具有明顯的時(shí)間依賴性。但不同混合物體系隨暴露時(shí)間和組分濃度比改變，其毒性相互作用呈現(xiàn)各異的規(guī)律，說(shuō)明混合物毒性相互作用機(jī)理較復(fù)雜，需要進(jìn)一步做分子水平方面的研究。

二維等效線圖法常用于二元混合體系中多種濃度比混合物的毒性相互作用分析，且多選擇EC50為等效應(yīng)濃度參考點(diǎn)[38-39]，但這種傳統(tǒng)等效線圖法只能反映EC50效應(yīng)下二元混合物毒性相互作用情況。本研究中的三維等效線圖法評(píng)估3種三嗪類農(nóng)藥混合物對(duì)蛋白核小球藻的毒性相互作用，拓展了等效線圖法的應(yīng)用范圍，較直觀地反映3種組分聯(lián)合毒性作用情況，但目前只是針對(duì)混合物的EC50濃度水平的評(píng)估，有待于進(jìn)一步探討三維等效線圖的多水平應(yīng)用。

4 結(jié)論

（1）Logit函數(shù)能較好地?cái)M合3種三嗪類農(nóng)藥及其混合物體系對(duì)C.pyrenoidosa的濃度-效應(yīng)數(shù)據(jù)，在暴露時(shí)間48 h及以上，3種農(nóng)藥的毒性大小順序?yàn)锽la＞Ter＞Met。

（2）二元混合物的毒性相互作用整體上呈現(xiàn)為加和作用向協(xié)同作用的轉(zhuǎn)變。Met-Bla和Met-Ter二元混合物體系毒性相互作用具有時(shí)間依賴性和濃度比依賴性，而Bla-Ter二元混合物體系的毒性相互作用只有時(shí)間依賴性。根據(jù)3個(gè)混合物體系的二維等效線圖，可看出各混合物體系在EC50效應(yīng)下均具有較強(qiáng)的協(xié)同作用。

（3）農(nóng)藥三元混合物體系對(duì)C.pyrenoidosa的毒性作用表現(xiàn)為加和作用，且隨暴露時(shí)間延長(zhǎng)，作用類型未發(fā)生改變，混合物三維等效圖與對(duì)應(yīng)CA模型的分析結(jié)果一致，且毒性作用更加直觀，也說(shuō)明三維等效圖分析結(jié)果的可靠性。

（4）3種農(nóng)藥及其混合物射線中，C.pyrenoidosa葉綠素a含量的減少率與各組藥物對(duì)應(yīng)的CRCs曲線變化趨勢(shì)基本一致。但在不同藥物作用下，C.pyrenoidosa生理毒性與種群水平毒性間關(guān)系稍有差異。

圖7 C.pyrenoidosa中葉綠素a含量及減少率的變化Figure 7 Changes of chlorophyll-a content and reduction rate in C.pyrenoidosa