惠雪蓮，舒瑾，董鸝蕓，趙娟

西安市中醫(yī)醫(yī)院婦科，陜西 西安 710021

子宮肌瘤是女性生殖器官常見的良性腫瘤，其病因與遺傳、激素、子宮本身等多種因素有關(guān)[1]。近年來，子宮肌瘤的發(fā)病率呈增長趨勢[2]。研究表明，子宮肌瘤細胞受到刺激后異常的增殖、遷移和侵襲是其發(fā)生發(fā)展的主要原因[3]，但關(guān)于細胞增殖、遷移和侵襲的機制未完全闡明，探究影響子宮肌瘤細胞增殖、遷移和侵襲的分子機制，可為該疾病的治療提供新途徑。微小RNA (microRNA，miRNA) 可在轉(zhuǎn)錄本后水平調(diào)控靶基因的表達，影響細胞的生長、凋亡、分化等生物學(xué)行為，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[4]。研究顯示，miR-140-3p在脊索瘤[5]、非小細胞肺癌[6]、哮喘[7]等多種疾病中異常表達，可作為疾病診治的靶點及預(yù)后判斷標志物。目前，miR-140-3p在子宮肌瘤中表達及作用還未知。生物信息學(xué)軟件預(yù)測顯示，錨蛋白B (ankyrin-B，ANK2) 的3'非翻譯區(qū) (3' untranslated region，3'UTR) 含有與miR-140-3p核苷酸序列結(jié)合的位點，提示ANK2 可能是miR-140-3p 的靶基因。ANK2屬于細胞骨架蛋白家族成員，參與細胞增殖、運動、活化等多種細胞學(xué)行為，其過表達與肝癌[8]、胃癌[9]等腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，但ANK2 對子宮肌瘤細胞生物學(xué)行為的影響還未知。本研究主要探討了miR-140-3p對子宮肌瘤細胞增殖、遷移和侵襲的影響及其是否通過調(diào)控ANK2 表達發(fā)揮作用，以期為子宮肌瘤的靶向治療提供新靶點。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2016 年2 月至2018 年9 月在西安市中醫(yī)醫(yī)院病理科證實為子宮肌瘤的59 例手術(shù)切除標本為研究對象?；颊吣挲g29～55 歲，平均 (41.58±6.12) 歲；病程3～86 個月，平均 (29.67±5.91) 個月。納入標準： (1) 病理類型為子宮肌瘤； (2) 手術(shù)前未進行治療。同時收集41 例同時期因子宮肌瘤切除全子宮的正常子宮肌組織作為對照，患者年齡31～53歲，平均 (40.02±6.35) 歲；病程2～84 個月，平均 (29.29±5.83) 個月。手術(shù)切除后的宮頸組織置于無RNA 酶的EP 管中，放入液氮罐中保存?zhèn)溆谩１狙芯拷?jīng)本院倫理委員會批準，患者自愿簽署知情同意書。

1.2 細胞和實驗試劑 胎牛血清 (fetal bovine serum，F(xiàn)BS) 和RPMI 1640 培養(yǎng)基 (美國Gibco 公司) ，胰蛋白酶和四甲基噻唑藍 (methylthiazoletrazolium，MTT) (美國Sigma公司) ，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR試劑盒 (深圳晶美生物工程有限公司) ，Trizol 試劑和LipofectamineTM2000試劑盒 (美國Invitrogen公司) ，PCR引物 (上海生工生物工程有限公司) ，miR-140-3p 模擬物 (mimcs) 及模擬陰性序列 (miR-NC) 、miR-140-3p 抑制劑 (anti-miR-140-3p 組) 及抑制劑陰性序列 (anti-miR-NC) 、ANK2的小干擾RNA (si-ANK2) 及亂序無意義陰性序列 (si-NC) 、ANK2 過表達載體 (pcDNA-ANK2) 及空載體 (pcDNA) (上海吉凱基因公司) ，細胞周期蛋白D1 (CyclinD1) 和P21 單克隆抗體 (武漢博士德生物技術(shù)有限公司) ，基質(zhì)金屬蛋白酶2 (matrix metalloproteinase 2，MMP-2) 和E-鈣黏附素 (E-cadherin) 多克隆抗體 (美國Abcam 公司) ，二喹啉甲酸 (bicinchoninicacid，BCA) 蛋白檢測試劑盒和雙熒光素酶活性檢測試劑盒 (上海碧云天生物技術(shù)有限公司) 。

1.3 實驗方法

1.3.1 子宮肌瘤細胞培養(yǎng) 參照文獻方法培養(yǎng)子宮肌瘤細胞[10]。在無菌條件下，取約1 cm3子宮肌瘤組織置于培養(yǎng)皿，加入含雙抗的磷酸鹽緩沖液 (phosphate buffered saline，PBS) ，浸泡3～5 min 后，漂洗3次。剪碎組織，加入適量濃度為0.2%的Ⅰ型膠原酶，37℃消化2～3 h。完全培養(yǎng)基終止消化后，200目濾網(wǎng)過濾，收集濾液。1 000 r/min離心5 min，吸棄上清液，加入含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基，置于37℃、CO2體積分數(shù)5%、濕度97%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)細胞生長狀況，及時更換新鮮培養(yǎng)基。待細胞融合至80%左右時，PBS 清洗細胞，加入0.25%胰蛋白酶溶液消化，進行傳代培養(yǎng)。

1.3.2 細胞轉(zhuǎn)染和分組 對數(shù)生長期的子宮肌瘤細胞接種于6孔板中，每孔1×105個細胞。待細胞融合至60%時，參照LipofectamineTM2000試劑盒操作說明，分別 將miR-140-3p mimcs (miR-140-3p 組) 、miR-NC (miR-NC 組) 、anti-miR-140-3p (anti-miR-140-3p 組) 、anti-miR-NC (anti-miR-NC 組) 、si-ANK2 (si-ANK2組) 、si-NC (si-NC 組) 以及miR-140-3p mimcs 與pcDNA-ANK (miR-140-3p+pcDNA-ANK2組) 、miR-140-3p mimcs 與pcDNA (miR-140-3p+pcDNA 組) 轉(zhuǎn)染 至 細胞。轉(zhuǎn)染48 h后，實時熒光定量PCR (real-time quantitative PCR，RT-qPCR) 檢測miR-140-3p 或蛋白印跡 (Western blot) 檢測ANK2 蛋白水平驗證轉(zhuǎn)染效果，并收集細胞用于后續(xù)實驗。

1.3.3 RT-qPCR檢測miR-140-3p和ANK2 mRNA表達水平 Trizol 試劑提取組織或細胞中總RNA，微量核酸儀檢測RNA的純度和濃度后，參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒書名數(shù)，將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。然后以cDNA 為模板進行擴增。擴增條件：95℃5 min，95℃10 s，60℃30 s，72℃30 s，共35 個循環(huán)。miR-140-3p 上游5'-ACACTCCAGCTGGGAGGCG-3'，下游5'-CTCAA CTGGTGTCGTGGA-3'；U6上游5'-CTCGCTTCGGCA GCACA-3'，下游5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'；ANK2 上游5'-GTAAGTCCGTAGTAACC GCG-3'，下游5'-CCGACTGTGCCAAGCTGC-3'；GAPDH 上 游5'-GCAATGCTGCTAACGT GCAGCT-3'，下 游5'-CTGAGTGTCCCGAAACGTGCT-3'。miR-140-3p 以U6為內(nèi)參，ANK2 以GAPDH 為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計算miR-140-3p和ANK2 mRNA的相對表達水平。

1.3.4 MTT檢測細胞增殖 轉(zhuǎn)染后的各組細胞，調(diào)整濃度為2.5×104個/mL，每孔200 μL接種于96孔板中。每組設(shè)置3個復(fù)孔。培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，每孔加入20 μL 的MTT 試劑 (5 g/L) ，培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h。小心吸棄培養(yǎng)基，每孔加入150 μL二甲基亞砜，輕輕振蕩混勻，酶標儀490 nm 處測定吸光度值 (absorbance，A) 。以未轉(zhuǎn)染的細胞作為對照組，計算各組細胞存活率。細胞存活率 (%) =A實驗組/A對照組×100%。

1.3.5 Transwell 檢測細胞遷移和侵襲 轉(zhuǎn)染后的各組細胞，調(diào)整濃度為5×104個/mL。細胞遷移實驗：Transwell 上室加入100 μL 細胞懸液，下室加入500 μL含F(xiàn)BS 的RPMI 1640培養(yǎng)基。培養(yǎng)48 h 后，用4%多聚甲醛固定30 min，結(jié)晶紫染色15 min，倒置顯微鏡觀察，隨機選取5 個視野，計數(shù)。細胞侵襲實驗：將Matrigel 基質(zhì)膠用RPMI 1640 培養(yǎng)基以1:8 比例稀釋，并鋪于Transwell 上室，自然晾干后100 μL 細胞懸液，后續(xù)操作同細胞遷移實驗。

1.3.6 Western blot 法 檢 測 細 胞 中ANK2、CyclinD1、p21、MMP-2 和E-cadherin 蛋白水平 轉(zhuǎn)染后的各組細胞，培養(yǎng)48 h后，收集細胞，PBS清洗兩次。加入含蛋白酶抑制劑的蛋白裂解液，提取細胞中總蛋白，BCA法對蛋白進行定量。取適量蛋白溶液于沸水中煮沸5 min使其變性。然后以每孔30 μg蛋白行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳后，濕轉(zhuǎn)至聚偏乙烯二氟膜。轉(zhuǎn)膜后，置于5%脫脂牛奶中封閉2 h。分別加入稀釋后的ANK2 (1:800) 、CyclinD1 (1:400) 、p21 (1:400) 、MMP-2 (1:600) 和E-cadherin (1:800) 抗體，4℃孵育過夜。加入辣根過氧化酶標記的二抗IgG (1:200) ，室溫孵育1 h。加入化學(xué)發(fā)光試劑ELC，避光顯影，凝膠成像系統(tǒng)曝光拍照。Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值，以GAPDH 為內(nèi)參，目的蛋白與GAPDH 條帶灰度值的比值表示目的蛋白相對表達水平。

1.3.7 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CmiR-140-3p與ANK2調(diào)控關(guān)系 生物信息學(xué)軟件預(yù)測顯示，ANK2的3'UTR與miR-140-3p的核苷酸序列存在連續(xù)的結(jié)合位點。采用PCR技術(shù)擴增含miR-140-3p結(jié)合位點的ANK2 的3'UTR 序列，并將其插入熒光素酶報告質(zhì)粒psi CHECK-2 載體中，構(gòu)建ANK2 野生型質(zhì)粒 (WT-ANK2) 。通過基因定點突變技術(shù)將結(jié)合位點突變后，插入psi CHECK-2 載體，構(gòu)建ANK2 突變型質(zhì)粒 (MUT-ANK2) 。分別將WT-ANK2、MUT-ANK2 與miR-140-3p mimic、miR-NC 共轉(zhuǎn)染至子宮肌瘤細胞。轉(zhuǎn)染12 h 后，吸棄培養(yǎng)基，更換新鮮培養(yǎng)基。培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)至48 h，0.25%胰蛋白酶消化，收集細胞，檢測熒光素酶活性，具體操作參照雙熒光素酶活性檢測試劑盒說明書，結(jié)果以熒光蟲活性/海腎熒光強度比值表示各組的熒光素酶活性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS22.0 軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析，計量資料以均數(shù)±標準差表示，兩組間比較采用獨立樣本t 檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q 檢驗。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 子宮肌瘤組織中miR-140-3p 和ANK2 mRNA表達水平 與正常子宮肌組織比較，子宮肌瘤組織中miR-140-3p 水平降低，ANK2 mRNA 水平升高，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.05) ，見表1。

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2.2 過表達miR-140-3p 對子宮肌瘤細胞增殖、遷移和侵襲的影響 與miR-NC 組比較，miR-140-3p組細胞中miR-140-3p 水平升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.05) ，表明miR-140-3p mimics 轉(zhuǎn)染成 功 (P＜0.05) ，細胞中miR-140-3p 過表達。與miR-NC 組比較，miR-140-3p 組細胞存活率、遷移和侵襲細胞數(shù)降低，CyclinD1 和MMP-2 蛋 白 水 平 降 低，p21 和E-cadherin蛋白水平升高，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.05) ，見圖1、表2和表3。

圖1 Western blot 法檢測過表達miR-140-3p 對子宮肌瘤細胞CyclinD1、p21、MMP-2和E-cadherin蛋白表達的影響

表2 過表達miR-140-3p對子宮肌瘤細胞增殖的影響 (，n=9)

表2 過表達miR-140-3p對子宮肌瘤細胞增殖的影響 (，n=9)

組別miR-NC miR-140-3p t值P值miR-140-3p 1.01±0.09 2.67±0.23 20.163＜0.01細胞存活率 (%) 99.63±3.28 62.37±1.59 30.666＜0.01 CyclinD1蛋白0.98±0.11 0.23±0.04 19.223＜0.01 p21蛋白0.29±0.05 0.82±0.08 16.854＜0.01

表3 過表達miR-140-3p對子宮肌瘤細胞遷移和侵襲的影響 (，n=9)

表3 過表達miR-140-3p對子宮肌瘤細胞遷移和侵襲的影響 (，n=9)

組別miR-NC miR-140-3p t值P值遷移細胞數(shù)139.25±12.34 72.58±8.19 13.505＜0.01侵襲細胞數(shù)115.21±10.69 53.91±6.18 14.893＜0.01 MMP-2蛋白0.53±0.06 0.19±0.03 15.205＜0.01 E-cadherin蛋白0.21±0.05 0.57±0.07 12.555＜0.01

2.3 抑制ANK2表達對子宮肌瘤細胞增殖、遷移和侵襲的影響 與si-NC 組比較，si-ANK2 組細胞中ANK2 蛋白水平降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.05) ，表明ANK2小干擾RNA轉(zhuǎn)染成功，細胞中ANK2表達受到抑制。與si-NC 組比較，si-ANK2 組細胞存活率、遷移和侵襲細胞數(shù)降低，CyclinD1 和MMP-2 蛋白水平降低，p21 和E-cadherin 蛋白水平升高，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.05) ，見圖2和表4和表5。

圖2 Western blot法檢測抑制ANK2表達對子宮肌瘤細胞CyclinD1、p21、MMP-2和E-cadherin蛋白表達的影響

表4 抑制ANK2表達對子宮肌瘤細胞增殖的影響 (，n=9)

表4 抑制ANK2表達對子宮肌瘤細胞增殖的影響 (，n=9)

組別si-NC si-ANK2值P值A(chǔ)NK2蛋白0.72±0.08 0.23±0.04 16.435＜0.01細胞存活率 (%) 98.67±3.58 72.59±2.08 18.897＜0.01 CyclinD1蛋白0.68±0.06 0.39±0.03 12.969＜0.01 p21蛋白0.29±0.05 0.45±0.07 5.58＜0.01

表5 抑制ANK2表達對子宮肌瘤細胞遷移和侵襲的影響，n=9)

表5 抑制ANK2表達對子宮肌瘤細胞遷移和侵襲的影響，n=9)

組別si-NC si-ANK2 t值P值遷移細胞數(shù)142.58±12.86 75.69±8.54 12.999＜0.01侵襲細胞數(shù)123.67±11.24 58.39±6.58 15.036＜0.01 MMP-2蛋白0.59±0.04 0.21±0.04 20.153＜0.01 E-cadherin蛋白0.19±0.03 0.43±0.05 12.348＜0.01

2.4 miR-140-3p 靶向調(diào)控ANK2 表達 Target scan 生物信息學(xué)軟件預(yù)測顯示，ANK2 的3'UTR 存在與miR-140-3p 結(jié)合的核苷酸序列見圖3A。雙熒光素酶活性檢測結(jié)果顯示，miR-140-3p mimics 可降低WT-ANK2 的 熒 光 素 酶 活 性 (P＜0.05) ，而 對MUT-ANK2 熒光素酶活性無顯著影響 (P＞0.05) ，表明miR-140-3p 可與ANK2 的3'UTR 靶向結(jié)合，見表6。miR-140-3p 組ANK2 蛋白 水 平 低于miR-NC 組，anti-miR-140-3p 組ANK2 蛋白水平高于anti-miR-NC組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.05) ，說明miR-140-3p在子宮肌瘤細胞中靶向負調(diào)控ANK2 表達見圖3B和表7。

表6 雙熒光素酶活性檢測結(jié)果 (，n=9)

表6 雙熒光素酶活性檢測結(jié)果 (，n=9)

組別miR-NC miR-140-3p t值P值WT-ANK2 1.06±0.08 0.43±0.03 22.121＜0.01 MUT-ANK2 1.02±0.06 0.97±0.05 1.921 0.073

圖3 miR-140-3p靶向調(diào)控ANK2表達

注：與miR-NC組比較，aP＜0.05；與anti-miR-NC組比較，bP＜0.05。

2.5 過表達ANK2 逆轉(zhuǎn)過表達miR-140-3p 對子宮肌瘤細胞增殖、遷移和侵襲的影響 與miR-140-3+pcDNA組比較，miR-140-3p+pcDNA-ANK2組細胞存活率、遷移和侵襲細胞數(shù)升高，CyclinD1和MMP-2蛋白水平升高，p21 和E-cadherin 蛋白水平降低，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.05) ，見圖4、表8和表9。

圖4 Western blot檢測過表達ANK2逆轉(zhuǎn)miR-140-3p對子宮肌瘤細胞CyclinD1、p21、MMP-2和E-cadherin蛋白表達的影響

表8 過表達ANK2逆轉(zhuǎn)過表達miR-140-3p對子宮肌瘤細胞增殖的影響 (，n=9)

組別miR-140-3p+pcDNA miR-140-3p+pcDNA-ANK2 t值P值A(chǔ)NK2蛋白0.15±0.02 0.58±0.06 20.397＜0.01細胞存活率 (%) 61.23±1.41 87.39±3.02 23.547＜0.01 CyclinD1蛋白0.21±0.04 0.58±0.05 17.355＜0.01 p21蛋白0.53±0.06 0.25±0.04 11.649＜0.01

表9 過表達ANK2逆轉(zhuǎn)過表達miR-140-3p對子宮肌瘤細胞遷移和侵襲的影響 (，n=9)

表9 過表達ANK2逆轉(zhuǎn)過表達miR-140-3p對子宮肌瘤細胞遷移和侵襲的影響 (，n=9)

組別miR-140-3p+pcDNA miR-140-3p+pcDNA-ANK2 t值P值遷移細胞數(shù)75.49±8.25 146.28±12.57 14.125＜0.01侵襲細胞數(shù)56.39±6.24 119.24±11.08 14.827＜0.01 MMP-2蛋白0.22±0.02 0.48±0.05 14.484＜0.01 E-cadherin蛋白0.56±0.05 0.34±0.03 11.319＜0.01

3 討論

miRNA 是一類小分子單鏈非編碼RNA，長度為18～25 個核苷酸，其通過與靶基因mRNA 的3'UTR 結(jié)合，抑制靶mRNA 翻譯或降解靶mRNA，進而調(diào)控靶基因的表達，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。miR-140-3p是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種miRNA，其在多種腫瘤中表達降低，發(fā)揮抗腫瘤作用。如DONG 等[11]研究顯示，miR-140-3p過表達可抑制非小細胞肺癌細胞的生長、遷移和侵襲，并誘導(dǎo)細胞凋亡。SUN 等[12]研究顯示，miR-140-3p 在乳腺癌細胞中表達降低，過表達miR-140-3p 抑制了乳腺癌細胞的增殖，促進細胞凋亡。目前，miR-140-3p 對子宮肌瘤細胞增殖、遷移和侵襲的影響還未知。

本研究顯示，miR-140-3p在子宮肌瘤組織中表達降低，提示miR-140-3p 可能參與子宮肌瘤的發(fā)生發(fā)展。過表達miR-140-3p 后，子宮肌瘤細胞存活率及遷移和侵襲細胞數(shù)降低，提示miR-140-3p 過表達可抑制子宮肌瘤細胞增殖、遷移和侵襲。CyclinD1是細胞周期調(diào)控蛋白之一，可促進細胞由G1期向S 期轉(zhuǎn)變，加速細胞增殖[13]。p21是腫瘤抑制因子，其表達增加可抑制細胞增殖。本研究顯示，miR-140-3p過表達可降低子宮肌瘤細胞中CyclinD1 蛋白水平，提高p21蛋白水平，提示過表達miR-140-3p 通過調(diào)控CyclinD1和p21蛋白表達抑制子宮肌瘤細胞增殖?；|(zhì)金屬蛋白酶參與降解細胞外基質(zhì)和基底膜，促進細胞遷移和侵襲。E-cadherin 是鈣黏附蛋白家族成員，其表達下調(diào)或喪失可導(dǎo)致細胞間黏附降低，易于脫落，進而遷移和侵襲[14]。本研究顯示，miR-140-3p過表達可降低子宮肌瘤細胞中MMP-2蛋白水平，提高E-cadherin 蛋白水平，提示過表達miR-140-3p 通過調(diào)控MMP-2 和E-cadherin 蛋白表達抑制子宮肌瘤細胞遷移和侵襲。

為了進一步探討過表達miR-140-3p 抑制子宮肌瘤細胞增殖、遷移和侵襲的分子機制，本研究通過生物信息學(xué)軟件預(yù)測顯示，ANK2可能是miR-140-3p的靶基因，并通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C實了miR-140-3p 在子宮肌瘤細胞中靶向負調(diào)控ANK2 表達。ANK2是錨蛋白家族成員之一，參與腫瘤發(fā)生和發(fā)展過程。CHEN等[15]研究顯示，胰腺癌中ANK2表達升高，沉默ANK2降低了胰腺腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲能力，ANK2是治療胰腺癌的潛在靶標。王翠艷等[16]研究顯示，沉默ANK2可抑制胃癌細胞SGC-7901增殖和轉(zhuǎn)移，阻滯細胞周期進程。目前，ANK2對子宮肌瘤細胞增殖、遷移和侵襲的影響還未知。

本研究顯示，子宮肌瘤組織中ANK2 mRNA水平表達升高，與相關(guān)研究結(jié)果一致[8]，提示ANK2也參與子宮肌瘤的發(fā)生發(fā)展。通過轉(zhuǎn)染ANK2小干擾RNA至子宮肌瘤細胞，結(jié)果顯示，抑制ANK2表達可降低子宮肌瘤細胞的增殖、遷移和侵襲能力，說明抑制ANK2表達可降低子宮肌瘤的發(fā)展進程，提示ANK2可能是子宮肌瘤治療的分子靶點。此外，本研究還顯示，過表達ANK2 逆轉(zhuǎn)了過表達miR-140-3p 對子宮肌瘤細胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用，提示miR-140-3p 通過下調(diào)ANK2表達抑制子宮肌瘤細胞的增殖、遷移和侵襲。

綜上所述，miR-140-3p在子宮肌瘤組織中表達降低，過表達miR-140-3p 可抑制子宮肌瘤細胞的增殖、遷移和侵襲能力，其作用機制與下調(diào)ANK2表達有關(guān)，miR-140-3p/ANK2 軸可能為子宮肌瘤的靶向分子治療提供了潛在靶點。