熊夢園，方芳，李一榮

武漢大學中南醫(yī)院檢驗科，湖北 武漢 430071

結核病 (tuberculosis) 是由結核分枝桿菌 (M.tuberculosis) 引起的慢性傳染病，可侵犯人體全身多種器官，但其主要侵犯肺臟，引起肺結核 (pulmonary tuberculosis，PTB) ，常以乏力、咳嗽、咯血、低熱、盜汗等為主要臨床表現(xiàn)[1]。據(jù)報道，全球約有20 億結核感染者，且感染人數(shù)仍在逐年增長。2017年全球新發(fā)結核患者數(shù)超過1 000萬，其中男性580萬、女性320萬、兒童100 萬，大約9%發(fā)生在艾滋病病毒 (HIV) 感染者中。當結核病被及早發(fā)現(xiàn)并得到有效治療時，基本上是可以治愈的。然而，2017 年全球共有約160 萬人死于結核病，其中包括30 萬HIV 患者[2]。目前我國是全球結核病高負擔國家之一，每年新發(fā)結核患者數(shù)約130萬，所面臨的結核防控形勢十分嚴峻[3]。鑒于結核病的高患病率、高死亡率及其傳染性，早期、快速、準確的診斷是預防和治療結核病的一項重要因素。Xpert MTB/RIF 檢測技術是由美國Cepheid 公司研發(fā)的一種結核桿菌快速檢測技術，可集樣本前處理、DNA自動提取和實時熒光定量PCR (RT-PCR) 于一體，不僅能明確樣本中是否存在結核分枝桿菌的DNA，而且能明確其是否對利福平耐藥[4]。Xpert MTB/RIF 檢測操作簡單，僅需少量步驟的準備工作，2 h 內能同時報告結核分枝桿菌及利福平耐藥性，相比于涂片鏡檢 (1 d) 、固體培養(yǎng) (30 d) 、液體培養(yǎng) (16 d) 等傳統(tǒng)方法大幅度縮短了啟動治療的時間[5]。世界衛(wèi)生組織 (WHO) 于2010年正式推薦Xpert MTB/RIF用于成人肺結核的診斷，并于2013年推薦其用于診斷兒童肺結核和特定形式的肺外結核[6]。本研究以臨床最終診斷結果為金標準，并與涂片抗酸染色鏡檢及γ-干擾素釋放試驗 (IGRA) 進行比較，評價Xpert MTB/RIF對肺結核的診斷價值，以期為此技術在我國的進一步推廣應用提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017 年9 月至2019 年7 月于武漢大學中南醫(yī)院因疑似肺結核就診的765例患者作為研究對象，其中男性506例，女性259例，年齡12～100 歲，平均 (56.98±17.37) 歲。共收集到428 份痰液、263 份肺泡灌洗液及74 份胸水，分別進行涂片抗酸染色和Xpert MTB/RIF 檢測，同時采集到237 例患者的靜脈血，用于進行γ-干擾素釋放試驗。

1.2 檢測方法

1.2.1 涂片抗酸染色與鏡檢 痰標本的涂片抗酸染色與鏡檢依據(jù)《痰涂片鏡檢標準化操作及質量保證手冊》進行[7]。肺泡灌洗液及胸水在涂片前先離心富集，棄去上清液，吸取底部液體涂片，其余步驟與痰涂片鏡檢相同。

1.2.2 Xpert MTB/RIF檢測 765例患者的痰、肺泡灌洗液及胸水標本在進行Xpert MTB/RIF檢測前，按以下方式進行預處理：對于痰標本，取1 mL痰標本加入2 mL樣本處理液，渦旋震蕩10 s，室溫放置10 min，重復震蕩步驟，室溫放置5 min后，取2 mL經過處理的標本加入Xpert MTB/RIF試劑盒，上機檢測；對于肺泡灌洗液及胸水，首先3 000 r/min 離心10 min，吸棄上清，加入2 mL 樣本處理液，渦旋震蕩10 s，充分混勻后加入Xpert MTB/RIF試劑盒，上機檢測。

1.2.3 γ-干擾素釋放試驗 (IGRA) 采用靜脈穿刺術采集3 mL全血樣本，分裝到陰性對照 (N) 、陽性對照 (P) 和檢測 (T) 三種含有刺激抗原的培養(yǎng)管中，每管1 mL。檢測試劑盒來自?？诰S瑅生物研究院，實驗步驟依據(jù)說明書進行。分別讀取N、P、T 反應的OD 值，計算出T-N、P-N和 (T-N) / (P-N) 的值，當N＜0.5時，T-N/P-N≥0.16將結果判定為陽性，T-N/P-N＜0.16則將結果判定為陰性；當0.5≤N＜2.5 時，T-N≥1.5 將結果判定為陽性，T-N＜1.5 則將結果判定為陰性；當N≥2.5 時，判為無法確定。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用IBM SPSS25.0 統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差表示，組間比較采用t 檢驗，計數(shù)資料的比較采用χ2檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。判斷各檢驗方法與臨床診斷結果的一致性采用Kappa檢驗，K＜0.4為一致性差，0.40≤K＜0.75 表示一致性較好，K≥0.75 為一致性極好。

2 結果

2.1 一般資料 以臨床診斷為金標準，765 例疑似肺結核病患者中，共有195例最終確診為肺結核，其中男性136 例，女性59 例；平均 (58.75±16.84) 歲；原發(fā)性肺結核60 例，血行播散性肺結核3 例，繼發(fā)性肺結核87 例，氣管、支氣管結核13 例及結核性胸膜炎32例，同時有31 例患者伴有HIV 感染。570 例患者排除結核感染，其中男性370 例，女性200 例；平均 (57.43±17.33) 歲；肺炎226例，支氣管擴張伴感染136例，肺癌62 例，慢性阻塞性肺疾病36 例及其他感染110 例，其中55 例患者同時合并HIV 感染。兩組患者性別與年齡比較差異均無統(tǒng)計學意義 (P＞0.05) 。

2.2 Xpert MTB/RIF 與涂片鏡檢檢測結果 以臨床診斷結果為金標準，Xpert MTB/RIF 與涂片抗酸染色鏡檢檢測的陽性檢出率、對肺結核診斷的靈敏度、特異性、陽性預測值 (PPV) 、陰性預測值 (NPV) 、準確度及與臨床檢驗診斷結果的一致性見表1。χ2檢驗表明，Xpert MTB/RIF 對肺結核的陽性檢出率、靈敏度、準確度及陰性預測值明顯高于涂片抗酸染色鏡檢，差異有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05) 。Kappa檢驗結果表明，對于與臨床診斷結果的一致性，Xpert MTB/RIF 檢測優(yōu)于涂片鏡檢，K 值分別為0.628和0.173。另外，Xpert MTB/RIF 同時可測得利福平耐藥性檢出率為6.25% (7/112) 。

表1 Xpert MTB/RIF與涂片鏡檢的檢測結果比較[% (比值) ]

2.3 IGRA 檢測與Xpert MTB/RIF 聯(lián)合IGRA 檢測結果比較 本研究中有237例患者在行Xpert MTB/RIF檢測的同時進行了IGRA檢測，兩者任一結果為陽性則判定為聯(lián)合檢測結果陽性。根據(jù)臨床診斷結果，79 例確診為肺結核，其中男性57 例，女性22 例；平均 (56.76±17.46) 歲。158例排除肺結核，其中男性113例，女性45例；平均 (55.52±18.63) 歲。兩組患者性別與年齡比較差異均無統(tǒng)計學意義 (P＞0.05) 。IGRA 及Xpert MTB/RIF檢測結果見表2，兩者的靈敏度及特異度比較差異均無統(tǒng)計學意義 (P＞0.05) 。但與單獨IGRA檢測和單獨Xpert MTB/RIF檢測相比，兩者聯(lián)合檢測的靈敏度顯著提高，特異度有所下降 (P＜0.05) 。兩者與臨床診斷結果的一致性相似，K值分別為0.529和0.546，兩者聯(lián)合檢測一致性略有提高，K值為0.692。

表2 IGRA檢測與及Xpert MTB/RIF聯(lián)合IGRA檢測結果比較[% (比值) ]

2.4 合并感染HIV者Xpert MTB/RIF與IGRA檢測結果比較 本研究共納入86 例HIV 患者，其中31例確診同時感染肺結核，對于此類患者，Xpert MTB/RIF 對肺結核診斷的靈敏度、特異度、PPV、NPV 分別為41.94% (13/31) 、100.00% (55/55) 、100.00% (13/13) 、75.34% (55/73) 。IGRA 對肺結核診斷的靈敏度、特異度、PPV、NPV 分別為45.16% (14/31) 、92.73% (51/55) 、77.78% (14/18) 、75.00% (51/68) 。 HIV 組 中Xpert MTB/RIF檢測與IGRA的靈敏度、特異度、PPV及NPV比較差異均無統(tǒng)計學意義 (P＞0.05) 。

2.5 Xpert MTB/RIF對不同類型的標本檢測結果比較 按標本類型分類，可將標本分為痰組、肺泡灌洗液組及胸水組，各組Xpert MTB/RIF檢測結果如表3所示。χ2檢驗表明，三組不同類型的標本陽性檢出率、靈敏度、陰性預測值及準確度差異均有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05) ，痰組與肺泡灌洗液組陽性檢出率靈敏度、陰性預測值及準確度比較差異均無統(tǒng)計學意義 (P＞0.05) ，但均與胸水組差異有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05) 。痰組、肺泡灌洗液組與臨床診斷結果一致性較好，遠高于胸水組 (K值分別為0.624、0.728和0.252) 。

表3 不同類型的標本Xpert MTB/RIF檢測結果[% (比值) ]

3 討論

早期快速、準確地診斷肺結核 (包括涂片陰性肺結核和耐藥結核) 對于改善患者預后，減少結核病傳播、降低結核病死亡率、減輕患者和社會負擔等多個方面至關重要，是完成世界衛(wèi)生組織 (WHO) “終結結核病戰(zhàn)略”的戰(zhàn)略基礎[8]?，F(xiàn)有的臨床診斷方法中，結核分枝桿菌培養(yǎng)通常被認為是診斷結核病的金標準，并且是檢測結核桿菌耐藥性的關鍵步驟。然而，結核桿菌培養(yǎng)是一個相對復雜和緩慢的過程，固體培養(yǎng)通常需要1～2個月的時間才能得到結果，液體培養(yǎng)雖然比固體培養(yǎng)更敏感和快速，但仍需要2個星期以上，而且臨床上菌陰結核較為常見；血清學診斷多受抗原純度和特異性影響。隨著近年來現(xiàn)代化科技水平的不斷提高，新型分子診斷技術層出不窮，Xpert MTB/RIF檢測技術以其操作簡便、快速等諸多優(yōu)點受到廣泛關注。

Xpert MTB/RIF 檢測技術同時采用6 種分子探針及6種分子信標，選擇性的覆蓋rpoB基因上81 bp的利福平耐藥決定區(qū)，檢測是否結核桿菌感染及其利福平耐藥性。研究表明，rpoB基因突變存在于95%以上的利福平耐藥菌株株，因此，可選擇rpoB基因作為檢測利福平耐藥性的相關基因[9-10]。Xpert MTB/RIF檢測技術集標本處理、DNA提取、基因實時擴增和熒光檢測于一體，操作簡單便捷，并且過程中不容易產生氣溶膠污染，從而可降低結核桿菌生物危害的風險。獨立包裝的檢測試劑盒也減少了DNA污染的機會，對實驗室生物安全和環(huán)境要求較低，需要的生物安全防護級別與直接涂片鏡檢相當，對操作人員要求也較低，可逐步推廣用于POCT檢測[11]及我國基層醫(yī)院[12]。

本研究中，共有195 例患者確診為肺結核，占25.49%，Xpert MTB/RIF 檢測技術陽性檢出率為14.64%、診斷靈敏度、NPV 和準確度分別為54.87%、86.52%和87.84%，均顯著高于涂片抗酸染色鏡檢，其與臨床診斷結果一致性也遠高于涂片鏡檢，Xpert MTB/RIF 檢測技術特異度、PPV 大于95%，說明臨床上開展Xpert MTB/RIF檢測，可幫助臨床實現(xiàn)快速、較準確的診斷，減少漏診和誤診。但與其他研究[13]相比，本研究中Xpert MTB/RIF靈敏度、PPV較低，可能與不同地區(qū)結核病患病率不同有關。本次研究肺結核患者占比不高，也可能與標本取材、樣本前處理等有關。研究表明，痰涂片鏡檢及Xpert MTB/RIF 的檢出性能很大程度上受標本質量的影響[14-15]，臨床上患者經常出現(xiàn)少痰、無力咳痰或痰標本不合格的情況，痰液含菌量較少，無法達到檢測限。臨床醫(yī)生留痰時應向患者講解留取痰標本的重要性及如何從肺部深處咳痰，注意不要留取到鼻腔或咽部分泌物等。此外，咯血是肺結核常見臨床表現(xiàn)之一，痰液中的紅細胞可以抑制PCR反應，對于此種標本，應進行預先處理，盡可能去除痰中混有的紅細胞。Xpert MTB/RIF對不同標本檢出效率有所不同，綜合分析，肺泡灌洗液檢出效能最佳，痰液次之，胸水檢出效果不佳，與另一項研究結果[16]相符。痰樣本陽性檢出受限于病變部位、樣本質量等多個因素，肺泡灌洗液則是通過支氣管鏡直接留取病變部位灌洗液進行檢測，并且肺內各葉、段均可使用，擴大了檢查范圍，結核桿菌載量較高，因此檢出陽性率較高。THERON等[17]對南非單中心154例疑似肺結核患者進行了一項前瞻性研究，對采集的肺泡灌洗液行Xpert MTB/RIF 檢測，以培養(yǎng)結果為金標準，其靈敏度、特異度分別為92.6%、96.0%，遠高于涂片鏡檢?？梢妼τ谛枰夤茜R檢查的疑似結核病或少痰患者，可同時采集其肺泡灌洗液行Xpert MTB/RIF 檢測，檢測前對肺泡灌洗液進行離心富集會大大提高其陽性檢出率。結核性胸膜炎是結核桿菌直接感染或胸膜對結核桿菌菌體成分產生遲發(fā)型變態(tài)反應而發(fā)生的炎癥，歸為Ⅴ型肺結核，患者常出現(xiàn)胸腔積液。本研究中，胸水組Xpert MTB/RIF 檢測敏感度僅為19.05%，遠低于痰組及肺泡灌洗液組，其特異度及陽性預測值均為100.00%，證明該方法對結核性胸膜炎的診斷價值有限。SEHGAL等[18]針對結核性胸膜炎的Meta分析也證明了這一點，其原因可能是胸腔積液中結核桿菌載量較低，難以達到檢測限。WHO 不推薦胸水作為病原學證據(jù)確診結核性胸膜炎，應首選胸膜活組織。此外，Xpert MTB/RIF 檢測技術僅針對結核桿菌的DNA，無法分辨細菌存活狀態(tài)，在部分陳舊性肺結核中，也可能檢測到結核桿菌DNA。因此，診斷陽性患者還要結合臨床及其他相關檢查來判斷肺結核的活動性。

γ-干擾素釋放試驗是一項特異性T淋巴細胞免疫檢測技術，不受卡介苗接種和大多數(shù)非結核分枝桿菌的干擾，已被廣泛應用于臨床，輔助診斷結核感染[19]。相比于單獨檢測，Xpert MTB/RIF及IGRA聯(lián)合檢測的靈敏度明顯提高。肺結核是HIV 患者最常見的機會性感染之一，對于此類患者，早期診斷尤為重要。本研究中包括86例HIV患者，確診為肺結核的有31例，但Xpert MTB/RIF檢測對其診斷價值有限，且與IGRA檢測差異無統(tǒng)計學意義，可能原因是樣本量太小，不具有廣泛的代表性，也可能是HIV患者免疫功能降低干擾檢測效能。研究表明，大約90%的耐利福平結核桿菌也可能對異煙肼耐藥，因此檢測結核桿菌對利福平的耐藥性一定程度上也可作為檢測多重耐藥結核分枝桿菌的一種手段[20-21]，為臨床醫(yī)生選擇治療方案提供診斷依據(jù)。本研究有一些局限性。本研究是一項單中心的回顧性分析，樣本量不足，部分信息缺失，并且未討論結核性腦膜炎、骨結核、淋巴結結核等肺外結核。有研究表明，Xpert MTB/RIF 檢測技術對肺外結核有一定的診斷價值[22-23]，對于此類結核，選擇合適的標本進行檢測十分重要。

綜上所述，Xpert MTB/RIF檢測具有高靈敏度、高特異度、易于操作、交叉污染少、可快速檢測利福平耐藥性等優(yōu)點，能為肺結核的早期診斷及治療方案的選擇提供有效依據(jù)，具有廣闊的應用前景，值得臨床推廣使用。