楊昭，姚玉靜，黃佳佳，梁瑞進(jìn)，梁健平，何惠

(廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院 食品學(xué)院，廣州 510520)

牡蠣富含蛋白質(zhì)，營養(yǎng)價值高，被稱為“海洋牛奶”，是世界第一大養(yǎng)殖貝類[1]。采用蛋白酶對牡蠣進(jìn)行酶解，是制備牡蠣呈味基料的重要方法[2]。由于牡蠣酶解液中富含功能肽和游離氨基酸，被認(rèn)為是極具應(yīng)用前景的高品質(zhì)呈味基料[3]。呈味基料具有強烈的鮮味和特征性風(fēng)味，對高值調(diào)味品和調(diào)味醬的研制有重要作用[4]，呈味基料的風(fēng)味對其應(yīng)用有重要影響。現(xiàn)有大量研究者關(guān)注牡蠣酶解前后揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的變化。劉曉麗等[5]采用SPME-GC-MS從中性蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解牡蠣的酶解液中分別鑒定出62種和60種成分，主要有烴類、醇類、醛類、酮類和含硫化合物等。鄧嫣容[6]采用氣相色譜-質(zhì)譜法對復(fù)合蛋白酶(木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、菠蘿蛋白酶)酶解牡蠣的酶解液風(fēng)味成分進(jìn)行分析，鑒定出20種化合物。張梅超[7]研究發(fā)現(xiàn)牡蠣酶解后腥味、苦澀味和哈喇味加重，青草味減少。蘇明月等[8]采用SPME-GC-MS對堿性蛋白酶酶解牡蠣過程中的揮發(fā)性風(fēng)味成分進(jìn)行分析，在0，1，3 h從牡蠣酶解液中分別鑒定出31，32，36種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。前期研究發(fā)現(xiàn)，胰蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶組成的復(fù)合酶是制備牡蠣呈味基料較佳的蛋白酶組合。但隨著酶解時間的增加，牡蠣酶解液的感官評分卻呈現(xiàn)先緩慢升高再緩慢降低的趨勢[9]。牡蠣酶解過程中脂質(zhì)氧化降解和蛋白質(zhì)降解，會對牡蠣酶解液的風(fēng)味造成影響[10]。因此，為探究復(fù)合蛋白酶酶解時間對牡蠣酶解液揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的影響，采用固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜(SPME-GC-MS)聯(lián)用法分析0.5，1，4，8 h牡蠣酶解液的揮發(fā)性成分，為牡蠣呈味基料的工業(yè)化應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

近江牡蠣肉：購于廣州黃沙水產(chǎn)市場；胰蛋白酶：重慶市全新祥盛生物制藥有限公司；風(fēng)味蛋白酶：諾維信(中國)生物技術(shù)有限公司；氫氧化鈉、鹽酸：均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

GCMS-QP2010 Ultra氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 日本島津制作所；FE22-Standard pH計 梅特勒-托利多國際貿(mào)易(上海)有限公司；DKZ-3B電熱恒溫振蕩水槽 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；3K15臺式高速冷凍離心機 德國Sigma公司；50 μm二乙苯基/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷(DVB/CAR/PDMS)萃取頭、手動SPME進(jìn)樣手柄 美國Supelco 公司。

1.3 牡蠣酶解液制備

凍藏牡蠣肉置于室溫溶解后，準(zhǔn)確稱取100 g，加入100 g蒸餾水，打漿后調(diào)整pH值至7.0，加入漿液總重量0.2%的胰蛋白酶和0.1%的風(fēng)味蛋白酶，攪拌均勻后倒入1 L的燒杯中，在55 ℃水浴搖床中分別酶解0.5，1，4，8 h。酶解結(jié)束后，將盛有酶解液的燒杯置于水浴鍋中于95 ℃滅酶20 min。酶解液室溫冷卻后，在4 ℃條件下以8000 r/min離心10 min，取上清液即為牡蠣酶解液，-18 ℃凍存?zhèn)溆肹11]。

1.4 揮發(fā)性風(fēng)味成分分析

1.4.1 揮發(fā)性風(fēng)味成分提取

稱取3 g牡蠣酶解液，裝入頂空萃取瓶中，置于55 ℃下平衡10 min后，將DVB/CAR/PDMS萃取頭插入頂空瓶中，吸附1 h后拔出萃取頭，用于GC-MS檢測。

1.4.2 揮發(fā)性風(fēng)味成分鑒定

色譜條件：Rts-5MS色譜柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)。不分流進(jìn)樣，載氣為高純氦氣(99.999%)，流速為0.8 mL/min。升溫程序：柱初溫35 ℃，保持2 min，以4 ℃/min升至40 ℃，保持2 min，然后以5 ℃/min升至100 ℃，保持10 min，再以10 ℃/min升至230 ℃，保持10 min。進(jìn)樣口溫度為230 ℃，解吸溫度為230 ℃，解吸時間為5 min。

質(zhì)譜條件：離子化方式EI；電子能量70 eV，離子源溫度200 ℃，質(zhì)量掃描范圍35～500 m/z。

1.4.3 揮發(fā)性風(fēng)味成分圖譜分析

通過NIST 11譜庫對各色譜峰進(jìn)行檢索，取相似度大于80%的物質(zhì)，并結(jié)合文獻(xiàn)報道對物質(zhì)進(jìn)行定性，確定揮發(fā)性風(fēng)味成分。僅統(tǒng)計相對含量≥0.1%的化合物，以面積歸一化法確定各揮發(fā)性風(fēng)味成分的相對含量[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 SPME-GC-MS總離子流色譜圖

酶解時間為0.5，1，4，8 h牡蠣酶解液的揮發(fā)性風(fēng)味成分總離子流色譜圖見圖1～圖4。

圖1 0.5 h牡蠣酶解液揮發(fā)性風(fēng)味成分總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram of volatile flavor components in oyster hydrolysate at 0.5 h

圖2 1 h牡蠣酶解液揮發(fā)性風(fēng)味成分總離子流色譜圖Fig.2 Total ion chromatogram of volatile flavor components in oyster hydrolysate at 1 h

圖3 4 h牡蠣酶解液揮發(fā)性風(fēng)味成分總離子流色譜圖Fig.3 Total ion chromatogram of volatile flavor components in oyster hydrolysate at 4 h

圖4 8 h牡蠣酶解液揮發(fā)性風(fēng)味成分總離子流色譜圖Fig.4 Total ion chromatogram of volatile flavor components in oyster hydrolysate at 8 h

由圖1～圖4可知，4種牡蠣酶解液揮發(fā)性風(fēng)味成分的總離子流色譜圖分離度較好，揮發(fā)性成分出峰時間主要在10～20 min和30～40 min之間。牡蠣酶解液揮發(fā)性風(fēng)味成分通過SPME萃取，經(jīng)GC-MS分析，保留匹配度≥80的化合物，在4種牡蠣酶解液中共鑒定出89種化合物。0.5，1，4，8 h牡蠣酶解液分別鑒定出51，52，60，51種化合物。

2.2 不同酶解時間牡蠣酶解液揮發(fā)性風(fēng)味成分比較

表1 牡蠣酶解液揮發(fā)性風(fēng)味成分種類和相對含量Table 1 The types and relative content of volatile flavor components in oyster hydrolysate

續(xù) 表

續(xù) 表

續(xù) 表

注“—”表示未檢測出。

表2 牡蠣酶解液揮發(fā)性風(fēng)味成分中各類化合物的數(shù)量和相對含量Table 2 The quantity and relative content of volatile flavor components in oyster hydrolysate

由表1和表2可知，0.5 h牡蠣酶解液鑒定出51種化合物，主要含有10種醇類(20.59%)、15種醛類(22.89%)、6種酯類(5.41%)、4種酮類(1.33%)、11種烴類(16.61%)和5種雜環(huán)和其他類(1.54%)。1 h牡蠣酶解液鑒定出52種化合物，主要含有9種醇類(15.91%)、16種醛類(16.13%)、6種酯類(5.57%)、4種酮類(0.77%)、9種烴類(16.04%)和8種雜環(huán)和其他類(2.22%)。4 h牡蠣酶解液鑒定出60種化合物，主要含有10種醇類(23.08%)、16種醛類(9.99%)、5種酯類(5.71%)、5種酮類(1.69%)、15種烴類(22.58%)和9種雜環(huán)和其他類(2.51%)。8 h牡蠣酶解液鑒定出51種化合物，主要含有9種醇類(14.73%)、14種醛類(8.81%)、5種酯類(3.18%)、4種酮類(8.9%)、13種烴類(25.4%)、6種雜環(huán)和其他類(3.18%)。

4種牡蠣酶解液中均含有的揮發(fā)性風(fēng)味成分有24種，包含4種醇類、10種醛類、1種酯類、4種酮類、2種烴類、3種雜環(huán)和其他類。2-壬酮、3,6-壬二烯醛、三氯乙酸壬酯、十三醛和正壬基環(huán)己烷為0.5 h牡蠣酶解液中獨有的揮發(fā)性風(fēng)味成分。氯甲酸正壬基酯、2-溴十二烷、2-十二烯-1-醇為1 h牡蠣酶解液中獨有的揮發(fā)性風(fēng)味成分。2-甲基-5-(1-甲基乙基)-2-環(huán)己烯-1-酮、2-甲基戊酸酸酐、環(huán)己烷-1,4-二甲醇二乙酸酯、1,1-二甲基-2-(2-甲基-1-丙烯基)-環(huán)丙烷、2-丁基-1-辛醇、4-(1,2-二甲基環(huán)戊-2-烯基)-丁烷-2-酮、2,6,10,14-四甲基十五烷、苊、十六烯和2,4-二叔丁基苯酚為4 h牡蠣酶解液中獨有的揮發(fā)性風(fēng)味成分。1-(2-甲氧基丙氧基)-2-丙醇、亞麻酸、庚基環(huán)己烷和亞麻醇為8 h牡蠣酶解液中獨有的揮發(fā)性風(fēng)味成分。

醇類、醛類、酯類和酮類的風(fēng)味閾值相對較低，對于風(fēng)味的影響較大。為剖析酶解時間對牡蠣酶解液揮發(fā)性風(fēng)味成分的影響，對4種牡蠣酶解液的揮發(fā)性風(fēng)味成分進(jìn)行了分析和比較。

醇類物質(zhì)通常是由脂肪酸氧化酶作用于多不飽和脂肪酸衍生而來。飽和醇類化合物由于閾值較大，一般對牡蠣氣味貢獻(xiàn)不大。但有些含量特別高或是不飽和的烯醇式結(jié)構(gòu)化合物閾值較低，可能會對牡蠣風(fēng)味有較大貢獻(xiàn)。醇類物質(zhì)通常具有植物香甜味、柔和的芳香、酸敗和土氣味。1-辛烯-3-醇和2-辛烯-1-醇是亞油酸酯或亞麻酸酯氫過氧化合物的降解產(chǎn)物，在海南島養(yǎng)殖近江牡蠣中被鑒定出，被認(rèn)為是牡蠣特有的類似蘑菇香氣的主要成分[13]。由表1可知，1-辛烯-3-醇在4種牡蠣酶解液中均存在，且是醇類物質(zhì)中含量最高的，其在0.5，1，4，8 h牡蠣酶解液中含量分別為7.74%、7.23%、10.04%和9.86%。2-辛烯-1-醇在0.5，1，4 h牡蠣酶解液中含量分別為2.1%、1.63%和2.01%，而其在8 h牡蠣酶解液中未被檢測到。

醛類物質(zhì)是脂肪氧化的主要產(chǎn)物，閾值相對較低，對水產(chǎn)品的風(fēng)味有較大的貢獻(xiàn)[14]。目前已確認(rèn)水產(chǎn)品的魚腥味物質(zhì)為一些醛類和烯醛類，主要包括以下幾種化合物：正己醛、正庚醛、2,4-二烯癸醛、2,4,7-三烯癸醛、二烯庚醛、二烯癸醛和4-烯庚醛等[15]。4-庚烯醛具有魚腥味、青草、油脂香氣。2-辛烯醛具有油脂味、堅果味。2,6-壬二烯醛具有黃瓜味。3,6-壬二烯醛具有青味。2-壬烯醛具有肉香、蘑菇、青味。癸醛具有海味。辛醛具有脂味、蘑菇味。由表1可知，4-庚烯醛和2,6-壬二烯醛在4種牡蠣酶解液中均存在，且是醛類物質(zhì)中含量最高的。4-庚烯醛在0.5，1，4，8 h牡蠣酶解液中含量分別為4.59%、3.87%、2.38%和2.04%。2,6-壬二烯醛在0.5，1，4，8 h牡蠣酶解液中含量分別為12.22%、7.08%、1.76%和0.22%。隨著酶解時間的增加，4-庚烯醛和2,6-壬二烯醛相對含量明顯減少。

酯類化合物是醇和酸通過酯化作用縮合而成，閾值較低，一般具有顯著的香味特征[16]。4種牡蠣酶解液的酯類揮發(fā)性成分種類存在較大的差異。3-己烯醇甲酸酯和酞酸二乙酯在牡蠣酶解液中含量較高。 3-己烯醇甲酸酯在0.5 h和1 h牡蠣酶解液中含量分別為1.63%和1.54%，而其在4 h和8 h牡蠣酶解液中未被檢測到。酞酸二乙酯在0.5，1，4 h牡蠣酶解液中含量分別為2.89%、3.25%和3.63%，而其在8 h牡蠣酶解液中未被檢測到。

酮類化合物可能是氨基酸分解、多不飽和脂肪熱氧化和降解或微生物氧化產(chǎn)生，其閾值一般比較高。酮類貢獻(xiàn)出牡蠣甜的花香、果香等氣味。4種牡蠣酶解液的酮類揮發(fā)性成分種類有較大的差異，且含量均較低。苯乙酮在4種牡蠣酶解液中均存在，但在8 h牡蠣酶解液中含量最高，為6.55%。2-甲基環(huán)辛烷-1-酮在8 h牡蠣酶解液中含量也較高，相對含量為1.67%。

3 結(jié)論

4種牡蠣酶解液中共鑒定出89種化合物。0.5 h牡蠣酶解液鑒定出51種化合物，主要含有10種醇類(20.59%)、15種醛類(22.89%)、6種酯類(5.41%)、4種酮類(1.33%)、11種烴類(16.61%)和5種雜環(huán)和其他類(1.54%)。1 h牡蠣酶解液鑒定出52種化合物，主要含有9種醇類(15.91%)、16種醛類(16.13%)、6種酯類(5.57%)、4種酮類(0.77%)、9種烴類(16.04%)和8種雜環(huán)和其他類(2.22%)。4 h牡蠣酶解液鑒定出60種化合物，主要含有10種醇類(23.08%)、16種醛類(9.99%)、5種酯類(5.71%)、5種酮類(1.69%)、15種烴類(22.58%)和9種雜環(huán)和其他類(2.51%)。8 h牡蠣酶解液鑒定出51種化合物，主要含有9種醇類(14.73%)、14種醛類(8.81%)、5種酯類(3.18%)、4種酮類(8.9%)、13種烴類(25.4%)、6種雜環(huán)和其他類(3.18%)。4種牡蠣酶解液中均含有的揮發(fā)性風(fēng)味成分有24種，包含4種醇類、10種醛類、1種酯類、4種酮類、2種烴類、3種雜環(huán)和其他類化合物。