燕平梅，宋敏麗，趙文婧

(1.太原師范學(xué)院 生物系，太原 030619;2.土壤消毒活化綠色產(chǎn)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新戰(zhàn)略聯(lián)盟，太原 030619)

泡菜是以白菜、蘿卜為主要原料，再配以辣椒、姜、大蒜等作為輔料，添加食鹽及其他調(diào)味品等，利用蔬菜自身的微生物或人工添加的微生物在厭氧條件下進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)生的酸性食物。泡菜中含有豐富的營(yíng)養(yǎng),包含大量的各類維生素、胡蘿卜素、鈣、鐵、磷等元素，以及豐富的乳酸菌。蔬菜發(fā)酵初期，表面的雜菌數(shù)量大于乳酸菌。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，雜菌的種類和數(shù)量減少，乳酸菌數(shù)量迅速增加。發(fā)酵后期，泡菜中的微生物幾乎都是乳酸菌[1-3]。1930年，Pederson首次提出了蔬菜的乳酸發(fā)酵過(guò)程中明串珠菌起到了啟動(dòng)的作用[4，5]。20世紀(jì)90年代后期研究較前期更深入，研究轉(zhuǎn)向泡菜中乳酸菌的演替規(guī)律。我國(guó)學(xué)者對(duì)泡菜發(fā)酵過(guò)程進(jìn)行了研究[6-9]。主要致力于四川泡菜和韓國(guó)泡菜中微生物的研究，進(jìn)行菌種分離、篩選、鑒定以及純化[10]，對(duì)于泡菜工業(yè)發(fā)展起到了舉足輕重的作用。

東北泡菜是東北地區(qū)的一種特色食物。常采用當(dāng)?shù)厥a(chǎn)的大白菜腌制而成，極具東北地方特色。但是東北泡菜與韓國(guó)泡菜和四川泡菜在輔料使用上不同，東北泡菜中使用的輔料除食鹽外，未添加其他輔料，這種泡菜也被稱為酸菜[11]。不斷有學(xué)者進(jìn)行韓國(guó)泡菜和四川泡菜中微生物的研究，但對(duì)于東北泡菜中微生物的研究少之又少。因此，我們對(duì)東北泡菜中微生物進(jìn)行分離、篩選和鑒定，分離有抑菌能力的微生物，對(duì)于進(jìn)一步探究東北泡菜的發(fā)酵機(jī)理和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值具有重要意義。

抑菌微生物就是具有抑菌活性的一類微生物，也稱拮抗微生物[12]。泡菜作為一種食品，在腌制及發(fā)酵過(guò)程中難免會(huì)有各種微生物的存在。抑菌微生物的存在不僅要保證泡菜的食用安全，還要求不能改變泡菜原有的風(fēng)味。因此，本研究以抑菌微生物的分離、篩選為出發(fā)點(diǎn)研究東北泡菜中的微生物及其抑菌功能，從而進(jìn)一步了解東北泡菜的發(fā)酵本質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，促進(jìn)東北泡菜工業(yè)的發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

于超市購(gòu)買的袋裝延邊傳統(tǒng)泡菜，延吉市三勝食品泡菜廠生產(chǎn)。

1.1.2 菌株

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)；大腸桿菌(Escherichiacoli)。

1.1.3 試劑

細(xì)菌DNA提取試劑盒：生化試劑；Taq DNA 聚合酶：北京天根時(shí)代公司。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)儀器

Life Touch基因擴(kuò)增儀 杭州博日科技有限公司；HYBAID LIMITED PCR儀、DcodeTM凝膠成像系統(tǒng) Bio-Rad公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 泡菜中乳酸菌的分離

采用BCG牛乳培養(yǎng)基分離泡菜中的乳酸菌，參照發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)的方法[13]。

對(duì)東北泡菜進(jìn)行不同濃度的稀釋，在BCG牛乳培養(yǎng)基平板上涂布，涂好的平板于30 ℃培養(yǎng)箱中倒置封口培養(yǎng)48 h，觀察菌落形態(tài)，篩選有變色圈的菌落。

1.2.2 抑菌能力的判斷

利用管碟法，在牛津杯中滴加乳酸菌發(fā)酵液離心后的上清液，以乳酸菌培養(yǎng)基MRS為對(duì)照試驗(yàn)，判斷分離的乳酸菌抑菌能力的大小。

1.2.3 抑菌微生物的鑒定

1.2.3.1 革蘭氏染色鑒定

具體實(shí)驗(yàn)操作方法參照《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》[14]。

1.2.3.2 過(guò)氧化氫酶實(shí)驗(yàn)

用接種環(huán)取一小環(huán)菌涂抹于已滴有5%過(guò)氧化氫的玻片上，如有氣泡產(chǎn)生則為陽(yáng)性，無(wú)氣泡則為陰性。

1.2.3.3 生理生化鑒定

應(yīng)用API50CH試劑條和 API50CHL培養(yǎng)基按照廠商的指示說(shuō)明，對(duì)分離菌株進(jìn)行糖發(fā)酵反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果由APILABPLUS(Version 3.3.3,Bio-Merieux,France)程序和標(biāo)準(zhǔn)分類法描述。

1.2.3.4 16S rRNA基因鑒定

基因組DNA提?。喊凑占?xì)菌基因組DNA提取試劑盒操作方法。

16S rRNA基因PCR擴(kuò)增：以原核生物通用引物8F和1542R為上、下游引物擴(kuò)增16S rRNA基因[15]。

fD1(5′-AGAGTTTGACCTCCTCCTGGCTCAG-3′)；

rD1(5′-AAGGAGGTGATCCAGCC-3′)。

分別靶向大腸桿菌(Escherichiacoli)16S rRNA的8～27位和1525～1542位核苷酸。PCR產(chǎn)物為1.5 kb。

16S rRNA基因序列分析：測(cè)序及分析由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離微生物結(jié)果

圖1 分離的乳酸菌(48 h)Fig.1 Isolated Lactobacillus (48 h)

由圖1可知，在30 ℃下BCG培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h后，培養(yǎng)基表面有乳白色菌落，菌落較小，菌落呈圓形，中等大小，凸起，微白色，濕潤(rùn)，邊緣整齊。菌落且周圍可看到明顯的變色圈，擬似為乳酸菌。分離出110株擬似乳酸菌，進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)。

2.2 抑菌實(shí)驗(yàn)

a.抑制金黃色葡萄球菌

b.抑制大腸桿菌

注：圖中C為對(duì)照；A，B為乳酸菌發(fā)酵液抑菌實(shí)驗(yàn)。

將分離乳酸菌的液體培養(yǎng)液加到牛津杯中培養(yǎng)48 h，可以看到牛津杯周圍有一個(gè)圓形區(qū)域沒(méi)有金黃色葡萄球菌菌落(見(jiàn)圖2中a)，其他地方有菌落生成，說(shuō)明從泡菜中分離的乳酸菌可抑制金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)。分離的110株擬似乳酸菌中有62株可抑制金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)。由圖2中b可知，從泡菜中分離的乳酸菌可抑制大腸桿菌的生長(zhǎng)。分離的110株擬似乳酸菌中有91株可抑制大腸桿菌的生長(zhǎng)。

2.3 抑菌微生物的鑒定

2.3.1 革蘭氏染色及過(guò)氧化氫酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果

挑取邊緣光滑、圓形菌落的細(xì)菌進(jìn)行革蘭氏染色，在油鏡下觀察，可看到為桿狀細(xì)菌，且菌體為紫色，說(shuō)明細(xì)菌為革蘭氏陽(yáng)性菌，由此判斷為擬似乳酸菌。

先在玻片上滴1滴5%過(guò)氧化氫，然后用接種針挑取1環(huán)菌涂抹于液體中，沒(méi)有氣泡產(chǎn)生，說(shuō)明分離的菌過(guò)氧化氫反應(yīng)為陰性，所以判斷分離的菌為擬似乳酸菌。

2.3.2 生理生化實(shí)驗(yàn)

對(duì)分離有抑菌作用的153菌株進(jìn)行糖發(fā)酵反應(yīng)，應(yīng)用API50CH試劑條和 API50CHL培養(yǎng)基鑒定，結(jié)果為62株抑制金黃色葡萄球菌的乳酸菌中11株為植物乳桿菌Lactobacillusplantarum；51株為L(zhǎng)actobacillusacidophilus。91株抑制大腸桿菌的乳酸菌中72株為植物乳桿菌Lactobacillusplantarum；19株為L(zhǎng)actobacillusbrevis。

表1 API50CH試劑條成分Table 1 Reagent components of API50CH

續(xù) 表

注：“+”表示陽(yáng)性反應(yīng)，“-”表示陰性反應(yīng)。

2.3.3 16S rRNA基因鑒定

將具有抑菌作用的乳酸菌進(jìn)行16S rRNA基因鑒定。 提取具有抑菌作用的乳酸菌的基因組DNA，以通用引物8F和1542R為上、下游引物擴(kuò)增16S rRNA基因，結(jié)果見(jiàn)圖3 。將PCR擴(kuò)增的具有抑菌作用的乳酸菌16S rRNA基因產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果為62株抑制金黃色葡萄球菌的乳酸菌中11株植物乳桿菌Lactobacillusplantarum；51株為L(zhǎng)actobacillusacidifarinae。91株抑制大腸桿菌的乳酸菌中72株為植物乳桿菌Lactobacillusplantarum；19株為L(zhǎng)actobacillusacidifarinae。

圖3 提取DNA模板的 PCR擴(kuò)增反應(yīng)圖譜Fig.3 PCR amplification response spectrum of DNA template

注：泳道M表示標(biāo)樣；1，2表示乳酸菌PCR擴(kuò)增反應(yīng)圖譜。

3 討論

蔬菜收獲后表面所含的微生物種類多、數(shù)量大，如大白菜外葉含微生物約13×108個(gè)/g，但有益菌一般數(shù)量都較低。蔬菜發(fā)酵初期首先是附著在原料表面的雜菌不斷生長(zhǎng)繁殖，主要有微球菌屬、單胞菌屬、酵母菌屬，也有腸道細(xì)菌屬、克雷伯氏菌屬、棒桿菌屬，同時(shí)乳酸菌也隨之增殖，乳酸菌主要為球狀乳桿菌、鏈球菌、明串珠菌、片球菌等[16，17]。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，雜菌的種類和數(shù)量減少，乳酸菌數(shù)量迅速增加，占細(xì)菌總數(shù)的比例不斷增加。發(fā)酵后期，泡菜中的微生物幾乎都是乳酸菌，乳酸菌大多為植物乳桿菌、短乳桿菌。前人研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌不僅在泡菜風(fēng)味方面起到關(guān)鍵的作用，還在泡菜發(fā)酵過(guò)程中起到抑制其他雜菌生長(zhǎng)的作用[18，19]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出東北泡菜的乳酸菌具有抑制金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的作用，經(jīng)生理生化(糖發(fā)酵反應(yīng))鑒定結(jié)果為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)、短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)，與前人的研究結(jié)果一致。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出東北泡菜的乳酸菌具有抑制金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的作用，經(jīng)16S rRNA基因鑒定，結(jié)果為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)、Lactobacillusacidifarinae，據(jù)資料報(bào)道[20]，Lactobacillusacidifarinae是在比利時(shí)的酸面團(tuán)中發(fā)現(xiàn)的新菌種，此菌的16S rRNA基因序列和Lactobacillusbrevis的非常相近，可用糖發(fā)酵反應(yīng)產(chǎn)物的不同來(lái)區(qū)別兩者。本實(shí)驗(yàn)用生理生化(糖發(fā)酵反應(yīng))和基因鑒定泡菜中具有抑制作用的乳酸菌，由于Lactobacillusacidifarinae的16S rRNA基因序列和Lactobacillusbrevis的非常相近，難以區(qū)別，以糖發(fā)酵反應(yīng)的結(jié)果作為鑒定的結(jié)果。