趙軍，孟西娜，侍佳，董蕊銳，李娜，王瑤，鄒萍，張婷，許耀輝

妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥（ICP）是一種妊娠期特有的以皮膚瘙癢和黃疸為主要臨床癥狀的疾病，其在中國的發(fā)生率約為4%～10%［1］。ICP 會引起較高的早產(chǎn)率以及胎兒窘迫、新生兒死亡等情況［2-3］。目前為止，ICP 的發(fā)病原因尚不十分清楚?？偰懼幔═BA）是現(xiàn)階段診斷ICP 的主要指標(biāo)，但其仍有不足［4］。尋找一個能夠及時準(zhǔn)確診斷ICP的靶標(biāo)是當(dāng)前ICP治療與監(jiān)測的方向。

微小RNA（microRNA，miRNA）是長度為18～23 nt的非編碼RNA序列，可參與多種生物學(xué)過程。血清miRNA 已被報道為妊娠并發(fā)癥的診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物，如妊娠糖尿病和先兆子癇［5-6］。本課題組前期分析了ICP 的血清miRNA 譜并驗證了部分差異表達(dá)miRNA［7］。本研究擬通過檢測ICP病人血清miR-3614-5p的表達(dá)并與臨床和生化參數(shù)進(jìn)行相關(guān)分析，來探討血清miR-3614-5p作為診斷ICP的候選生物標(biāo)志物的診斷價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 采集2017 年11 月至2018 年10 月于南京醫(yī)科大學(xué)附屬無錫婦幼保健院婦產(chǎn)科就診的ICP 孕婦79 例，均符合中華醫(yī)學(xué)會制訂的ICP 診療指南的標(biāo)準(zhǔn)（2015版）［8］。同時按隨機(jī)數(shù)字表法選取就診的健康孕婦79 例。要求各型肝炎病毒標(biāo)志物均為陰性，無心、肝、腎功能異常，無臨床急性或慢性疾病癥狀，未接受任何藥物治療。收集新鮮血液標(biāo)本，且標(biāo)本收集前均未做過任何治療。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會赫爾辛基宣言》的相關(guān)要求。

1.2 主要試劑與設(shè)備 RNA提取試劑盒（北京百泰克）；Prime Script TM RTⅡ逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa，大連寶生物）；SYBR Premix Ex TaqⅡ擴(kuò)增試劑盒（TaKaRa，大連寶生物）；PCR引物（上海生工生物工程有限公司）；ABI 7500 Fast 熒光定量PCR 儀器（ABI，美國）；UV-1900紫外分光光度計（日本島津）；Gel Doc XR+凝膠成像儀（Bio-Rad，美國）；XH600電泳儀（上海昕慧）。

1.3 RNA 提取及miRNA 表達(dá)檢測 血清miR-3614-5p檢測采用實時熒光定量PCR（qPCR）法。分別留存兩組病人靜脈血樣本5 mL，1 000 r/min 離心10 min，將上層血清轉(zhuǎn)移至無酶管再以10 000 r/min離心10 min 吸取上層血清于無酶管－80 ℃凍存?zhèn)溆?，按照試劑說明書，提取總RNA逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA。以miR-16作為內(nèi)參，采用相對定量2-ΔΔCT法計算兩組標(biāo)本miR-3614-5p水平［8］，以ΔCT值表示其相對表達(dá)量水平，ΔCT值越低，其相對表達(dá)量越高。引物均由上海生工生物工程有限公司合成。引物序列：miR-16 正向：5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACcgccaa-3′，反 向：5′ -GCTTGTAGCAGCACGTAAATATTG-3′；miR-3614-5p 正向：5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACctgaag -3′，反 向：5′TACTAAATCGGGCAGCCTTCAG-3′。采用SYBR Premix ExTaqII 試劑盒檢測每個擴(kuò)增循環(huán)后SYBR Green熒光信號水平，總反應(yīng)體系20 μL，反應(yīng)條件：95 ℃、10 min 預(yù)變性；95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，40 個循環(huán)。實驗重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 使用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析。數(shù)據(jù)不滿足正態(tài)分布，以M（P25，P75）表示，組間差異分析采用Mann-WhineyU非參數(shù)檢驗法。對ICP組與對照組結(jié)果繪制受試者工作曲線（ROC），ROC曲線下面積（AUC）的比較采用Hanley-McNeil 非參數(shù)檢驗法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ICP 組與對照組生化指標(biāo)以及臨床參數(shù)的比較 ICP 組在年齡，孕周上與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），在生化指標(biāo)TBA、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）水平上均差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 兩組孕婦生化指標(biāo)以及臨床參數(shù)的比較/M（P25，P75）

2.2 ICP 病人血清miR-3614-5p 的表達(dá)水平及與TBA 相關(guān)性 qPCR 檢測結(jié)果顯示，79 例ICP 病人血清miR-3614-5p的相對表達(dá)量［ΔCT：9.893（8.635，10.166）］較對照組［ΔCT：10.841（10.256，11.987）］增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Z＝6.00，P＝0.001）。且血清miR-3614-5p表達(dá)水平與TBA呈正相關(guān)（r＝0.311，P＜0.001），見圖1。

圖1 妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥（ICP）病人中miR-3614-5p與總膽汁酸（TBA）的相關(guān)性

2.3 ICP 病人血清miR-3614-5p ROC 曲線分析血清miRNA-1182 在ICP 組中AUC、靈敏度、特異度分別為0.864、79.0%和83.0%，見圖2。

3 討論

圖2 妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥（ICP）病人血清miR-3614-5p受試者工作特征曲線（ROC）

ICP 是一種特發(fā)于妊娠中晚期，以出現(xiàn)瘙癢及黃疸為主要臨床癥狀的疾病，它對母體的影響主要表現(xiàn)在頑固性瘙癢和易于產(chǎn)后出血而導(dǎo)致產(chǎn)婦死亡率增加，對胎兒的影響更甚，可導(dǎo)致早產(chǎn)、胎糞污染、新生兒窒息、新生兒死亡、新生兒神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥等［9］。目前，ICP 的發(fā)病原因及發(fā)病機(jī)制尚不明確，大量的流行病學(xué)研究以及臨床觀察實驗室研究認(rèn)為可能與遺傳、激素、基因突變、營養(yǎng)和環(huán)境因素有關(guān)。ICP 的診斷也沒有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，中華醫(yī)學(xué)會制訂的ICP 診療指南（2015 版）指出TBA 是目前診斷和檢測ICP 的主要指標(biāo)，但皇家婦產(chǎn)科醫(yī)師學(xué)會（RCOG）指南并不十分認(rèn)同［8］。ICP 既難以預(yù)料又無法準(zhǔn)確監(jiān)測，帶給廣大產(chǎn)科工作者巨大困惑的同時，也給孕產(chǎn)婦及家屬帶來極大的精神創(chuàng)傷，因此極易引起醫(yī)療糾紛。選取更靈敏和特異的指標(biāo)對ICP 病人盡早進(jìn)行診斷以及改善預(yù)后具有顯著的意義。

microRNAs 是一類內(nèi)源性的短序列非編碼小分子，大量研究表明其在細(xì)胞分化、增殖和生長，細(xì)胞凋亡，血管生成，炎癥等生理和病理過程中起著重要作用［10］。血清miRNA 表達(dá)穩(wěn)定并易于檢測，是一種非常有前景的診斷標(biāo)志物［11］。自2008 年Chim 研究組首次提出循環(huán)miRNA 可作為妊娠相關(guān)并發(fā)癥的生物標(biāo)志物起，大量的miRNAs 被鑒定并成為妊娠疾病的生物標(biāo)志物［5-6］。本研究在前期ICP 血清miRNA 譜的基礎(chǔ)上，挑選miR-3614-5p 進(jìn)行臨床驗證，發(fā)現(xiàn)其在ICP 病人中較對照組高表達(dá)，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義，在ICP 孕婦組ROC 曲線下AUC、靈敏度、特異度分別為0.864、79%和83%，提示miR-3614-5p 是診斷和評估ICP 病人的理想標(biāo)志物之一。

眾所周知，血清TBA是膽固醇被肝臟分解后進(jìn)入肝腸循環(huán)出現(xiàn)的物質(zhì)，其代謝情況與肝臟功能障礙、實質(zhì)損傷關(guān)系密切。孕中晚期雌激素波動幅度大，膽鹽代謝障礙，影響肝細(xì)胞功能，進(jìn)而血清TBA異常升高、肝功能指標(biāo)異常，這也是血清TBA 用于檢測ICP 的原理［12］。但miR-3614-5p 與ICP 的相關(guān)研究還是空白。但在生物信息學(xué)分析中，我們發(fā)現(xiàn)miR-3614-5p 主要調(diào)控的功能有脂質(zhì)磷酸化、細(xì)胞黏附、細(xì)胞凋亡、蛋白激酶結(jié)合等，可能參與MAPK信號通路，代謝途徑，Wnt 信號通路等生物過程［7］。尤其是MAPK 信號通路與脂類代謝密切相關(guān)，而脂類代謝是已明確的ICP發(fā)病機(jī)制之一。據(jù)此我們推測miR-3614-5p 在ICP 發(fā)病過程中也發(fā)揮了一定的功能作用，這還需要進(jìn)一步的實驗研究。

綜上所述，本研究驗證了ICP 病人血清中高表達(dá)的miR-3614-5p，可作為檢測ICP 的一種新型靶標(biāo)，具有一定的臨床應(yīng)用價值。