曹 升 ，羅潔文 ，胡華英 ，張 虹 ，周垂帆 *，劉 博

（1.福建農林大學林學院，福州 350002；2.南方紅壤區(qū)水土保持國家林業(yè)與草原局重點實驗室，福州 350002；3.福建長汀紅壤丘陵生態(tài)系統(tǒng)國家定位觀測研究站，福建 長汀 366300）

伴隨工業(yè)的發(fā)展，許多富含重金屬的污染物隨著未經處理的廢氣廢水排放到環(huán)境中。Pb作為常見重金屬污染物之一，隨大氣沉降、廢液滲漏等進入土壤。根據2014年公布的《全國土壤污染調查公報》，Pb在土壤的污染點位超標率達到1.1%，是耕地、工業(yè)用地、礦區(qū)等土壤的主要污染物[1]。作為一種生物體非必需微量元素，Pb在土壤中過量累積會嚴重影響土壤質量，使土壤生化活性降低。Pb會隨著食物鏈在生物體中累積并對生物體產生危害[2]，因此亟需尋找可修復Pb污染土壤的科學有效的方法。植物修復技術由于所需費用低，對所需修復場地破壞力小，易于控制等優(yōu)點，已成為重要的重金屬污染土地修復手段。類蘆作為一種優(yōu)良的南方土地修復植物，其環(huán)境適應性強、生物量大，在Pb污染嚴重的礦區(qū)也能生長良好，對Pb具有一定的耐性與富集作用[3]。據研究報道，一株類蘆的根部能吸附Pb達4 687.87 mg·kg-1，其中根細胞壁中Pb占總吸附量的90.43%[4]。但目前對于類蘆耐Pb的機制，特別是根系對Pb阻隔的關鍵作用還不夠明確。

根尖細胞壁是植物最初接觸到重金屬離子的部位，是有毒金屬陽離子跨膜進入植物體內的第一道屏障。其對重金屬脅迫的響應信號能夠直接干擾植物代謝過程，進而影響重金屬解毒效果和植物修復目標的實現[5]。植物根細胞壁能通過吸收、累積重金屬離子來提升植物對重金屬的耐受性[6]，根細胞壁通過增加根部對重金屬的固存量與降低吸收率，成為植物積累重金屬、降低重金屬對整株植物毒害的主要器官[7]。研究表明，小麥根細胞壁吸附Al占植株總吸附量的77%[8]，香蒲在不同生長期中，根部對As的吸附量均遠高于地上部分[9]。由構成骨架的纖維素，填充于胞間層的果膠，和含有的蛋白質、木質素等物質共同構成的植物細胞壁結構復雜。細胞壁中多糖上的氨基、羥基、磷酸基等基團[10]為帶負電的官能團，其能主動將重金屬陽離子固定于細胞壁上，并改變重金屬在植物細胞內的形態(tài)，從而起到隔離作用[11]。應對重金屬毒害時，細胞壁各組分運用不同機制抵御，如帶有負電荷的細胞壁質膜會吸附帶正電荷的重金屬離子以減少重金屬離子進入細胞質內[12]，木質素通過產生不同的酶來參與抵御[13]。此外，有研究表明，不同品種的玉米根細胞壁中，果膠能吸附55.6%～79.5%的Pb[14]，Al脅迫下小麥細胞壁多糖顯著增加，甲基化水平下降，使得小麥細胞壁中果膠的Al結合能力增強，耐Al性增強[15]。因此，植物根細胞壁可通過固定重金屬提升對重金屬的耐性，起到降低重金屬對植物體原生質體的毒害作用。關于Pb2+吸附固定過程中類蘆根細胞壁哪些組分及組分中哪些官能團起到了關鍵性作用等問題并不清楚，這極大制約了我們對類蘆Pb脅迫下的耐性和解毒機制的認知。

本研究通過對細胞壁進行不同化學改性，并通過吸附動力學實驗探究Pb吸附過程中起到具體作用的官能團。利用傅里葉變換紅外光譜（FTIR）表征類蘆細胞壁內的聚合物和官能團信息，定量分析Pb吸附前后細胞壁中組分及化學基團的信息與作用，揭示細胞壁內各官能團參與應對Pb毒害的特征與機制。本研究為Pb對植物的毒害作用和植物對Pb的耐性及解毒機制提供研究思路，也為類蘆應用于Pb污染土壤的修復和治理提供相關參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

首先將類蘆種子在福建農林大學的溫室大棚中進行土培，每日用去離子水進行澆灌，數日后挑選長勢一致（20 cm左右）的幼苗移至直徑為11 cm的不透光塑料容器中，并用800 mL Hoagland培養(yǎng)液進行水培。營養(yǎng)液配方為 5.0 mmol·L-1KNO3、2.0 mmol·L-1MgSO4·7H2O、5.0 mmol·L-1Ca（NO3）2·4H2O、1 mmol·L-1Fe-EDTA、46.3 mmol·L-1H3BO3、0.3 mmol·L-1CuSO4·5H2O、0.8 mmol·L-1ZnSO4·7H2O、9.1 mmol·L-1MnCl2·4H2O和0.4 mmol·L-1H2MoO4[16]，每5株種植于一個容器內，置于人工氣候培養(yǎng)箱中，光照時間為14 h，晝溫25℃，夜溫20℃。試驗植株分為空白組（CK）和Pb處理組，空白組溶液中不含有Pb，處理組溶液中Pb濃度為50μmol·L-1，每日更換一次脅迫液，以維持Pb的濃度。14 d后植株根系用洗脫液解析15 min并用蒸餾水洗凈擦干，再用液氮固定后保存于-75℃冰箱。

1.2 類蘆根細胞壁的提取分離

將空白組與Pb處理組的根系樣品分別剪碎置于陶瓷研缽，放入液氮磨碎成粉末后進行浸提，浸提順序如下：先加入75%冰乙醇浸提20 min，隨后5000 g離心10 min，抽去上懸液，該操作重復3次；在離心得到的沉淀物中依次加入體積比為1∶1的冷丙酮與三氯甲烷混合液（體積與根質量比例為7∶1）和甲醇進行浸提，然后離心20 min，將得到的沉淀物冰凍后進行凍干，即得到根細胞壁，置于4℃保存[17]。

1.3 類蘆根細胞壁的化學改性

對未經過處理的空白組類蘆根細胞壁粉末進行果膠酶改性、酯化改性和氨基甲基化改性[18]。

果膠酶改性即使細胞壁中果膠在果膠甲酯酶作用下被酶解，再對去除果膠質后的細胞壁研究其重金屬吸附能力。處理方法如下：取2 g類蘆根細胞壁的粉末于離心管內，加120 mL 1%的果膠酶。為保持果膠酶的活性以及穩(wěn)定性，再加入1%的BSA（Bovine serum albumin）作為穩(wěn)定劑，充分混合后置于30℃水浴消化30 min，離心后的沉淀物用去離子水洗滌3次，凍干，并置于4℃環(huán)境下保存?zhèn)溆谩?/p>

細胞壁上的羧基在酯化改性后被部分去除，可以通過對改性后細胞壁進行重金屬吸附分析來探究羧基的作用。處理方法如下：稱取2 g類蘆根細胞壁的粉末于離心管內，加入140 mL無水甲醇，并加入120 mL濃HCl做反應催化劑。離心管在125 r·min-1速度下旋轉振蕩12 h使其充分反應。離心去除上清液，用去離子水洗滌沉淀物3次后凍干，并置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

細胞壁經過甲基化處理，能去除部分氨基，以探究氨基基團在根細胞壁Pb吸附過程中的作用。處理方法如下：稱取2 g類蘆根細胞壁粉末于離心管中，加入40 mL甲醛，再加入80 mL甲酸作為還原劑，混合均勻后125 r·min-1速度下旋轉振蕩反應6 h，結束后混合物離心分離，沉淀物用去離子水洗滌3次，冷凍干燥后置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 根細胞壁Pb吸附動力學試驗

分別取空白組與經過不同化學改性后的根細胞壁粉末0.05 g裝入交換柱中，上下濾頭有導管鏈接。將吸附液[5 mg·L-1Pb（NO3）2+0.01 mol·L-1NaNO3]從上導管注入，下導管與自動收集器連接。將解吸液以5 mL·10 min-1的流速吸出，自動收集器10 min收集一管直到無液體流出。用原子吸收分光光度計測定流出液中Pb2+濃度。該實驗重復3次，得出的數據計算平均值并作圖（因標準差小于5%，為保證圖清晰故未標出）[18]。

1.5 根細胞壁的傅里葉紅外光譜表征

對經過不同化學改性、空白組以及在Pb處理前后的根細胞壁用傅里葉變換紅外光譜儀進行紅外光譜表征。FTIR能記錄樣品4000～400 cm-1范圍的光譜信號信息，光譜分辨率為4 cm-1。制作檢測樣品方法如下：分別稱取1 mg凍干備用的樣品，再以1∶100比例加入碎晶型溴化鉀（KBr）充分混合，放入瑪瑙研缽研磨充分后壓片進行FTIR測定。

1.6 統(tǒng)計分析

相關數據使用SPSS20進行分析，所有數據進行方差齊性檢驗和正態(tài)性檢驗。

多組間比較采用單因子方差分析（ANOVA），組間差異分析使用SNK法，顯著性水平設定為α=0.05。作圖使用Origin 2018。

2 結果與分析

2.1 化學改性前后紅外光譜分析

根據類蘆根細胞壁改性前后的FTIR圖（4000～400 cm-1，圖1）可看出不同改性處理后細胞壁官能團發(fā)生的變化，對其主要的吸光度值進行解析后得到前后變化的信息見表1。FTIR圖像反映出根細胞壁中不同官能團在Pb吸附中的作用。通過觀察吸收峰位置的偏移與峰形變化，能夠判斷參與反應的具體基團。

根據圖1與表1，可得到空白對照組的類蘆根細胞壁的特征峰：3429 cm-1處羥基（-OH）的對稱伸縮峰和氨基（-NH）的不對稱伸縮振動峰；2922 cm-1處甲基（-CH3）的對稱伸縮振動峰；1720 cm-1處酯基（-C=O）的不對稱伸縮振動峰；1626 cm-1處酰胺Ⅰ帶（-C=O）的伸縮振動峰；1605 cm-1處酰胺Ⅱ帶（-CONH）的伸縮振動峰；1186 cm-1處硫酸酯（C-O-S）或羧基（C-O）或磷酸鹽（C-O-P）的伸縮振動峰；1053 cm-1處纖維素糖鏈（-C-H）或-C-C或-C-O振動峰。

圖1 化學改性前后類蘆根細胞壁傅里葉光譜圖Figure 1 The FTIRspectra of the root cell wall of Neyraudia reynaudiana before and after chemical modification

表1 化學改性前后類蘆根細胞壁傅里葉光譜分析Table 1 Analysis of FTIRspectra of the Neyraudia reynaudiana root cell wall before and after chemical modification

酯化改性后，類蘆根細胞壁中羥基（-OH）在酯化改性后向低頻移動了14 cm-1，表明細胞壁中的部分羥基基團已經與甲醇發(fā)生了酯化反應被去除。1626 cm-1處酰胺Ⅰ帶（-C=O）與1605 cm-1處酰胺Ⅱ帶（-CONH）代表了細胞壁中蛋白質的特征光譜，果膠酶改性后，兩者分別向高頻移動，表明蛋白質中果膠在改性后被去除；此外，1186 cm-1處硫酸酯（C-O-S）的伸縮振動峰出現了降低，表明果膠中含有的部分羧基（C-O）在改性后被去除，1053 cm-1處纖維素糖鏈（-C-H）的伸縮振動峰均降低，推斷纖維素中的果膠在改性處理后被去除，表明果膠改性成功。氨基甲基化改性后，3429 cm-1處氨基（-NH）與2922 cm-1處甲基的伸縮振動峰均出現下降，氨基基團在改性后明顯下降；此外，根據圖1，在1626 cm-1處酰胺Ⅰ帶（-C=O）與1605 cm-1處酰胺Ⅱ帶（-CONH）的峰高明顯下降，N-H減少，氨基發(fā)生變化，表明對細胞壁的氨基甲基化改性成功。

2.2 鉛吸附動力學及吸附位點分析

圖2 類蘆根細胞壁化學改性前后吸附Pb的變化Figure 2 The effect of Pb absorbed by cell wall of root of Neyraudia reynaudiana with chemical modification

不同改性處理后細胞壁對Pb的吸收率（圖2）能反映參與Pb吸附的官能團位點。在初始階段，根細胞壁對Pb的吸收速率較大，400 min左右吸附達到平衡。經酯化改性去除部分羥基后，根細胞壁對Pb的吸附能力下降幅度最大，達到68.1%。果膠酶改性后的根細胞壁中果膠上對重金屬離子吸附位點減少，對Pb的吸附能力降低48.9%。氨基甲基化改性后吸附能力相對下降41.1%。

2.3 類蘆細胞壁吸附Pb前后紅外光譜分析

2.3.1 處理組中類蘆根細胞壁吸附Pb前后的紅外光譜

圖3 處理組類蘆根細胞壁Pb吸附前后紅外光譜圖Figure 3 FTIRspectra of the Neyraudia reynaudiana root cell wall before and after Pb adsorption

對類蘆幼苗用50μmol·L-1Pb營養(yǎng)液水培14 d，水培前后分別提取根細胞壁進行FTIR分析（圖3）。當官能團與Pb2+發(fā)生結合時，吸收峰會向低頻移動。結合表2，能看出3429 cm-1處羥基與2922 cm-1處甲基在吸附Pb后伸縮振動峰向低處偏移，說明羥基與甲基化合物出現了締合現象，羥基與甲基均參與了Pb的吸附。酯基、酰胺Ⅰ帶與酰胺Ⅱ帶均出現了吸收峰值的上升，其附近峰形也發(fā)生較明顯變化，1186 cm-1處硫酸酯特征峰出現下降，說明吸收Pb后細胞壁硫酸酯化程度降低。1115 cm-1處果膠特征峰變化顯著，說明果膠在Pb吸附中發(fā)揮重要作用。以上變化說明各官能團在類蘆根細胞壁中對Pb離子均起到了吸附作用。

2.3.2 Pb脅迫處理中類蘆根細胞壁吸附Pb的紅外光譜

用CK與5μmol·L-1Pb的營養(yǎng)液分別對類蘆幼苗進行水培，14 d后提取其根細胞壁用FTIR分析。對照組與Pb脅迫組細胞壁FTIR結果見表3和圖4?？煽吹?429 cm-1處羥基的特征峰下降，且偏移量較大，在圖4中反應的特征峰也明顯與CK相比更窄更尖，說明Pb2+與羥基基團發(fā)生了交互作用。酰胺Ⅰ帶與酰胺Ⅱ帶均向高頻移動13 cm-1，表明蛋白質與親水脂分子在Pb吸附中起重要作用。羧酸鹽與多糖結構的C-H或C-O以及纖維素糖鏈的伸縮振動峰向低頻方向移動，且峰值強度下降。

3 討論

3.1 類蘆根細胞壁的Pb吸附位點

植物細胞壁是植物生長發(fā)育及應對各種逆境脅迫的重要器官，植物細胞壁通過隔離機制或主動增加細胞組分來抵御重金屬對植物體產生的毒害。研究表明細胞壁中含有羥基、羧基和氨基等主要基團，它們可與重金屬陽離子結合，從而降低重金屬對植物的毒害。但是不同植物的細胞壁組分對不同重金屬的吸附或絡合等過程的貢獻及其機制存在明顯的差異性。本實驗表明，類蘆對Pb2+的吸附能力主要來自于根細胞壁對陽離子的交換能力，-OH、-NH2、-COOH等主要基團組成的細胞壁多糖，能與金屬陽離子結合[19]。本實驗中根細胞壁在不同改性處理后對Pb2+的吸附量均有不同程度的降低，表現為酯化改性＞果膠酶改性＞氨基甲基化改性。

表2 處理組類蘆根細胞壁Pb吸附前后的傅里葉光譜分析Table 2 Quantitative analysis of FTIRspectra of the Neyraudia reynaudiana root cell wall before and after treatments

表3 Pb脅迫處理下類蘆根細胞壁紅外光譜分析Table 3 Analysis of FTIRspectra of the root cell wall of Neyraudia reynaudiana under different treatments

圖4 空白組與Pb處理組類蘆根細胞壁的紅外光譜圖Figure 4 The FTIRspectra of the root cell wall of Neyraudia reynaudiana under different Pb treatments

酯化改性主要讓細胞壁中的羧基與外來物的羥基發(fā)生酯化反應，使類蘆細胞壁上的羧基減少，從而分析羧基在細胞壁上與重金屬吸附的能力。酯化改性后的根細胞壁對Pb2+的吸附量下降了68.1%，這說明類蘆細胞壁中的羧基在與Pb2+的吸附中起著重要作用。張虹等[20]的研究表明，小飛蓬根細胞壁在酯化改性后，對Cd2+的吸附量相對降低了39.7%。郭軍康等[21]的研究也表明，番茄根細胞壁酯化后，Cd吸附量降低了49.51%。以上說明酯化改性能減少細胞壁中羧基含量，是根細胞壁上重金屬離子的重要吸附位點。

果膠可通過帶有的負電荷來調節(jié)細胞壁中的離子平衡。果膠類多糖的最基本組成結構有Ⅰ型鼠李半乳糖醛酸聚糖（Rhamnogalacturonan-Ⅰ，RG-Ⅰ）、Ⅱ型鼠李半乳糖醛酸聚糖（Rhamnogalacturonan-Ⅱ，RG-Ⅱ）和同聚半乳糖醛酸聚糖（Homogalacturonan，HGAs）[22]。HGAs因能發(fā)生甲酯化而使果膠帶負電荷，使其與金屬結合能力增強[23]。Konno等[24]對劍葉舌葉蘚研究發(fā)現其細胞壁中43%的Cu結合于果膠中的HGAs中。本研究中根細胞壁在果膠酶改性后，對Pb的吸附量降低了48.9%。與此類似的研究有：Eticha等[25]研究不同玉米植株根尖果膠含量顯示，根尖細胞壁中果膠含量越高，細胞壁對Al的吸附量越高。對植物根細胞壁使用含有1%濃度的果膠酶溶液處理30 min后，細胞壁對Al的吸附降低了50%[26]。以上表明果膠中的多糖物質具有螯合金屬的能力，說明其在細胞壁對Pb的吸收中發(fā)揮了重要作用。

此外，本研究中根細胞壁在氨基甲基化改性后，對Pb的吸附量降低了41.1%。相似研究如海州香薷根細胞壁在氨基甲基化改性后，對Cu2+吸附量降低了79.4%[27]。說明氨基甲基化反應能抑制氨基與部分重金屬離子結合，從而使重金屬離子對細胞壁的吸附能力降低，氨基是類蘆根細胞壁上重要的Pb吸附基團，但其對其他種類重金屬離子的吸附能力仍需進一步討論與研究。

3.2 根細胞壁Pb處理紅外光譜定性分析

由FTIR譜圖中細胞壁在吸附Pb前后各官能團峰值的偏移量，可判斷在Pb吸附中各官能團的作用。本實驗中，3429 cm-1處為羥基（-OH）基團，經Pb處理后類蘆根細胞壁FTIR圖中-OH吸收峰與空白組對比向低頻移動，高濃度Pb脅迫導致羥基化合物出現締合作用。結合酯化改性后根細胞壁在FTIR圖中羥基的吸收峰向低頻遷移量達到14 cm-1，認為羥基是Pb吸附的重要官能團。1720 cm-1處酯基（C=O）在Pb處理后吸收峰值向高頻偏移，說明Pb脅迫下，類蘆細胞壁中果膠的甲基酯化程度降低，使得帶負電荷的游離羧基含量上升，對Pb的吸附能力增強，這被看作是類蘆根細胞對于Pb脅迫環(huán)境的一種應對行為。與Clemens[28]研究結果一致，植物細胞壁的果膠質內的大部分羧基都以甲基酯的形式存在，通過降低果膠甲基化程度，使羧基以游離酸和鹽的形式存在，以促使細胞壁能吸附更多的金屬陽離子。Schmol等[29]研究結果中證實植物根尖細胞的Al積累程度與果膠甲基化水平成反比。細胞壁中纖維素、半纖維素、果膠中含有豐富的羥基與羧基，從而也證實了類蘆根細胞壁中果膠與纖維素在Pb吸附中的重要作用。

FTIR譜圖中，1626 cm-1附近的酰胺Ⅰ帶（-C＝O）與1605 cm-1處的酰胺Ⅱ帶（-CONH）在Pb處理后與空白相比，吸收峰均向高處偏移13 cm-1，因為兩者均為細胞壁上蛋白質的特征譜帶，推測由于Pb脅迫使類蘆根細胞壁分泌蛋白類物質，蛋白質二級結構中肽鍵間氫鍵結合能力增強[4]，結構更為穩(wěn)定。細胞壁蛋白也能與果膠多糖鏈通過協(xié)作共同吸附重金屬物質以達到減輕毒害的目的[30]。鳳眼蓮根細胞壁在Cd脅迫處理后酰胺Ⅰ帶與酰胺Ⅱ帶在FTIR譜圖中的特征峰均上升[31]，劉婷婷等[32]的研究表明海州香薷在受到Cu脅迫時，其根細胞壁蛋白能提供結合位點。苜蓿在Cd脅迫下酰胺Ⅰ帶、酰胺Ⅱ帶均發(fā)生位移，表明其蛋白質結構改變[33]，以上說明大部分植物在受到不同重金屬脅迫下，在植物耐性范圍內其細胞壁會伸展蛋白含量來增強對重金屬離子的結合能力，同時協(xié)同果膠等物質增強細胞壁的穩(wěn)定性。類蘆根細胞壁中的果膠C-C或C-O以及纖維素糖鏈-C-H彎曲或-CC、-C-O伸縮振動峰在Pb脅迫后的峰值出現降低，峰形也出現位移，認為是類蘆根細胞壁在Pb脅迫環(huán)境下誘導合成多糖類物質，包括纖維素、果膠、碳水化合物等[34]?？梢奝b脅迫會對類蘆根細胞壁的多糖類物質含量產生影響以降低重金屬毒害的影響。在Pb脅迫試驗中發(fā)現，類蘆在50μmol·L-1Pb脅迫處理時，根系生長受到抑制，但植株未出現明顯毒害癥狀。綜上，說明類蘆對Pb具有一定耐受性。在受到Pb脅迫時，類蘆能通過調節(jié)果膠、多糖和蛋白質等物質以及羥基、羧基、氨基等官能團的含量，來不斷提高自身適應Pb脅迫能力。

4 結論

（1）類蘆根細胞壁對Pb具有較高固定能力，Pb脅迫時其會通過改變自身細胞壁各結構的組分以緩解重金屬毒害的影響。

（2）羧基官能團是根細胞壁進行Pb吸附時的主要官能團。羥基與氨基也在Pb吸附中發(fā)揮一定作用。

（3）通過FTIR譜圖表征的Pb處理后根細胞壁上的吸附位點信息，細胞壁內纖維素、半纖維素與果膠提供大量羥基、羧基以提高對Pb的結合能力，根細胞壁還會通過誘導生成蛋白質、碳水化合物等物質提升對Pb的耐性。