李曉琳，劉永欣

在急性心肌梗死（AMI）病人發(fā)病過程中，炎癥反應發(fā)揮著重要作用，冠狀動脈斑塊纖維帽破裂后，壞死的組織會釋放炎性因子，引發(fā)炎癥反應，致使血小板聚集，導致血栓發(fā)生，最終引發(fā)AMI［1-2］。AMI 發(fā)生后，心肌細胞缺氧、壞死，導致心肌發(fā)生纖維化改變，進而引發(fā)心肌重構(gòu)［3］。此外，AMI 發(fā)生后，冠狀動脈處于阻塞狀態(tài)，心肌細胞缺氧、缺血而壞死，并釋放出細胞內(nèi)物質(zhì)，導致炎癥反應發(fā)生，引發(fā)心肌纖維化改變。心肌發(fā)生纖維化改變后，室壁張力增大，可加速心功能受損［4-5］。因此，對于AMI病人，臨床通常會予以抗炎癥反應、心肌纖維化改變方面的干預，其中，他汀類藥物被廣泛應用，以往研究多側(cè)重他汀類藥物對心肌炎癥的作用，關于他汀類藥物抗纖維化、抗炎纖維化方面機制的研究則相對較少。為進一步探討阿托伐他汀對AMI 大鼠模型心肌炎癥、纖維化改變的影響及可能機制，本研究于2017年6月至2018年1月以大鼠為對象，分為三組展開研究，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 （1）大鼠。選取雄性大鼠70只，購于北京維通利化實驗動物技術有限公司，醫(yī)學實驗動物合格證號為SCXK（京）2008—0003。級別為SPF級，體質(zhì)量范圍為（210.23±25.76）g，圈養(yǎng)，飼料、水定時添加，飼養(yǎng)室溫度控制為22～24 ℃，濕度控制為45%～55%。本研究符合一般動物試驗倫理學要求。

（2）試劑與設備。阿托伐他汀購于輝瑞制藥有限公司，產(chǎn)品批號為20160402。Masson 混合染色液：1.0 g 麗春紅，0.5 g 酸性復紅，150.0 mL 冰醋酸（0.25%），1.0 g 橙黃，混勻。甲苯胺藍染色液：0.2 g甲苯胺藍，于200.0 mL醋酸（0.2%）中溶入。蘇木精-伊紅（HE）染色：蘇木素，A 液，于10.0 mL 無水乙醇中溶入1.0 g 蘇木素；B 液，于200.0 mL 蒸餾水中溶入20.0 g硫酸鋁鉀；混合A液、B液，置入水浴鍋中加熱至沸騰，將0.5 g黃色氧化汞加入，混勻，可見溶液為深紫色后，迅速于冷水中置入，以紗布過濾，棄沉渣。使用前，于其中加入冰醋酸4.0 mL。伊紅：于100.0 mL乙醇（95%）中加入1.0 g伊紅，混勻，通過紗布過濾，棄沉渣。甲醛編號為100100008，甲醇編號1000141108，無水乙醇編號是10009218，均由上海國藥集團化學試劑有限公司提供。1%的鹽酸乙醇由100.0 mL乙醇（75%）中加入1.0 mL鹽酸制取。甲醛溶液購于湖南爾康制藥股份有限公司，產(chǎn)品批號為1 326064；Notch1 單克隆抗體購于美國CST 公司，轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）單克隆抗體購于美國abcom公司。

1.2 研究方法

1.2.1 建模方法 實驗前12 h，大鼠均禁食，麻醉后，于頸部、胸前進行備皮，固定大鼠頭部、四肢，使其腹部朝上，消毒處理手術區(qū)域。通過鑷子將頸部正中的皮膚提起，剪開，注意避開甲狀腺，對頸部的肌肉展開鈍性分離處理，牽拉使氣管暴露，牽拉大鼠舌頭使聲門暴露，行氣管插管予以輔助呼吸。對大鼠胸前手術區(qū)域?qū)嵤┫咎幚?，作一橫切口于左側(cè)胸部第3、4 肋間，分離肌肉層，撐開胸腔，確定心臟位置，撕開心包膜，暴露心臟，確定左冠狀動脈前降支位置，經(jīng)左心耳下2～3 mm 處置入6-0 帶針線穿過前降支，對前降支進行結(jié)扎，處理胸腔，縫合切口，將氣管插管拔出，等待大鼠結(jié)扎。本研究共對70只大鼠進行建模，死亡4只，成功率為94.29%（66/70），最終選擇較為成功的60只進行研究。

1.2.2 大鼠分組 按隨機數(shù)字表法將60只大鼠分為三組。對照組：建模時僅為前降支進行分離，未結(jié)扎；AMI組：對前降支進行分離與結(jié)扎；治療組：對前降支進行分離與結(jié)扎后，予以阿托伐他汀，10 mg/d［6］。

1.2.3 觀測指標 觀測指標為 （1）炎性因子：腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β），（2）超聲心動圖檢查結(jié)果，（3）病理學診斷結(jié)果，（4）Notch1蛋白、TGF-β水平。方法分別為：

（1）炎性因子及Notch1蛋白、TGF-β水平。實驗后5 d，于大鼠內(nèi)眥處采集血液1.0 mL，置入試管，通過離心機實施離心處理，4 000 r/min，吸取1.0 μL上層血清，保存于-80 ℃環(huán)境中。取250.0 μL 大鼠炎性因子標準品，加入等量稀釋液。將250.0 μL 標準品稀釋液加入EP管內(nèi)，通過高濃度的標準品實施1∶1 稀釋，15 min 內(nèi)，分別將50.0 μL 檢測緩沖液、樣本加入，并于每個樣本孔中加入50.0 μL的稀釋液，于室溫內(nèi)孵育2 h，并進行6次洗滌。對辣根過氧化物酶標記的鏈酶親和素進行稀釋后，分別加入至每個樣本孔內(nèi)，100.0 μL，于室溫下進行45 min 孵育，洗滌6次。分別于每個樣本孔中加入100.0 μL顯色底物，于室溫下孵育30 min，依據(jù)顯色情況加入終止液，100.0 μL，30 min 內(nèi)，于450 nm 波長上對吸光度（OD）值進行檢測。

（2）超聲心動圖檢查。通過Vevo2100超高分辨小動物超聲影響系統(tǒng)實施檢查，主要觀察心臟形態(tài)，并測定左室射血分數(shù)（LVEF）、左室短軸短縮率（LVFS）。

（3）病理學檢查。安樂死處理大鼠，取出其心臟組織，置入10%的甲醛溶液中，30 d，通過石蠟包埋處理。①HE 染色。取4 μm 的切片，通過二甲苯實施兩次脫蠟處理，每次5 min，以100%的乙醇進行2 min 清洗，再分別以95%乙醇、80%乙醇清洗1 min，采用蒸餾水清洗2 min。通過蘇木素進行5 min的染色處理，以自來水沖洗，于鹽酸乙醇中提插30 s，置入59 ℃溫水中，5 min 后取出，吸干水，置入伊紅液中，2 min，于95%乙醇中浸泡2 次，每次5 min，置入100%乙醇中，浸泡1 min，置入3∶1的二甲苯石碳酸中浸泡1 min，于二甲苯中浸泡2 次，每次1 min，取出，以中性樹脂進行封固。②Masson 染色。取切片4 μm，分別以自來水、蒸餾水清洗，置入Masson復合染液中，15 min，采用0.2%的醋酸進行1 min清洗，通過0.1%磷塢酸進行4 min 分化處理，以0.2%冰醋酸清洗2 次，共1 min，浸入甲苯藍染染液中，10 s，取出以清水沖洗，以0.2%冰醋酸清洗2次，共1 min，分別以95%乙醇、無水乙醇沖洗，以二甲苯實施透明處理，采用中性的樹膠進行封固。

1.3 統(tǒng)計學方法 本研究所涉及數(shù)據(jù)均通過SPSS 20.0 軟件處理。以表示計量資料，多組間比較為單因素方差分析+多重比較LSD-t 檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 三組炎性因子及超聲心動圖檢查結(jié)果比較整體分析（單因素方差分析）和多重比較（LSD-t 檢驗）知：各指標整體差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。AMI組、治療組大鼠TNF-α、IL-1β水平高于對照組，治療組大鼠TNF-α、IL-1β 低于AMI 組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。AMI組、治療組大鼠LVEF、LVFS均低于對照組，且治療組高于AMI組。詳見表1。實驗后，AMI 組、治療組大鼠左室室壁均較對照組變薄、運動減弱，見圖1。

2.2 對比三組病理學檢查結(jié)果 （1）HE 染色。HE染色下，對照組大鼠心肌細胞排列整齊，可見清晰的閏盤結(jié)構(gòu)；AMI 組梗死區(qū)顯著較薄，心肌細胞減少，可見纖維細胞，細胞排列紊亂；治療組介于對照組、AMI組之間。見圖2。

表1 三組大鼠炎性因子及超聲心動圖檢查結(jié)果比較/

表1 三組大鼠炎性因子及超聲心動圖檢查結(jié)果比較/

注：TNF-α為腫瘤壞死因子-α，IL-1β為白細胞介素-1β，LVEF為左室射血分數(shù)，LVFS為左室短軸短縮率。a、b分別為與對照組、AMI組相比，P＜0.05

（2）Masson 染色。對照組大鼠可見心肌組織正常，膠原纖維分布不明顯；AMI組梗死區(qū)可見大量膠原纖維組織，室壁較??；治療組可見少量膠原纖維分布。見圖3。

2.3 對比三組Notch1蛋白、TGF-β水平 AMI組、治療組Notch1蛋白、TGF-β水平較對照組高，治療組Notch1蛋白、TGF-β水平低于AMI組，見圖4。

3 討論

既往臨床上多將AMI 歸類為代謝類疾病，甚少考慮炎癥病變，但在AMI病情發(fā)生、發(fā)展的整個過程中，心肌炎癥反應均有參與［7］。正常情況下，心臟中有定居型、聚集型的巨噬細胞存在，AMI 發(fā)生后，定居型的巨噬細胞會增多，脾臟對聚集型巨噬細胞的釋放增多，導致炎癥細胞、中性粒細胞、單核細胞于梗死區(qū)聚集，引發(fā)炎癥反應，導致心肌損傷速度加快［8-9］。因此，對于AMI的干預，需注重抗炎、抗心肌纖維化等方面。研究指出，AMI發(fā)生48 h后，病人血液中單核細胞會大量分泌TNF-α、IL-1β，TNF-α、IL-1β由巨噬細胞合成，可對內(nèi)皮細胞黏附分子產(chǎn)生誘導作用，使其合成增多，致使大量炎癥細胞滲入心肌梗死部位，加重心肌損傷［10］。另有研究指出，TNF-α、IL-1β過度表達可導致細胞毒性產(chǎn)生，導致心肌細胞重構(gòu)，致使大量膠原蛋白聚集于細胞外，即發(fā)生心肌纖維化改變，進而導致心室變薄，心功能下降［11］。

本研究，AMI組、治療組大鼠TNF-α、IL-1β水平高于對照組。提示，急性AMI 伴有心肌炎癥反應。本研究AMI組、治療組大鼠LVEF、LVFS均較對照組低。對照組大鼠心肌細胞排列整齊，心肌組織分布正常，AMI組大鼠心肌細胞減少、梗死區(qū)可見大量膠原纖維組織。本研究對大鼠進行建模時，對AMI組、治療組大鼠前降支實施結(jié)扎處理，使前降支的血流被阻斷，導致前壁發(fā)生心肌梗死，因此行超聲心動圖檢查時，可見AMI 組、治療組大鼠左心室的前壁變薄，心腔增大，心功能顯著下降。AMI發(fā)生后3～5 d即可發(fā)生心肌纖維化改變，其改變主要經(jīng)歷三個過程：其一，急性期，梗死的心肌區(qū)域內(nèi)大量中性粒細胞、單核細胞聚集，可清除壞死心肌細胞，巨噬細胞吞噬死亡的中性粒細胞，巨噬細胞分泌抗炎因子開抑制炎癥；其二，增生階段，受損區(qū)域有大量成纖維、血管內(nèi)皮細胞遷移，可形成瘢痕；其三，瘢痕形階段，細胞成分不斷凋亡，剩余的膠原基質(zhì)形成瘢痕［12-13］。因此，在病理學檢查中，AMI建模后大鼠梗死區(qū)顯著較薄，心肌細胞減少，可見纖維細胞，細胞排列紊亂，梗死區(qū)可見大量膠原纖維組織。進一步提示，AMI發(fā)生后，大鼠心肌會發(fā)生纖維化改變，心功能下降。

本研究予以治療組大鼠阿托伐他汀后，治療組TNF-α、IL-1β 均低于AMI 組。提示，阿托伐他汀可對AMI大鼠心肌炎癥反應、纖維化改變產(chǎn)生抑制作用。托伐他汀是一種臨床常用的他汀類藥物，而大量臨床研究表明，他汀類藥物不僅具有調(diào)脂、降血壓等作用，而且具有降低炎癥反應、氧化應激反應、改善血管內(nèi)皮細胞功能、抑制左心室重構(gòu)等多方面的作用［14-15］。本研究，AMI組、治療組Notch1蛋白、TGF-β水平較對照組高，治療組Notch1蛋白、TGF-β水平低于AMI 組?？梢姡珹MI 發(fā)生后，大鼠Notch1 蛋白、TGF-β水平上升，經(jīng)予以阿托伐他汀干預后，Notch1蛋白、TGF-β水平下降，表明阿托伐他汀可降低水平Notch1蛋白、TGF-β水平。進一步表明，在抑制AMI大鼠心肌炎癥反應、心肌纖維化改變方面，阿托伐他汀可能通過以下兩個方面發(fā)揮機制：（1）阻斷Notch1信號通路。炎癥反應的發(fā)生與notch1信號通路緊密相關，巨噬細胞分化過程中，Notch1導致大量M1 型巨噬細胞分化，促使炎癥細胞因子釋放，引發(fā)炎癥反應［16-17］。而阿托伐他汀可將Notch1信號通路阻斷，達到抑制炎癥反應的效果，從而使心肌重構(gòu)減輕。（2）抑制TGF-β。TGF-β 在心肌重構(gòu)、心肌纖維化改變中有重要作用，可誘導心臟成纖維細胞遷移，激活促纖維化程序，阿托伐他汀可降低TGF-β水平，達到抑制心肌重構(gòu)反應、纖維化改變的作用。在AMI大鼠中，通過上述兩方面的機制，阿托伐他汀可有效抑制炎癥，使纖維化改變減輕，進而有效改善心功能。而阿托伐他汀抑制Notch1 信號通路、TGF-β的表達的機制可能為抑制Notch-1-TGF-β-smads 通路，使炎癥、纖維化指標表達減少。

綜上，AMI伴有心肌炎癥反應，且心肌會發(fā)生纖維化改變，而阿托伐他汀可對心肌炎癥反應基纖維化改變產(chǎn)生抑制作用。但本研究所選大鼠樣本量不大，仍需進一步增加樣本量展開研究。

圖1 三組大鼠超聲心動圖檢查結(jié)果：A為對照組；B為AMI組；C為治療組圖2 三組大鼠HE染色結(jié)果（×200）：A為對照組；B為AMI組；C為治療組圖3 三組大鼠Masson染色結(jié)果（×200）：A為對照組；B為AMI組；C為治療組圖4 三組Notch1蛋白、轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）水平（蛋白質(zhì)印跡法）