楊娟，郭麗娜，王單單，王瑞

流行病學研究證實，糖尿病病人高血壓的發(fā)病率顯著高于非糖尿病病人，40%～50%的2型糖尿病病人患有高血壓，而非糖尿病病人高血壓的發(fā)病率為20%，當糖尿病合并廣泛腎損害時，幾乎100%患有高血壓［1］。經(jīng)典名方“三草降壓湯”即能降低糖尿病合并高血壓病人的血壓，也能有效改善血糖、血脂水平，達到滋養(yǎng)肝陰、平抑肝陽的療效［2］，主要有夏枯草、益母草和龍膽草組成。夏枯草是唇形科植物夏枯草（Prunella Vulgaris L.）的干燥果穗，主要含有黃酮類、酚酸類、三萜及其苷類、固醇及其苷類、揮發(fā)油等成分，具有降血糖、降血壓、抗菌、抗炎、抗病毒等生物活性［3］；益母草是唇形科植物益母草［Leonurusartemisia（Lour.）S.Y.Hu］的新鮮或干燥的地上部分，主要含有生物堿類、二萜類、環(huán)形多肽類、黃酮類等成分，具有溶栓、降血脂、抑制血小板聚集、改善微循環(huán)、減少細胞內(nèi)鈣超載等藥理作用［4］；龍膽草（Gentiana scabra Bunge.）是龍膽科龍膽屬多年生草本植物條葉龍膽等的根和莖，主要含有苷類、生物堿類、黃酮類等成分，具有利尿、抗菌、抗腫瘤的藥理活性。然而三草降壓湯抗糖尿病合并高血壓的活性成分和分子作用機制鮮有報道。因此，本研究于2019年3—5月從網(wǎng)絡(luò)藥理學的視角，采用網(wǎng)絡(luò)拓撲分析和信號通路富集分析三草降壓湯抗糖尿病合并高血壓潛在的分子機制，為三草降壓湯抗糖尿病合并高血壓的進一步探索提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 TCMSP 中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫和分析平臺（http：//ibts.Hkbu.Edu/.hk/ LSP/ tcmspsearch/），CTD毒性與基因比較數(shù)據(jù)庫（http：//ctdbase.org/），TTD藥物靶標數(shù)據(jù)庫（http：//bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/），DrugBank生物信息學和化學信息學數(shù)據(jù)庫（https：//www.drugbank.ca/），PharmGKB 遺傳藥理數(shù)據(jù)庫（https：//www.pharmgkb.org/），DAVID 生物信息學資源數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/），String 在線分析平臺（https：//string-db.org/），UniprotKB 數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/），OmicShare在線作圖軟件（https：//www.omicshare.com/user/invite.php/），Cytoscape 3.7軟件，軟件均運行于Windows操作系統(tǒng)平臺。使用的相關(guān)軟件均為免費開源軟件。

1.2 方法

1.2.1 三草降壓湯活性成分及其靶點篩選 中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫及分析平臺TCMSP 主要預(yù)測中藥及其復方化學成分的吸收、分布、代謝和排泄?；贑TD、TCMSP和中國知網(wǎng)數(shù)據(jù)庫搜索三草降壓湯相關(guān)化學成分174個，夏枯草60個，益母草51個，龍膽草63個。結(jié)合PubMed、中國知網(wǎng)、萬方等數(shù)據(jù)庫報道，根據(jù)藥物代謝動力學相關(guān)參數(shù)把藥物口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30%和藥物相似性（Drug Similarity，DL）≥0.18 作為三草降壓湯活性成分篩選的條件，一般認為生物利用度越大其生物利用度越好，DL≥0.18 的分子類藥性較好［5］。篩選三草降壓湯中出符合條件的化合物，分別采用TCMSP 數(shù)據(jù)庫和Uniprot 數(shù)據(jù)庫獲得符合條件化合物的作用靶點和相關(guān)靶點人的基因名稱。

1.2.2 糖尿病合并高血壓相關(guān)靶點檢索 CTD、TTD、DrugBank 和PharmGKB 數(shù)據(jù)庫是公認的疾病靶點在線數(shù)據(jù)庫，能夠提供基因和有關(guān)化合物相互作用的網(wǎng)絡(luò)模型，化學成分與基因的關(guān)系以及化學成分在體內(nèi)運輸和積累的數(shù)據(jù)庫。打開每個數(shù)據(jù)庫，分別將“diabetic mellitus”“hypertension”作為檢索詞在數(shù)據(jù)庫檢索，獲得與糖尿病合并高血壓相關(guān)的作用靶點。

1.2.3 關(guān)鍵靶點篩選 分別將獲得的三草降壓湯的相關(guān)靶點和糖尿病合并高血壓的相關(guān)靶點輸入Cytoscape 3.7 軟件，依次生成“成分-靶點”和“疾病-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖，采用Cytoscape 3.7 軟件的Merge 插件合并“成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖和“疾病-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖，刪除重復的靶點和邊，獲得“成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖，初步獲得三草降壓湯抗糖尿病合并高血壓的潛在共同作用靶點。

1.2.4 共同作用靶點的相互作用研究 將三草降壓湯活性成分和糖尿病合并高血壓的共同作用靶點輸入String 在線分析平臺，選擇多倍蛋白，生成“蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)”相互作用關(guān)系（Protein-Protein Interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)圖。PPI是尋找靶點之間相互作用關(guān)系的重要途徑，能夠反應(yīng)蛋白質(zhì)之間的相互作用關(guān)系。

1.2.5 GO 富集分析 DAVID 生物學信息數(shù)據(jù)庫主要基于WEB服務(wù)器進行基因功能富集分析，是在線的功能注釋系統(tǒng)。其主要包括分析工具和生物學知識庫，可用于靶點功能、信息通路、疾病分析等。將共同作用靶點輸入到DAVID數(shù)據(jù)庫中，以人的基因作為背景進行GO富集分析。

1.2.6 KEGG通路富集分析 采用DAVID生物學信息數(shù)據(jù)庫中的京都基因和基因組百科全書通路（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes pathway，KEGG）分析和輸入靶點有關(guān)的生物信息通路，并利用統(tǒng)計學方法對靶點和相關(guān)生物信息通路進行分析?？梢愿鶕?jù)P＜0.05且生物信息通路中靶點的數(shù)量為2個或2個以上為重要通路，進而重點分析。因此通過DAVID生物學信息注釋數(shù)據(jù)庫對三草降壓湯活性成分和糖尿病合并高血壓的72共同作用靶點進行KEGG 通路富集分析。分析結(jié)果以P＜0.05 且生物信息通路中靶點數(shù)量≥2的為顯著的通路。

2 結(jié)果

2.1 三草降壓湯活性成分篩選 通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫共獲得174 個三草降壓湯的已知成分，夏枯草成分有60 個，益母草成分有51 個，龍膽草成分有63個；其中OB≥30%的成分有61個，占總成分35.06%；DL≥0.18 的有113 個，占總成分64.94%。符合OB≥30%和DL≥0.18 條件化合物共有28 個，占總成分16.09%，這28個成分的口服生物利用度和類藥性良好，刪除4 個重復成分。此外龍膽酸和四乙酰龍膽苦苷沒有檢索到相關(guān)靶點。因此，本研究共納入三草降壓湯的22個成分作為候選化合物，見表1。

2.2 關(guān)鍵靶點分析 基于CTD、TCMSP和中國知網(wǎng)數(shù)據(jù)庫共篩選出三草降壓湯活性成分作用靶點247個。通過查找CTD在線數(shù)據(jù)庫，獲得糖尿病合并高血壓相關(guān)的作用靶點，刪除重復的靶點后，共獲得731個與糖尿病合并高血壓有關(guān)的靶點，此731個靶點是糖尿病相關(guān)靶點和高血壓相關(guān)靶點之和。采用Cytoscape 3.7 軟件構(gòu)建“成分-靶點-疾病”相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖，直觀的展現(xiàn)活性成分、靶點和疾病的相互作用關(guān)系，如圖1 所示。圖1 中圓形代表三草降壓湯的化學成分，正方形代表作用靶點，三角形代表疾病，節(jié)點代表活性成分或者作用靶點，邊代表活性成分和作用靶點之間的相互作用關(guān)系，節(jié)點的大小與對應(yīng)成分的重要程度成正相關(guān)，節(jié)點越大該成分的重要程度越顯著。分析“成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖發(fā)現(xiàn)：槲皮素的作用靶點最多，為143 個；山柰酚、木樨草素、β-谷甾醇、花生四烯酸、半日花烷型二萜的潛在作用靶點數(shù)次之，分別為57、53、35、34、31個；7-豆甾-烯醇、豆甾醇葡萄糖苷、甜菜黃嘌呤Ⅰ的潛在作用靶點最少，均為2 個。三草降壓湯活性成分和糖尿病合并高血壓共同的作用靶點共有75個，如圖1 中間所示，包括白細胞介素-6（IL-6）、超氧化物歧化酶1（SOD1）、腫瘤壞死因子（TNF）等。說明了中藥一成分多靶點及一靶點多成分的復雜作用關(guān)系，驗證了三草降壓湯多成分、多靶點整體協(xié)作發(fā)揮作用的特點。

2.3 靶點相互作用關(guān)系分析 通過String數(shù)據(jù)庫構(gòu)建三草降壓湯活性成分作用靶點和糖尿病合并高血壓病共同作用靶點的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖。除了PDE3A（磷酸二酯酶3A）、TRPM5（味覺相關(guān)蛋白）和KCNU1（T 淋巴細胞分化蛋白）以外，IL-6、SOD1、TNF等72 個共同作用靶點關(guān)系緊密，因此PDE3A 不再納入研究。靶點之間相互作用關(guān)系見圖2。

2.4 關(guān)鍵靶點GO 富集分析 采用DAVID 數(shù)據(jù)庫的GO 富集分析功能，對三草降壓湯和糖尿病合并高血壓的72 個共同作用靶點進行富集分析。分析結(jié)果如圖3，4 所示，共獲得到318 個GO 條目，其中包括細胞凋亡、細胞代謝、免疫應(yīng)答、細胞轉(zhuǎn)運、細胞增殖、炎癥反應(yīng)等243條生物過程（Biological Process，BP），細胞結(jié)合、受體結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子活性、細胞因子活性、脂質(zhì)結(jié)合、蛋白結(jié)合等33 條分子功能（Molecular Function，MF），細胞間隙、細胞膜、細胞質(zhì)基質(zhì)、細胞表面、細胞質(zhì)膜、細胞質(zhì)、細胞器膜等42 條細胞組成（Cell Component，CC）。說明72 個共同作用靶點參與細胞的組成并影響細胞的功能，調(diào)控其中一個或多個作用靶點就可以影響相應(yīng)疾病發(fā)生和發(fā)展。

表1 三草降壓湯主要活性成分

圖1 三草降壓湯抗糖尿病合并高血壓“成分-靶點-疾病”相互作用網(wǎng)絡(luò)圖析：A為生物過程，B為分子功能，C為細胞組成

圖2 三草降壓湯活性成分共同作用靶點相互作用分析

圖3 三草降壓湯抗糖尿病合并高血壓共同作用靶點GO高集分析各組分所占比例

圖4 三草降壓湯抗糖尿病合并高血壓共同作用靶點GO富集分

2.5 關(guān)鍵靶點KEGG 通路富集分析 采用DAVID在線數(shù)據(jù)庫對三草降壓湯和糖尿病合并高血壓的相同靶點進行信號通路注釋，得到靶點參與的所有信號通路36條。信號通路以P＜0.05且通路中靶點的個數(shù)≥3 個的為顯著通路。共富集得到21 條顯著通路，主要包括癌癥信號通路、細胞凋亡、細胞因子受體相互作用、脂肪因子信號通路、小細胞肺癌、T細胞受體信號通路、絲裂原活化蛋白激酶信號通路、Toll 樣受體信號通路等。癌癥信號通路中有23個作用靶點，基因在細胞因子受體相互作用有12個作用靶點，信號通路包含關(guān)鍵靶點個數(shù)如表2所示。一個基因參與多條信號通路，如圖5所示，八邊形代表信號通路，菱形代表參與信號通路的靶點，節(jié)點的大小越大則該節(jié)點越重要，邊代表兩個節(jié)點之間的聯(lián)系。表明這些通路之間相互影響，參與機體的炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答、信號轉(zhuǎn)導等過程，影響細胞的增殖、分化、代謝、凋亡等多種生物學功能。

圖5 三草降壓湯抗糖尿病合并高血壓“信號通路-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖

3 討論

中醫(yī)認為糖尿病屬于“消渴病”的范疇，飲食不節(jié)、過食辛辣厚味的食物均能夠?qū)е缕⑽笣駸醿?nèi)生、胃腸結(jié)熱、熱邪傷陰，最后演變成“消渴病”［6］。糖尿病的發(fā)病機制比較復雜，主要有血流動力學改變、氧化應(yīng)激反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、細胞凋亡、細胞增殖、多通路激活等多個方面，如長期高糖刺激下，糖基化終產(chǎn)物增多，從而激活蛋白激酶C（PKC）、核因子κB（NF-κB）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）等一系列相關(guān)信號通路，進一步激活轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）等信號通路，促進細胞外基質(zhì)的合成［7］。研究報道，細胞核核內(nèi)荷爾蒙受體（PPARs）屬于核受體家族的亞族，通過與相應(yīng)配體結(jié)合調(diào)節(jié)基因表達，在肥胖、胰島素抵抗、冠心病等代謝性疾病的發(fā)生及發(fā)展中具有重要作用。據(jù)流行病學研究報道，C 反應(yīng)蛋白（CRP）和高血壓等心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展有著密切關(guān)系，認為他是一個被低估而未利用的心血管病的危險因子［8］。糖尿病病人持續(xù)的高血糖將刺激IL-6分泌增加，從而導致大量的CRP產(chǎn)生。中醫(yī)藥在治療糖尿病及其并發(fā)癥等慢性疾病方面具有獨特的優(yōu)勢。三草降壓湯既能有效改善血糖又能調(diào)節(jié)血壓，對糖尿病合并高血壓具有較好的治療作用。發(fā)現(xiàn)三草降壓湯中化學成分顯著程度較顯著的有槲皮素、山柰酚、木樨草素、β-谷甾醇、花生四烯酸、半日花烷型二萜等。目前已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn)槲皮素是一種具有抗腫瘤、抗炎、抗菌、抗病毒、降糖降壓、保護心血管、清除自由基等多種生物活性的多羥基黃酮類化合物［9-10］；山柰酚是具有抗氧化、抗腫瘤、抗骨質(zhì)疏松、降血糖、調(diào)節(jié)免疫等多種生物活性的黃酮醇類化合物［11］；木樨草素屬于四羥基黃酮類化合物，是天然黃酮類化合物的代表性成分，具有抗腫瘤、抗炎、降血壓、舒張血管、抗動脈粥樣硬化、抗菌抗病毒等多種藥理活性［12-13］；花生四烯酸是一種重要的人體必需脂肪酸，具有促進腦生長發(fā)育、舒張血管、參與造血、調(diào)節(jié)免疫、抗炎、調(diào)節(jié)神經(jīng)內(nèi)分泌等生物學功能［14-17］。

表2 三草降壓湯抗糖尿病合并高血壓21條顯著信號通路

本研究獲得三草降壓湯抗糖尿病合并高血壓的72 個靶點，其中腫瘤抑制蛋白（TP53）、細胞核因子κB p65蛋白（RELA）、表皮生長因子受體（EGFR）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGFA）、白細胞介素-1B（IL-1B）、糖原合成酶激酶（GSK3B）、TNF、B細胞淋巴瘤/白血病-2基因（BCL2）在網(wǎng)絡(luò)圖中的顯著性比較大，預(yù)測可能是三草降壓湯抗糖尿病合并高血壓的關(guān)鍵靶點。關(guān)鍵靶點參與2型糖尿病、小細胞肺癌、癌癥信號通路、脂肪細胞因子信號通路、T細胞受體信號通路、Toll樣受體信號通路、絲裂原活化蛋白激酶信號通路等21條通路。其中2型糖尿病、脂肪細胞因子信號通路、癌癥信號通路在網(wǎng)絡(luò)圖中的顯著性較大，可能在三草降壓湯抗糖尿病合并高血壓中發(fā)揮重要作用。網(wǎng)絡(luò)圖中靶點之間復雜的作用關(guān)系，表明靶點之間相互作用、相互影響，最終影響疾病的發(fā)生發(fā)展。通過共同作用靶點通路富集分析發(fā)現(xiàn)即富集了脂肪因子信號通路等與糖尿病有關(guān)的信號通路，又富集了小細胞肺癌、癌癥等多條信號通路。預(yù)示著疾病之間是相互作用、相互影響、相互關(guān)聯(lián)的。

綜上所述，本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學系統(tǒng)地探討了三草降壓湯糖尿病合并高血壓的復雜分子網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，體現(xiàn)了三草降壓湯是通過“多成分-多靶點-多途徑”的整體協(xié)同發(fā)揮療效。為深入研究三草降壓湯抗糖尿病合并高血壓的分子機制提供依據(jù)，也為研究三草降壓湯抗糖尿病合并高血壓的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供借鑒。