智會，張志永

結(jié)腸癌是臨床較為常見的惡性腫瘤之一，是世界范圍排名第3的惡性腫瘤。對結(jié)腸癌的早期治療手段主要以切除和放化療為主，但癌細胞的轉(zhuǎn)移和化療藥物產(chǎn)生的抗性是結(jié)腸癌治療過程中亟待解決的問題。近年來發(fā)現(xiàn)糖尿病合并腫瘤病人增多，胃腸道癌癥與肥胖伴糖尿病病人發(fā)病風險相關(guān)，這可能與胰島素生長因子受體1（insulin growth factor receptor 1，IGFR-1）、胰高血糖素樣肽-1（glucagon like peptide 1，GLP-1）通路相關(guān)［1-2］。部分研究報道，胰島素通過IGFR-1 促進細胞增殖，增加腫瘤的發(fā)生風險［3］。近年來腸促胰素效應(yīng)的降糖藥GLP-1 類似物——利拉魯肽在臨床上應(yīng)用廣泛。研究報道GLP-1 類似物促進前列腺癌細胞、乳腺癌細胞的凋亡，抑制其增殖［4-5］。但GLP-1 類似物對人結(jié)腸癌細胞的作用鮮有報道。研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄活化因子6（transcription activator 6，ATF6）是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）的主要靶點，活化的ATF6可促進ERS相關(guān)因子的表達促進細胞凋亡［6］。故本實驗于2016 年5 月至2018 年5 月探討利拉魯肽作用人結(jié)腸癌HCT116 細胞后對其增殖、凋亡及ATF6 通路的影響，以期為癌癥的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 人結(jié)腸癌細胞HCT116中國醫(yī)學科學院提供，利拉魯肽原藥粉劑（批號20171106）購于上海華誼藥廠有限公司，RPMI1640 培養(yǎng)基（批號20181206）、胎牛血清（批號20181109）、0.25%胰蛋白酶（批號20181209）購于美國HyClone公司，DMSO（批號20181207）購于美國Amresco 公司，MTT 試劑盒（批號20181011）購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司，細胞凋亡試劑盒（批號20180916）購于BD 試劑公司，Trizol 試劑盒（批號20180508）購于invitrogen公司，凍存管（貨號NB-362J）、96孔板（貨號HD-9J45）、細胞計數(shù)板（貨號KDN73）購于Fisher Lab-Serv 公司，PVDF 微孔濾膜（貨號N-67DNA）購于美國Bio-Rad 公司，BCA 蛋白試劑盒（批號20180916）購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司，β-肌動蛋白抗體（批號20181109）、ATF6抗體（20181107）、CCAAT-增強子結(jié)合蛋白（C/EBP）同源蛋白（CHOP）抗體（批號20181206）、casepase-3 抗體（20181207）、21KD 蛋白（Bax）抗體（20181209）購于美國Proteintech公司，二抗辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗鼠IgG（批號20181102）購于美國Pierce公司，ECL化學發(fā)光試劑盒（批號20171209）購于Amersham Pharmacia Biotech。高壓滅菌鍋（型號YX280A）購于日本SAKURA公司，多功能酶標儀（型號M-10082）購于美國Bio-Rad公司，F(xiàn)ACS流式細胞儀（型號EPICS XL）購于美國BD公司，二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱（型號ND-28NJ）購于美國Thermo Fisher Scientific 公司，凝膠成像系統(tǒng)（型號GenoSen2000）購于美國UVP公司，離心機（型號BU-289）、微量加樣器（型號PG-2415）、熒光定量儀（型號NG-J28）購于德國Eppendorf公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與處理 細胞培養(yǎng)：人結(jié)腸癌細胞HCT116，10%胎牛血清，置于37 ℃、5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 d 換液1 次，當細胞融合度達到80%左右時，棄掉培養(yǎng)基，適量磷酸緩沖鹽溶液（PBS）清洗，使用1 mL 0.25%的胰蛋白酶進行消化，1 000 r/min 離心收集細胞，調(diào)整細胞濃度為1×106/mL，接種到96孔板中培養(yǎng)。

實驗分組及處理：細胞懸液于96 孔板中培養(yǎng)，實驗組按照利拉魯肽濃度0、10、100、1 000 nM加入96孔板中培養(yǎng)24、48、72 h，每組設(shè)置3個復孔。

藥物溶解：稱取3.7 g利拉魯肽粉劑溶解于1 mL多肽稀釋液中，配置成終濃度為1 mM的儲存液，分裝后-20 ℃保存?zhèn)溆茫?］。

1.2.2 人膽囊收縮素/縮膽囊素八肽（CCK-8）檢測細胞增殖 HCT116細胞懸液以2×105/mL 接種于96孔板中，每孔100 μL，孔周邊用滅菌雙蒸水（dd H2O）填充，37 ℃、5%二氧化碳孵育箱中培養(yǎng)，24 h后觀察細胞進入對數(shù)生長期，棄掉培養(yǎng)基，分別以0、10、100、1 000 nM利拉魯肽作用細胞24、48、72 h，每個組做3個復孔；棄培養(yǎng)基，每孔加入10 μL CCK-8試劑及100 μL培養(yǎng)基，37 ℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，棄掉孔內(nèi)液體，全自動酶標儀檢測450 nm波長處各孔吸光度（OD）值，取均值，以空白對照孔調(diào)零，計算利拉魯肽對細胞的抑制率。

1.2.3 流式細胞儀檢測細胞周期 將對數(shù)生長期細胞制備成單細胞懸液，以2×105/mL 接種于12 孔板，每孔1 mL，培養(yǎng)24 h 貼壁后，分別以0、10、100、1 000 nM利拉魯肽作用細胞，每24小時換新鮮加藥培養(yǎng)液，藥物作用72 h 后，棄掉培養(yǎng)基，PBS 洗滌2次，1 000 r/min 離心5 min，300 μL PBS 重懸細胞沉淀，然后加入700 μL無水乙醇，4 ℃避光過夜。細胞固定后預冷PBS 洗2 次，1 000 r/min 離心5 min，500 μL PBS 重懸細胞沉淀，用冷PBS 洗2 次，離心，500 μL PBS 重懸細胞沉淀，加入核酸酶（RNAase）2.5 μL，2 μL 0.2%聚乙二醇辛基苯基醚（TritonX-100）室溫30 min，冰上孵育15 min，加入100 μg/mL 的碘化丙啶（PI）500 μL，4 ℃避光染色30 min，流式細胞儀測細胞周期。

1.2.4 細胞凋亡檢測 采用流式細胞儀檢測處理72 h 的細胞凋亡情況。0.25%胰蛋白酶進行消化，室溫1 000 r/min離心5 min收集各組細胞；設(shè)置濃度為0、10、100、1 000 nM利拉魯肽，每個濃度設(shè)置3個重復，培養(yǎng)72 h 后收集細胞，PBS 洗滌細胞兩次，調(diào)整細胞為2×105/mL；吸取1 mL 細胞懸液于離心管中，1 000 r/min離心5 min，棄上清，PBS洗滌2次，沉淀中加入200 μL 膜聯(lián)蛋白V 結(jié)合緩沖液（Binding Buffering）懸浮細胞，上機前加入5 μL PI 和5 μL 膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素（Annexin V-FITC），室溫避光反應(yīng)5～15 min，再加400 μL 緩沖液，1 h 內(nèi)使用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.2.5 蛋白質(zhì)印跡法（Western Blot）檢測蛋白表達采用蛋白質(zhì)印跡法檢測各細胞中Bax、半胱胺酸蛋白酶-3（Caspase-3）、ATF6 p50、CHOP蛋白含量的表達，取0、10、100、1 000 nM利拉魯肽作用72 h后細胞，RIPA裂解液裂解細胞，提取細胞中總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，記錄562 nm處OD值，計算樣品濃度，SDS變性蛋白；取等量蛋白樣品（每孔50 μg），SDS-PAGE電泳凝膠，跑膠完成后濕轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜）上，5%脫脂奶封閉1 h，稀釋一抗4 ℃孵育過夜，洗膜3次/5 min，二抗孵育1 h，洗膜3次/5 min，ECL顯影液顯影，以β-肌動蛋白（β-actin）為內(nèi)參。

1.3 統(tǒng)計學方法 數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行分析。多組間比較采用單因素方差分析+LSD-t檢驗。均以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度利拉魯肽對結(jié)腸癌細胞增殖的影響 將對數(shù)期生長的HCT116 細胞分別加入0、10、100、1 000 nM濃度的利拉魯肽，在加藥后24、48、72 h 進行CCK-8 檢測，結(jié)果顯示：與對照組相比，利拉魯肽各濃度間增殖率均有顯著變化（P＜0.05）。比較同一時間點，隨著藥物濃度的增加0、10、100、1 000 nM 各組細胞的增殖率分別為（97.16±35.67）%、（81.69 ± 33.37）%、（76.12 ± 30.23）%、（70.65 ± 28.89）% ；（86.17 ± 33.98）%、（58.68 ±26.77）%、（39.74±10.67）%、（30.17±9.24）%；（83.82±31.19）%、（38.77±10.19）%、（22.98±6.78）%、（16.63±6.12）%，均呈下降趨勢，提示利拉魯肽對HCT116細胞的抑制作用增強呈明顯的劑量依賴作用。比較同一濃度，隨著時間推移，24，48，72 h各時間點細胞增殖率分別為（97.16±35.67）%、（86.17±33.98）%、（83.82±31.19）%；（81.69±33.37）%、（58.68±26.77）%、（38.77±10.19）%；（76.12±30.23）%、（39.74±10.67）%、（22.98±6.78）%；（70.65±28.89）%、（30.17±9.24）%、（16.63±6.12）%，利拉魯肽作用于HCT116 細胞均有抑制作用，且隨著時間的延長抑制作用顯著增強（P＜0.05），提示利拉魯肽對HCT116 細胞的抑制作用存在時間依懶性。見圖1。

圖1 不同濃度利拉魯肽對結(jié)腸癌細胞增殖情況檢測

2.2 不同濃度利拉魯肽對結(jié)腸癌細胞周期分布的影響 不同濃度利拉魯肽作用于HCT116 細胞72 h后，采用流式細胞術(shù)檢測細胞周期，檢測結(jié)果顯示：10、100、1 000 nM濃度的利拉魯肽組的G2/M期細胞比例較0 nM 組顯著減少（P＜0.05），且隨著濃度的增加呈現(xiàn)下降趨勢。見圖2。

2.3 不同濃度利拉魯肽對結(jié)腸癌細胞凋亡的影響 不同濃度利拉魯肽作用于結(jié)腸癌細胞HCT116 72 h 后，采用流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡，結(jié)果顯示：0、10、100、1 000 nM 利拉魯肽作用下細胞凋亡率分別 為（9.06 ± 0.98）%、（10.45 ± 1.12）%、（13.89 ±1.54）%、（56.08±14.33）%，依次升高（P＜0.05）。與0 nM 組比較，10、100、1 000 nM 濃度的利拉魯肽組細胞的凋亡率依次顯著升高（P＜0.05）；與10 nM組比較，100、1 000 nM 組凋亡率依次o 顯著升高（P＜0.05）；與100 nM 組比較，1 000 nM 組凋亡率顯著升高（P＜0.05），表明利拉魯肽濃度越高對HCT116 細胞的促凋亡作用越明顯。見圖3。

2.4 利拉魯肽對凋亡因子Bax、Caspase-3 的影響對培養(yǎng)72 h 的HCT116 細胞進行蛋白質(zhì)印跡法檢測，結(jié)果顯示，10、100、1 000 nM 濃度利拉魯肽作用于細胞后，細胞中Bax 蛋白表達量分別為（0.69±0.13）、（0.93±0.24）、（1.19±0.25），顯著升高（P＜0.05），1 000 nM 組Bax 蛋白表達量顯著高于10 nM組（P＜0.05），100、1 000 nM兩組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；Caspase-3 蛋白表達量分別為（0.26±0.06）、（0.76±0.15）、（1.15±0.16）依次顯著升高（P＜0.05），100、1 000 nM 組Caspase-3 蛋白表達量顯著高于10 nM組（P＜0.05），1 000 nM組Caspase-3蛋白表達量顯著高于100 nM 組（P＜0.05）。表明在1 000 nM范圍內(nèi)隨著濃度的增加細胞凋亡蛋白表達逐漸上升。見圖4。

2.5 利拉魯肽對ATF6 p50、CHOP的影響 對各濃度培養(yǎng)72 h的HCT116細胞進行蛋白質(zhì)印跡法檢測，結(jié)果顯示，10、100、1 000 nM 濃度利拉魯肽作用于細胞后，細胞中ATF6 p50 蛋白表達量分別為（0.69±0.11）、（0.96±0.09）、（1.20±0.08）；CHOP 蛋白表達量分別為（0.27±0.06）、（0.79±0.08）、（0.99±0.09），均顯著升高（P＜0.05）。100、1 000 nM 組ATF6 p50、CHOP蛋白表達量顯著高于10 nM組（P＜0.05），1 000 nM 組ATF6 p50、CHOP 蛋白表達量顯著高于100 nM組（P＜0.05）。見圖5。

3 討論

糖尿病作為慢性代謝障礙性疾病，可引起組織器官的異常，多項研究表明，2型糖尿病病人惡性腫瘤的發(fā)病率是正常人的2 倍，特別在胰腺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌中［7］。這可能與2 型糖尿病治療藥物及類似物影響腫瘤的增長相關(guān)［8］。GLP-1是一種由腸道L 細胞分泌的腸促胰素，其受體在胃、腸、胰腺等多種組織中分布［9］。利拉魯肽是一種新的GLP-1受體激動劑，GLP-1 主要通過胃、腸、胰腺及中樞神經(jīng)系統(tǒng)的GLP-1受體介導［10］。以往對GLP-1的研究主要在糖尿病領(lǐng)域，近年來發(fā)現(xiàn)利拉魯肽可通過抑制p38絲裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）信號通路抑制乳腺癌細胞的增長［11］。癌細胞無限增殖、凋亡減少是治療的主要挑戰(zhàn)，因此抑制癌細胞增殖，誘導其凋亡成為治療癌癥的新的切入點。結(jié)腸癌在我國的發(fā)病率逐漸升高，本研究通過對利拉魯肽作用后人結(jié)腸癌HCT116 細胞增殖、凋亡的觀察分析利拉魯肽對結(jié)腸癌細胞的作用。

研究報道，小鼠結(jié)腸癌CT26細胞表面存在GLP-1受體，GLP-1 受體激動劑通過激活GLP-1 受體減少糖原合成酶激酶3 的表達，抑制細胞的增殖［12］。細胞實驗證明GLP-1 受體激動劑可減少CT26 細胞集落的形成，提示GLP-1 受體激動劑抑制細胞的增殖［13］。本研究CCK-8 結(jié)果顯示，利拉魯肽作用后HCT116 細胞的增殖受到抑制，且呈時間劑量的依懶性，表明利拉魯肽對人結(jié)腸癌細胞的增殖有抑制作用，可有效控制癌細胞的無限增殖。以上實驗結(jié)果與體外實驗報道的GLP-1 受體激動劑-艾塞那肽改變小鼠結(jié)腸癌CT26細胞的形態(tài)，抑制細胞增殖結(jié)果一致［14］。越來越多研究表明，調(diào)控細胞周期可影響細胞體外增殖活性［15］。細胞周期檢測結(jié)果顯示利拉魯肽作用后細胞G2/M 期細胞比例減少，且隨著濃度的增加比例逐漸減少，提示利拉魯肽阻滯結(jié)腸癌細胞HCT116細胞停滯在G2/M期，細胞增殖周期異常，阻滯細胞無限增殖。

腫瘤細胞中ERS 可因不同的環(huán)境改變而發(fā)生，ERS 可促進癌細胞適應(yīng)應(yīng)激環(huán)境，抵抗某些化療藥物，但ERS 時間過長則會啟動凋亡通路，因此通過ERS促進細胞的凋亡是治療腫瘤的新靶點［16］。ATF6是ERS的重要靶點，其是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的Ⅱ型跨膜蛋白，C 端位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中，可感受ERS［17］。ERS 發(fā)生時ATF6 被運送到高爾基體水解，繼而釋放結(jié)構(gòu)域，激活CHOP，激活后的CHOP可促進細胞的凋亡［18］。本研究結(jié)果顯示利拉魯肽作用HCT116 細胞后，ATF6 p50、CHOP蛋白表達升高，細胞凋亡率顯著升高，且隨著濃度的增加而增加，提示利拉魯肽可通過促進ATF6 通路的激活發(fā)揮促凋亡作用，抑制腫瘤的發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)，ERS通過促進CT-26細胞的凋亡發(fā)揮抗癌作用［19］。肝癌HepG2 細胞中，ATF6 通路激活，促進CHOP的表達，進而誘導細胞的凋亡［20］。細胞凋亡過程涉及一系列基因的表達，高表達CHOP能夠抑制Bcl蛋白家族中抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，同時Bax蛋白表達增加，遷移至線粒體和核膜上，使線粒體膜通透性增加，激活Caspase-3分子，進而產(chǎn)生Caspase級聯(lián)反應(yīng)而誘發(fā)細胞凋亡［21］。本研究中蛋白質(zhì)印跡法檢測顯示凋亡因子Bax、Caspase-3 蛋白均顯著增加，提示利拉魯肽可能是通過ATF6通路調(diào)控Bcl-2/Bax 表達，促進Caspase-3 凋亡因子激活而實現(xiàn)對結(jié)腸癌細胞HCT116凋亡的誘導作用。

綜上所述，利拉魯肽能夠顯著抑制結(jié)腸癌細胞HCT116 體外增殖，引起細胞周期阻滯，通過激活ATF6通路促進細胞凋亡，發(fā)揮抗腫瘤作用。然而利拉魯肽誘導結(jié)腸癌細胞凋亡作用機制十分復雜，其抗腫瘤的具體作用機制尚需深入研究。

圖2 流式細胞術(shù)檢測不同濃度利拉魯肽組（A為0 nm、B為10 nm、C為100 nm、D為1 000 nm）結(jié)腸癌HCT116細胞周期圖3 不同濃度利拉魯肽（A為0 nm、B為10 nm、C為100 nm、D為1 000 nm）作用下結(jié)腸癌細胞凋亡情況檢測圖4 不同濃度利拉魯肽細胞中21KD蛋白（Bax）、半胱胺酸蛋白酶-3（Caspase-3）蛋白表達情況圖5 不同濃度利拉魯肽細胞中轉(zhuǎn)錄活化因子6通路蛋白ATF6 p50、CCAAT-增強子結(jié)合蛋白（C/EBP）同源蛋白（CHOP）蛋白表達情況