劉靜，李湘利，苗仙仙，魏海香，趙敏，薛麗萍

(濟(jì)寧學(xué)院 生命科學(xué)與工程系，濟(jì)寧市特色農(nóng)產(chǎn)品高值化加工工程技術(shù)研究中心，山東 曲阜 273155)

自Harman提出自由基理論以來，機(jī)體氧化產(chǎn)生的自由基與衰老、疾病的關(guān)系備受關(guān)注[1]。自由基過?？善茐臋C(jī)體功能和蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)等生物大分子結(jié)構(gòu)，引發(fā)關(guān)節(jié)炎、動(dòng)脈粥樣硬化、老年癡呆、糖尿病、癌癥等疾病[2]。自由基是導(dǎo)致油脂氧化的重要因素，食品的質(zhì)地、風(fēng)味、色澤等品質(zhì)變化很可能是自由基導(dǎo)致的[3]。

雞樅菌(Termitomycesalbuminosus)營養(yǎng)豐富，味道鮮美，素有“山珍之最、苗中之冠”的美稱，有益胃、療痔止血、治痔等功效[4]。雞樅菌含有人體所需的氨基酸、蛋白質(zhì)、維生素、鈣、磷、核黃酸等營養(yǎng)成分及多酚、纖維素酶、腦苷等成分，是補(bǔ)充人體所需物質(zhì)的選擇之一[5]。雞樅菌中的生物活性成分多酚、多糖、黃酮等常被用在修復(fù)損傷器官、提高免疫力、消炎鎮(zhèn)痛及調(diào)節(jié)身體機(jī)能等方面[6]。

研究表明，雞樅菌酶解液及飲料制品具有較強(qiáng)的抗氧化活性[7]。為充分利用雞樅菌資源，應(yīng)用蛋白酶進(jìn)行高效提取加工，旨在制備具有抗氧化活性，集多糖、蛋白質(zhì)及活性肽等功效成分于一體的營養(yǎng)液，為功能性食品的開發(fā)提供了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雞樅菌：購于金鄉(xiāng)聯(lián)盛菌業(yè)有限公司，采后于55 ℃熱風(fēng)干燥至恒重，粉粹過60目篩，得菌粉備用。

1,1-二苯基-2-苦基肼(DPPH·)、2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS+·)、堿性蛋白酶(酶活100 U/mg)、中性蛋白酶(酶活100 U/mg)、木瓜蛋白酶(酶活800 U/mg)、菠蘿蛋白酶(酶活500 U/mg)：上海金穗生物有限公司；其他試劑：均為國產(chǎn)分析純。

TDL-60B低速臺(tái)式離心機(jī) 上海安亭儀器廠；PHS-3C pH計(jì) 上海儀電儀器有限公司；723PC分光光度計(jì) 上海菁華儀器有限公司；FCD2000電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上?，槴\設(shè)備有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 雞樅菌酶解工藝

雞樅菌粉→加蒸餾水→pH調(diào)整→加蛋白酶→保溫酶解→100 ℃滅酶→離心(3000 r/min、30 min)→取上清液→雞樅菌酶解液。

1.2.2 蛋白酶的篩選

選取堿性蛋白酶、中性蛋白酶、菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶+菠蘿蛋白酶(1∶1)、木瓜蛋白酶+中性蛋白酶(1∶1)復(fù)合酶，在料液比1∶20、加酶量5000 U/g及推薦溫度和pH下酶解2.0 h，以水解度和DPPH·、ABTS+·、O2-·清除率為指標(biāo)，確定最佳蛋白酶，條件見表1。

表1 4種蛋白酶的酶活力和作用條件Table 1 Enzyme activities and action conditions of four proteases

1.2.3 單因素試驗(yàn)

選擇最佳蛋白酶，在加酶量5000 U/g、溫度50 ℃、pH 9、酶解2.0 h的條件下，研究料液比(1∶30、1∶25、1∶20、1∶17、1∶14)對(duì)水解度和DPPH·清除率的影響；在料液比1∶25、溫度50 ℃、pH 9、酶解2.0 h條件下，研究加酶量(2000，3000，4000，5000，6000 U/g)對(duì)水解度和DPPH·清除率的影響；在料液比1∶25、加酶量3000 U/g、pH 9、酶解2.0 h的條件下，研究溫度(40，45，50，55，60 ℃)對(duì)水解度和DPPH·清除率的影響；在料液比1∶25、加酶量3000 U/g、溫度45 ℃、酶解2.0 h的條件下，研究不同pH(7，8，9，10，11)對(duì)水解度和DPPH·清除率的影響；在料液比1∶25、加酶量3000 U/g、溫度45 ℃、pH 9的條件下，研究酶解時(shí)間(1.5，2.0，2.5，3.0，3.5 h)對(duì)水解度和DPPH·清除率的影響。

1.2.4 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以水解度和DPPH·清除率為指標(biāo)，選取加酶量(A)、pH(B)、酶解溫度(C)和酶解時(shí)間(D)4個(gè)因素進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)，制備酶解液，因素與水平見表2。

表2 正交試驗(yàn)因素與水平表Table 2 Factors and levels of orthogonal experiments

1.2.5 水解度的測(cè)定

采用GB 5009.235-2016酸度計(jì)法測(cè)定氨基酸態(tài)氮含量(X)[8]，采用GB 5009.5-2016凱氏定氮法測(cè)定總氮含量(Y)[9]，計(jì)算水解度(DH)[10]。

1.2.6 自由基清除率的測(cè)定

于最佳條件制備酶解液，并稀釋(0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 mg/mL)備用，以同濃度Vc為對(duì)照。

1.2.6.1 DPPH·清除率的測(cè)定

參照Floegel A等[11]的方法調(diào)整。酶解液2 mL，加入2 mL 0.01 mmol/L的DPPH·溶液，室溫避光反應(yīng)30 min，以無水乙醇為參比，在517 nm測(cè)定吸光值(A1)；測(cè)定同體積無水乙醇和DPPH·溶液混勻后的吸光值(A2)及2 mL樣品溶液和2 mL無水乙醇混勻后的吸光值(A3)，計(jì)算DPPH·清除率。

1.2.6.2 ABTS+·清除率的測(cè)定

參考李湘利等[12]的方法調(diào)整。用2.45 mmol/L的過硫酸鉀配制7 mmol/L的ABTS+·儲(chǔ)備液，避光靜置12 h后用95%乙醇稀釋得ABTS+·測(cè)試液，使其在734 nm的吸光值為0.7±0.02。吸取1 mL酶解液，加入4 mL ABTS+·測(cè)試液，混勻靜置5 min后測(cè)吸光值(A)，并測(cè)定95%乙醇加4 mL ABTS+·測(cè)試液的吸光值(A0)，計(jì)算ABTS+·清除率。

1.2.6.3 O2-·清除率的測(cè)定

參考楊志剛等[13]的方法調(diào)整。吸取3 mmol/L鄰苯三酚溶液0.3 mL，加入2 mL酶解液，用pH 8.2的Tris-HCl緩沖液定容至9 mL，以蒸餾水為參比，在325 nm下每30 s測(cè)一次吸光值，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，直線斜率為反應(yīng)速率ΔA0、ΔA，計(jì)算O2-·清除率。

式中：ΔA0為鄰苯三酚的自氧化法速率；ΔA為加酶解液后鄰苯三酚自氧化法速率(單位均為每分鐘吸光值增加值)。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法

采用IBM SPSS Statistics 22.0軟件進(jìn)行結(jié)果分析，用Microsoft Excel 2003的FORECAST函數(shù)計(jì)算自由基清除50%所需酶解液濃度(IC50)。

2 結(jié)果與分析

2.1 水解用酶的確定

圖1 不同酶的酶解效果Fig.1 The enzymatic hydrolysis effect of different enzymes

注：1為堿性蛋白酶；2為中性蛋白酶；3為菠蘿蛋白酶；4為木瓜蛋白酶；5為堿性蛋白酶+菠蘿蛋白酶；6為木瓜蛋白酶+中性蛋白酶。

由圖1可知，堿性蛋白酶和堿性蛋白酶+菠蘿蛋白酶的水解度最高，堿性蛋白酶水解的酶解液對(duì)DPPH·和O2-·的清除率較高，分別達(dá)到86.67%和54.55%，各酶解液對(duì)ABTS+·的清除率差異不大。這與各蛋白酶的酶切位點(diǎn)不同，與所得活性多肽、水解度及抗氧化產(chǎn)物提取率不同有關(guān)[14]。方差分析表明，堿性蛋白酶酶解液對(duì)DPPH·和O2-·的清除率顯著高于其他處理(P<0.05)。因此，選擇堿性蛋白酶制備酶解液。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 料液比對(duì)酶解效果的影響

圖2 料液比對(duì)水解度和DPPH·清除率的影響Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on hydrolysis degree and DPPH· clearance rate

由圖2可知，隨著料液比增大，水解度不斷升高，在料液比1∶17時(shí)達(dá)最大值66.04%。這是因?yàn)殡S著料液比增大，酶和底物的接觸幾率增大，酶解更充分，但產(chǎn)物濃度增大也會(huì)抑制酶解反應(yīng)[15]。DPPH·清除率隨著料液比增大呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，在料液比1∶25時(shí)清除率最高，可達(dá)48.81%(P>0.05)。為突出酶解液的抗氧化作用，選擇料液比1∶25為最佳料液比。

2.2.2 加酶量對(duì)酶解效果的影響

圖3 加酶量對(duì)水解度和DPPH·清除率的影響Fig.3 Effect of the additive amount of enzyme on hydrolysis degree and DPPH· clearance rate

由圖3可知，隨著加酶量增加，水解度升高，這與蛋白質(zhì)被水解為低分子肽、氨基酸等產(chǎn)物有關(guān)[16]。隨著加酶量增加，DPPH·清除率呈先上升后下降的趨勢(shì)，在加酶量3000 U/g時(shí)清除率最高，達(dá)45.18%(P<0.05)，加酶量高于3000 U/g，酶解液的抗氧化能力減小，這可能是加酶量增大，酶和底物接觸更充分，部分抗氧化物質(zhì)被酶解為無抗氧化活性產(chǎn)物所致[17]。綜合考慮，選擇加酶量2500，3000，3500 U/g進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.2.3 酶解溫度對(duì)酶解效果的影響

圖4 酶解溫度對(duì)水解度和DPPH·清除率的影響Fig.4 Effect of enzymolysis temperature on hydrolysis degree and DPPH· clearance rate

由圖4可知，隨著溫度升高，水解度呈先升后降的趨勢(shì)，超過45 ℃水解度降低。因?yàn)槊冈谧钸m溫度范圍內(nèi)，升高溫度可促進(jìn)酶解反應(yīng)，水解度增大；但溫度高于最適溫度時(shí)，酶穩(wěn)定性降低，催化活性減弱，反應(yīng)被抑制[18]。DPPH·清除率呈先升后降的趨勢(shì)，溫度50 ℃達(dá)到最高清除率58.56%(P<0.01)。這與溫度過高，酶活性減弱，多肽等抗氧化活性降低有關(guān)。水解度和DPPH·清除率在45～55 ℃相對(duì)較高，故選擇45，50，55 ℃進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.2.4 pH對(duì)酶解效果的影響

圖5 pH對(duì)水解度和DPPH·清除率的影響Fig.5 Effect of pH value on hydrolysis degree and DPPH· clearance rate

由圖5可知，隨著pH增大，水解度呈先增大后減小的變化趨勢(shì)，在pH 8時(shí)達(dá)到最大值41.74%，隨后逐漸減小，這是pH過高引起酶結(jié)構(gòu)和活性改變所致[19]。pH 9時(shí)DPPH·清除率達(dá)到最大值64.59%(P<0.01)。pH 7～9時(shí)，水解度和DPPH·清除率相對(duì)較高，故選擇pH 7、pH 8、pH 9進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.2.5 酶解時(shí)間對(duì)酶解效果的影響

由圖6可知，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，水解度增大。因?yàn)槊钢饾u對(duì)底物進(jìn)行酶解，所以水解度逐漸增加[20]。DPPH·清除率隨著時(shí)間延長(zhǎng)呈先升后降的趨勢(shì)，酶解2.0 h時(shí)達(dá)最大值61.74%(P<0.01)。這可能是酶解時(shí)間過長(zhǎng)，抗氧化多肽等活性物質(zhì)被分解所致。故選擇酶解1.5，2.0，2.5 h進(jìn)行正交試驗(yàn)。

圖6 酶解時(shí)間對(duì)水解度和DPPH·清除率的影響Fig.6 Effect of enzymolysis time on hydrolysis degree and DPPH· clearance rate

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

固定料液比1∶25，選取加酶量(A)、pH(B)、酶解溫度(C)及酶解時(shí)間(D)為試驗(yàn)因素，以DPPH·清除率和水解度為指標(biāo)，設(shè)計(jì)L9(34)正交試驗(yàn)，結(jié)果見表3。

表3 酶解工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果Table 3 Orthogonal experimental design and results of enzymatic hydrolysis technology optimization

由表3可知，對(duì)酶解液抗氧化活性影響的因素順序?yàn)锽>D>A>C，即pH對(duì)抗氧化活性影響最大，酶解溫度的影響最?。蛔顑?yōu)條件為A3B1C1D3。影響水解度的因素順序?yàn)锳>C>D>B，最優(yōu)條件為A3B1C2D2。為深入探討酶解對(duì)抗氧化活性的影響，確定最優(yōu)條件為加酶量3500 U/g，pH 7，45 ℃酶解2.5 h。

表4 DPPH·清除率方差分析Table 4 Analysis of variance on DPPH· clearance rate

注：P<0.01表示差異極顯著，P<0.05表示差異顯著。

由表4可知，在所選因素水平范圍內(nèi)，pH(B)對(duì)抗氧化性的影響極顯著(P<0.01)，酶解時(shí)間(D)的影響顯著(P<0.05)，加酶量(A)與酶解溫度(C)的影響不顯著(P>0.05)。在正交優(yōu)化條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，所得雞樅菌酶解液對(duì)DPPH·的清除率可達(dá)73.23%，水解度達(dá)44.6%，均高于其他處理。

2.4 自由基清除試驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 對(duì)DPPH·的清除能力

圖7 酶解液對(duì)DPPH·的清除能力Fig.7 Scavenging ability of enzymatic hydrolysate to DPPH·

由圖7可知，隨著酶解液濃度增大，DPPH·清除率逐步升高，在0.4～1.2 mg/mL時(shí)趨于平緩，酶解液濃度為1.2 mg/mL時(shí)DPPH·清除率最高，達(dá)66.76%，其清除DPPH·的IC50為0.25 mg/mL，對(duì)DPPH·的清除能力低于同濃度Vc的清除能力(P<0.01)。

2.4.2 對(duì)ABTS+·的清除能力

由圖8可知，隨著酶解液濃度增加，ABTS+·清除能力增強(qiáng)，酶解液濃度為1.2 mg/mL時(shí)清除率達(dá)94.41%，清除ABTS+·的IC50為0.39 mg/mL，對(duì)ABTS+·的清除能力低于同濃度Vc的清除能力(P<0.01)。

2.4.3 對(duì)O2-·的清除能力

圖9 酶解液對(duì)O2-·的清除能力Fig.9 Scavenging capacity of enzymatic hydrolysate to O2-·

由圖9可知，隨著酶解液濃度增大，O2-· 清除能力逐漸升高，酶解液對(duì)O2-· 的清除率在1.2 mg/mL時(shí)達(dá)到最大值54.77%，對(duì)O2-· 的IC50為1.09 mg/mL，酶解液對(duì)O2-·的清除能力低于同濃度Vc的清除能力(P<0.01)。

3 結(jié)論

應(yīng)用蛋白酶對(duì)雞樅菌進(jìn)行酶解，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗(yàn)，得出適宜雞樅菌水解的蛋白酶為堿性蛋白酶，最佳工藝條件為料液比1∶25，加酶量3500 U/g，pH 7，酶解溫度45 ℃，酶解時(shí)間2.5 h，此條件下所得雞樅菌蛋白水解度為44.6%，DPPH·清除率為73.23%。

雞樅菌酶解液濃度1.2 mg/mL時(shí)，對(duì)DPPH·、ABTS+·、O2-·的清除率分別達(dá)到最大值66.76%、94.41%、54.77%，其IC50分別為0.25，0.39，1.09 mg/mL。這說明雞樅菌酶解液具有較強(qiáng)的抗氧化能力，可用于功能性食品的開發(fā)。