王海峰，阿曼姑麗·艾合買提，陸艷榮，呂 茵，張瑾熔

食管癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，2018年全球食管癌新發(fā)病例57.20萬例，占全球惡性腫瘤發(fā)病率第7位；死亡病例50.86萬例，占全球惡性腫瘤死亡率第6位[1]。我國是食管癌高發(fā)地區(qū)，據(jù)中國國家癌癥中心統(tǒng)計(jì)的數(shù)據(jù)，2015年我國食管癌新發(fā)24.6萬例，死亡18.8萬例，分別占惡性腫瘤發(fā)病及死亡率的第6位及第4位[2]，我國的食管癌的新發(fā)病例數(shù)及死亡人數(shù)幾乎占世界的一半。放射治療是不能手術(shù)的中晚期食管癌最主要的治療手段[3]，但放射治療的效果并不令人滿意。張安度等[4]報(bào)道，盡管采用三維適形放療技術(shù)，食管癌放療的5年生存率也只有24.5%。孔雁等[5]發(fā)現(xiàn)，局部未控或復(fù)發(fā)仍然是放療失敗的首要原因。

survivin是凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis proreins，IAPs)家族最小的成員，其可與多種內(nèi)源性及外源性途徑的凋亡調(diào)控因子相互作用，明顯地抑制凋亡的發(fā)生[6]，是食管癌細(xì)胞放射抵抗的重要原因之一，可作為增加食管鱗癌放療敏感性的治療靶點(diǎn)[7, 8]。Egr1基因?qū)儆诩纯淘缙诨蚣易?immediate early genes，IEGs)的成員，其啟動(dòng)子含有輻射感應(yīng)組件，使其能被放射線所誘導(dǎo)而表達(dá)增高。有學(xué)者提出了將Egr1基因的啟動(dòng)子序列與需要表達(dá)的基因序列連接，用電離輻射驅(qū)動(dòng)Egr1基因的啟動(dòng)子帶動(dòng)目的基因高表達(dá)的基因-放射治療理論。其研究結(jié)果表明，電離輻射可明顯誘導(dǎo)重組質(zhì)粒中位于Egr1啟動(dòng)子下游的目的基因表達(dá)增強(qiáng)，其抑瘤效應(yīng)明顯優(yōu)于單純放療和單純基因治療[9, 10]?；谝陨涎芯浚狙芯恳詓urvivin作為治療靶點(diǎn)，利用Egr1基因啟動(dòng)子，構(gòu)建Egr1-survivin shRNA質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染食管鱗癌細(xì)胞，來證實(shí)此種方法是否會(huì)進(jìn)一步促進(jìn)食管癌細(xì)胞凋亡，增加食管癌細(xì)胞的放射敏感性。

1 材料與方法

1.1 材料 細(xì)胞株：ECA109細(xì)胞購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心。pAAV-EGR1 promoter-survivin shRNA質(zhì)粒由武漢維諾賽生物技術(shù)有限公司合成。細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI-1640+10%胎牛血清+1%雙抗中。Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑(invitrogen)，Trizol(Aidlab)，HiScript Reverse Transcriptase (RNase H)、50×ROX Reference Dye 2、SYBR Green Master Mix(VAZYME)，Taq Plus DNA Polymerase(TIANGEN)，RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(碧云天)，兔多抗GAPDH(杭州賢至生物)，兔多抗survivin(武漢三鷹生物)，HRP標(biāo)記羊抗小鼠二抗(武漢博士德生物)，ECL底物液(Thermo)，X光膠片(柯達(dá))，顯影定影試劑盒(天津市漢中攝影材料廠)，細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒(南京凱基生物公司)，APC/7-AAD細(xì)胞凋亡試劑盒(三箭生物)。

1.2 細(xì)胞分組處理 食管癌ECA109細(xì)胞按照處理方式分為：(1)空白對(duì)照組，不加任何處理+放療；(2)空載體對(duì)照組，轉(zhuǎn)染空載體質(zhì)粒+放療；(3)Egr1-survivin shRNA組，轉(zhuǎn)染pAAV-EGR1 promoter-survivin shRNA質(zhì)粒+放療；(4)YM155組，YM155處理+放療。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。轉(zhuǎn)染用LipofectamineTM2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，具體操作步驟依照轉(zhuǎn)染試劑盒說明書。測(cè)定食管癌ECA109細(xì)胞YM155的IC50值為5 nM。向加入細(xì)胞培養(yǎng)后的6孔板加入YM155溶液，調(diào)節(jié)YM155的終濃度5 nM。轉(zhuǎn)染及YM155處理48 h后進(jìn)行細(xì)胞照射，照射方法為：6 MV-X 射線進(jìn)行室溫垂直照射，劑量率200 cGy/min，10 cm×10 cm照射野，100 cm源皮距，照射劑量單次4 Gy，照射后24 h收獲細(xì)胞進(jìn)行各項(xiàng)檢測(cè)。

1.3 qPCR檢測(cè)各處理組ECA109細(xì)胞survivin mRNA水平 利用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，測(cè)定RNA的純度和濃度后，取1 μg按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA。合成的cDNA做10倍稀釋，進(jìn)行qPCR檢測(cè)。qPCR反應(yīng)體系：cDNA4 μl，F(xiàn)orward Primer (10 μM) 0.4 μl，Reverse Primer (10 μM)0.4 μl，SYBR Green Master Mix10 μl，50×ROX Reference Dye20.4 μl，ddH2O 4.8 μl；反應(yīng)條件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 sec ，60 ℃ 30 s，40 cycles。繪制溶解曲線，最終數(shù)據(jù)以2-ΔΔCt進(jìn)行分析。survivin引物序列：F: 5′-CCCTTTCTCAAGGACCACCGCATCT-3′，R: 5′-CTCGTTCTCAGTGGGGCAGTGGATG-3′。GAPDH引物序列：F: 5′-AAGCCGTTCTTGACAAATGG-3′，R: 5′-ATTGGTGTTGGCCTTCAGAC-3′。

1.4 Western-Blot檢測(cè)各處理組ECA109細(xì)胞survivin蛋白水平 向按分組處理好的細(xì)胞加入RIPA裂解液，于冰上充分裂解后收集上清至預(yù)冷EP管中，于4 ℃下12 000 r/min離心5 min。取上清用BCA法測(cè)定蛋白濃度。后將提取的蛋白充分變性，調(diào)整每個(gè)樣品蛋白上樣量為40 μg，進(jìn)行SPS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后在0 ℃恒流條件下電轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜條件：survivin 200 mA 50 min，GAPDH 200 mA 90 min，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上后用含5%脫脂奶粉的TBST封閉、洗膜后，進(jìn)行抗體雜交，經(jīng)一抗、二抗孵育后X光顯影，掃描膠片，用BandScan分析膠片灰度值進(jìn)行分析。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各處理組細(xì)胞周期和凋亡 將按不同分組處理后細(xì)胞于培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后，0.25%胰酶消化細(xì)胞，1200 r/min，5 min離心，分別收集各處理組細(xì)胞。細(xì)胞周期檢測(cè)：加PBS洗滌一次，加入100 μl PBS重懸細(xì)胞后，緩慢加入700 μl預(yù)冷的80%乙醇，4 ℃固定4 h以上，預(yù)冷PBS洗滌2次，加入400 μl PI(50 μg/ml)，4 ℃避光染色30 min，后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。細(xì)胞凋亡檢測(cè)：加PBS洗滌2次，按照APC/7-AAD細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒操作說明進(jìn)行：(1)加入500 μl Binding Buffer，重懸細(xì)胞；(2)5 μl 7-AAD混勻后加入5 μl APC，混勻；(3)室溫避光反應(yīng)5～15 min，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

2 結(jié) 果

2.1 各處理組ECA109細(xì)胞survivin mRNA及蛋白的表達(dá)結(jié)果 從表1、圖1的qPCR及Western-Blot檢測(cè)結(jié)果可見，Egr1-survivin shRNA+放療組ECA109細(xì)胞survivin mRNA及蛋白的相對(duì)表達(dá)量明顯低于單純放療的空白對(duì)照組和空載體對(duì)照組，各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；mRNA水平Egr1-survivin shRNA組低于YM155+放療組(P<0.01)，但在蛋白水平其差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.102)。YM155+放療組survivin mRNA及蛋白的相對(duì)表達(dá)量也明顯低于空白對(duì)照組和空載體對(duì)照組(P<0.01)。

組別survivin mRNAsurvivin蛋白空白對(duì)照組1.050±0.109①0.838±0.035①空載體對(duì)照組1.026±0.169①0.869±0.059①Egr1-survivin shRNA組0.497±0.1120.447±0.064YM155組0.747±0.092①0.544±0.088

注：與Egr1-survivin shRNA組比較, ①P<0.01

圖1 食管鱗癌ECA109細(xì)胞各處理組 survivin 蛋白表達(dá)結(jié)果

1.空白對(duì)照組; 2.空載體對(duì)照組; 3.Egr1-survivin shRNA組; 4.YM155組

2.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)ECA109細(xì)胞各處理組細(xì)胞周期的結(jié)果 從表2、圖2細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果可見，經(jīng)Egr1-survivin shRNA+放療及YM155+放療處理后，ECA109細(xì)胞的細(xì)胞周期分布發(fā)生明顯變化，G2期與S期細(xì)胞比例明顯增加。Egr1-survivin shRNA組G2，S期細(xì)胞比例明顯高于空白對(duì)照組和空載體對(duì)照組，Egr1-survivin shRNA組與這兩組的G2，S期差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。Egr1-survivin shRNA組與YM155組相比，G2期Egr1-survivin shRNA組高于YM155組，S期低于YM155組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

組別G1G2S空白對(duì)照組83.02±1.345.22±0.17①11.76±1.26①空載體對(duì)照組82.51±0.146.01±0.42①11.47±0.30①Egr1-survivin shRNA組55.24±0.5819.07±0.4025.69±0.19YM155組50.68±0.2513.10±0.43①36.22±0.29①

注：與Egr1-survivin shRNA組相比,①P<0.01

2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè) ECA109細(xì)胞各處理組凋亡的結(jié)果 ECA109細(xì)胞凋亡百分率：空白對(duì)照組1.56±0.59；空載體對(duì)照組1.91±0.30；Egr1-survivin shRNA組15.39±0.49；YM155組11.55±1.31。Egr1-survivin shRNA組及YM155組凋亡率均明顯高于空白對(duì)照組和空載體對(duì)照組，Egr1-survivin shRNA組與YM155組相比凋亡率也明顯增高，Egr1-survivin shRNA組與其他三組的細(xì)胞凋亡率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，(P<0.01)。經(jīng)Egr1-survivin shRNA+放療及YM155+放療處理后，ECA109細(xì)胞的凋亡明顯增加(圖3)。

圖2 食管鱗癌ECA109細(xì)胞各處理組細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果

1.空白對(duì)照組; 2.空載體對(duì)照組; 3.Egr1-survivin shRNA組; 4.YM155組

圖3 食管鱗癌ECA109細(xì)胞各處理組凋亡檢測(cè)結(jié)果

1.空白對(duì)照組; 2.空載體對(duì)照組; 3.Egr1-survivin shRNA組; 4.YM155組

3 討 論

食管癌是我國常見的消化系統(tǒng)腫瘤，放療是頸段及局部進(jìn)展期胸段食管癌的主要根治手段，但放療的療效并不令人滿意。張安度等[4]對(duì)1349例食管癌進(jìn)行的三維適形放療療效分析，全組患者1、3、5年局控率分別為75.2%、54.5%、50.1%；1、3、5 年生存率分別為68.6%、36.2%、24.5%，中位生存期21個(gè)月。說明雖然隨著放療技術(shù)進(jìn)入三維時(shí)代，食管癌放療療效仍有待于進(jìn)一步提高。即便是近期完成的NEOCRTEC5010研究，其結(jié)果顯示對(duì)于潛在可切除的胸段食管鱗癌，術(shù)前同步放化療組的pCR率為43.2%，OS為100.1個(gè)月，較以前的治療模式有明顯提高[11]，但與其他常見惡性腫瘤的療效相比，食管癌放療的生存期仍不能令人滿意，急需探索新的治療靶點(diǎn)和治療理念。

survivin蛋白與食管癌的發(fā)生及進(jìn)展密切相關(guān)，Dabrowski等[12]研究顯示，survivin在食管鱗癌標(biāo)本中表達(dá)明顯升高，其陽性率可達(dá)83.33%，而且文獻(xiàn)[7]顯示其過表達(dá)與患者較差的預(yù)后相關(guān)。Egr1基因啟動(dòng)子區(qū)含有CArG盒/CC(A+T-rich)GG區(qū)的特殊結(jié)構(gòu)，使Egr1基因能被放射線所誘導(dǎo)而表達(dá)增高。利用這一特點(diǎn)，我們以survivin作為治療的靶點(diǎn)，利用可被電離輻射誘導(dǎo)的Egr1基因啟動(dòng)子，構(gòu)建Egr1-survivin shRNA質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染食管鱗癌ECA109細(xì)胞后用X射線照射，測(cè)定細(xì)胞內(nèi)survivin的mRNA表達(dá)和蛋白水平的變化情況，并觀察Egr1-survivin shRNA下調(diào)survivin基因后對(duì)ECA109細(xì)胞周期及凋亡的影響，以確定這種干預(yù)否會(huì)進(jìn)一步增加食管癌細(xì)胞的放射敏感性，促進(jìn)食管癌細(xì)胞死亡。

本研究結(jié)果顯示，Egr1-survivin shRNA+放療處理后，ECA109細(xì)胞survivin mRNA及蛋白的表達(dá)水平均較對(duì)照組明顯下調(diào)，證實(shí)Egr1-survivin shRNA質(zhì)粒合成是成功的，經(jīng)X射線照射誘導(dǎo)，Egr1啟動(dòng)子確實(shí)帶動(dòng)了位于其下游合成質(zhì)粒中的survivin shRNA表達(dá)增加，并進(jìn)而降低了survivin mRNA及蛋白的表達(dá)，與文獻(xiàn)[8]報(bào)道的通過survivin-shRNA轉(zhuǎn)染可下調(diào)survivin的表達(dá)相一致。用以做陽性對(duì)照的是YM155+放療處理，YM155是一種靶向survivin的小分子藥物，其可與survivin基因的啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合，從而選擇性地抑制其表達(dá)[13]。文獻(xiàn)[14]報(bào)道其可通過降低survivin表達(dá)而發(fā)揮放療增敏作用，本研究也顯示YM155+放療處理后，ECA109細(xì)胞survivin mRNA及蛋白的表達(dá)水平較空白對(duì)照組及空載體組均明顯下調(diào)，證實(shí)其所具有survivin基因的表達(dá)抑制作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，Egr1-survivin shRNA+放療處理后，ECA109細(xì)胞survivin mRNA及蛋白的表達(dá)水平均較三個(gè)對(duì)照組下調(diào)。伴隨著survivin表達(dá)下調(diào)，G2期與S期細(xì)胞比例明顯增加，發(fā)生了明顯的G2期與S期阻滯，且細(xì)胞凋亡率明顯增高，表明Egr1-survivin shRNA轉(zhuǎn)染+放療可明顯增加食管癌細(xì)胞的放射敏感性。本研究與文獻(xiàn)[10, 15-17 ]報(bào)道的結(jié)論類似，利用Egr1基因啟動(dòng)子，通過輻射誘導(dǎo)，帶動(dòng)不同的靶基因表達(dá)上調(diào)，其抑瘤效應(yīng)明顯優(yōu)于單純放療和單純基因治療。

本研究結(jié)果顯示，Egr1-survivin shRNA+放療對(duì)于survivin表達(dá)的抑制在所有處理組中是最強(qiáng)的，相較于單純放療、YM155處理+放療，可更大程度地降低survivin的表達(dá)。且經(jīng)Egr1-survivin shRNA轉(zhuǎn)染降低survivin后聯(lián)合放療，其促凋亡作用也強(qiáng)于YM155+放療處理，證實(shí)此種方法相比于YM155處理，對(duì)于食管鱗癌細(xì)胞具有更強(qiáng)的放射增敏作用。由此可得出：Egr1-survivin shRNA聯(lián)合放療可進(jìn)一步增加食管鱗癌細(xì)胞放療敏感性，是一種有前景的食管癌治療基因-放療思路，有進(jìn)一步研究價(jià)值。因本實(shí)驗(yàn)為細(xì)胞學(xué)研究，其得出的結(jié)論還有待于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及人體的臨床試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。