結(jié)核病是由人類特有的胞內(nèi)病原體—結(jié)核分枝桿菌引起的，并通過呼吸道在人與人之間傳播的一種慢性傳染性疾病。結(jié)核分枝桿菌具有特殊的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，含豐富的脂質(zhì)，對外界環(huán)境和藥物有很強(qiáng)的抵御能力。細(xì)胞內(nèi)生長的結(jié)核分枝桿菌致病機(jī)制已經(jīng)研究得很透徹，而胞外生長的結(jié)核分枝桿菌引起的病理變化則很少涉及[1～3]。長期以來，人們圍繞結(jié)核病免疫相關(guān)的T淋巴細(xì)胞（尤其是CD4+的Th1細(xì)胞）、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞（dendritic cells，DC）進(jìn)行了大量研究，并取得了一些進(jìn)展。目前，多數(shù)研究者肯定的觀點(diǎn)是，Th1型免疫應(yīng)答在結(jié)核病的適應(yīng)性免疫應(yīng)答中起關(guān)鍵作用，是介導(dǎo)結(jié)核病保護(hù)性免疫的主要群體；巨噬細(xì)胞作為機(jī)體抗MTB感染的主要免疫效應(yīng)細(xì)胞，在結(jié)核病的保護(hù)性免疫應(yīng)答中也發(fā)揮著重要作用。但是，對于參與結(jié)核病免疫的另一個(gè)重要細(xì)胞群體，也是MTB感染后最先由外周血遷移至感染病灶的細(xì)胞—中性粒細(xì)胞的研究卻明顯滯后[4]。本研究擬通過結(jié)核分枝桿菌和卡介苗誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞形成NETs（neutrophil extracellular traps）結(jié)構(gòu)，探討中性粒細(xì)胞在結(jié)核感染過程中所扮演的角色，揭示卡介苗預(yù)防結(jié)核分枝桿菌感染的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 結(jié)核分枝桿菌國際標(biāo)準(zhǔn)株、BCG菌種由北京結(jié)核病胸部腫瘤研究所提供，胎牛血清（FBS）、RPMI-1640、Middlebrook 7H9培養(yǎng)基購自美國Sigma公司，Sytox? Green 試劑盒購自美國Eugene公司，人中性粒細(xì)胞提取試劑盒購自天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司，抗-H3Cit、抗-MPO抗體購自Abcam公司，Quant-iTTMPicoGreen ? dsDNA Reagent and Kits購自ThermoFisher公司。人外周血標(biāo)本來自本院健康體檢志愿者，無外傷、感染病史，HBV、HCV、HIV均陰性，并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌培養(yǎng) 取標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv和BCG接種于5ml無菌7H9液體培養(yǎng)基中，37℃搖床恒溫箱中培養(yǎng)3～4周，搖床速度為100～120轉(zhuǎn)/h，吸取100μl菌液接種于5ml新鮮7H9液體培養(yǎng)，繼續(xù)搖床培養(yǎng)7～10d。取菌液100μl重懸于PBS中，調(diào)整至麥?zhǔn)蠞舛?.5。

1.2.2 中性粒細(xì)胞分離 取10ml離心管一支，將健康志愿者EDTA抗凝血4ml小心加到4ml中性粒細(xì)胞分離液之上。3 000r/min，水平離心30min，離心后吸取中性粒細(xì)胞層后加入紅細(xì)胞裂解液，充分裂解后離心，3 000r/min，30min后取中性粒細(xì)胞層加入PBS洗滌。用含5%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基重懸后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.2.3 NETs誘導(dǎo) 加入0.5ml中性粒細(xì)胞重懸液（含細(xì)胞數(shù)4×105個(gè)）于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，放入多聚賴氨酸處理的無菌玻片，5%的CO2培養(yǎng)箱中1h靜置處理細(xì)胞，對照組、MTB組、BCG組分別加入PBS、MTB、BCG各0.5ml，各組設(shè)平行3組。5% 的CO2培養(yǎng)箱中3h后收集細(xì)胞上清，用于檢測游離DNA。各孔加入0.5ml 4%多聚甲醛，4℃固定過夜，用于免疫熒光染色。

1.2.4 NETs檢測 免疫熒光染色：從6孔板中取出細(xì)胞爬片，PBS洗滌3次，0.5%Triton X-100透化1min，PBS洗滌3次，加入5%FBS于37℃濕盒中封閉30min。加入一抗（抗-H3Cit 1∶400，抗-MPO 1∶400）于37℃濕盒中封閉1h。PBS洗滌3次后加入二抗（抗-H3Cit 1∶1000，抗-MPO 1∶1000）于37℃濕盒中封閉1h。PBS洗滌3次后加入DAPI避光染色10min，加封片劑封片。激光共聚焦顯微成像儀檢測NETs。

1.2.5 游離DNA定量檢測 按Quant-iTTMPicoGreen ?dsDNA Reagent and Kits試劑盒說明書進(jìn)行操作，倍比稀釋標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，激發(fā)光波長480nm，發(fā)射光波長520nm，熒光檢測儀檢測熒光信號并記錄結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NETs的激光共聚焦顯微成像 激光共聚焦顯微成像分析發(fā)現(xiàn)：中性粒細(xì)胞在BCG和MTB的刺激下，可見絲狀或環(huán)狀DNA骨架結(jié)構(gòu)，H3Cit和MPO附著于DNA骨架結(jié)構(gòu)上。中性粒細(xì)胞的體積增大，且產(chǎn)生環(huán)狀或絲狀骨架結(jié)構(gòu)的細(xì)胞比例增多。BCG組和MTB組標(biāo)記H3Cit和MPO顆粒物的熒光強(qiáng)度較對照組明顯增強(qiáng)，即DNA骨架結(jié)構(gòu)上附著的H3Cit和MPO顆粒數(shù)量增多，見圖1。

圖1 NETs免疫熒光染色

2.2 游離DNA含量 中性粒細(xì)胞經(jīng)BCG和MTB刺激后，上清中游離DNA含量較對照組顯著增高（P<0.05），MTB刺激組游離DNA含量明顯高于BCG刺激組（P<0.05）。該結(jié)果與免疫熒光染色結(jié)果一致，證明中性粒細(xì)胞經(jīng)BCG和MTB刺激可形成NETs，且MTB刺激效率明顯強(qiáng)于BCG，見圖2。

圖2 游離DNA含量

3 討論

盡管中性粒細(xì)胞占外周循環(huán)白細(xì)胞數(shù)量的50%～80%，但其吞噬作用一直被低估，免疫學(xué)的研究重點(diǎn)主要集中在單核吞噬細(xì)胞如單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。中性粒細(xì)胞通過直接吞噬細(xì)菌、脫顆粒及細(xì)胞因子的分泌，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白介素-1（IL-1）來發(fā)揮先天性免疫作用。2004年Brinkmann等[5]首先報(bào)道了中性粒細(xì)胞活化后會(huì)在胞外形成類似網(wǎng)狀的結(jié)構(gòu)—中性粒細(xì)胞胞外捕獲網(wǎng)，并認(rèn)為這是中性粒細(xì)胞發(fā)揮先天性免疫作用的一種重要機(jī)制。NETs由雙鏈DNA的骨架結(jié)構(gòu)和具有抗菌活性的蛋白質(zhì)：髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）、組蛋白和中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶（neutrophilelastase，NE）等組成。病原微生物（包括結(jié)核分枝桿菌）、多種促炎因子（IL-8、TNF-α等）、活化血小板、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）和乙酸肉豆蔻佛波酯（phorbolmyristateacetate，PMA）等多種生物化學(xué)因子均可以刺激中性粒細(xì)胞NETs形成[5]。NETs是血漿中游離DNA（cell-free DNA，cf DNA）的重要來源，因此有研究認(rèn)為檢測血漿中cf DNA濃度可以作為反映NETs形成的一種方式[6]。目前主要有3種方法通過檢測NETs組分用于NETs的檢測[7]：①檢測NETs的DNA骨架結(jié)構(gòu)，通過SYTOX染色的方式進(jìn)行檢測，這種染料可以直接插入游離的DNA中且不會(huì)對活細(xì)胞產(chǎn)生影響；②通過免疫熒光染色檢測NETs組分髓過氧化物酶和組蛋白H3Cit，用來區(qū)分核DNA與細(xì)菌、線粒體DNA的組蛋白；③檢測中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶（NE）濃度來反映NETs的水平。本研究通過免疫熒光染色檢測NETs組分MPO和H3Cit及檢測cf DNA證實(shí)MTB和BCG能夠在體外誘導(dǎo)NETs形成并建立成熟的誘導(dǎo)方法。

結(jié)核分枝桿菌是逃避免疫系統(tǒng)最成功的胞內(nèi)病原體之一，主要感染呼吸系統(tǒng)，但也可能影響其他器官，與其他致病菌不同的是不產(chǎn)生毒素。由于結(jié)核分枝桿菌屬于胞內(nèi)感染，細(xì)胞外的中性粒細(xì)胞在結(jié)核病中可能扮演的角色被忽略。中性粒細(xì)胞可以分泌活性氧（ROS）、彈性蛋白酶、膠原蛋白酶和髓過氧化物酶，通過這些物質(zhì)以一種非選擇性的方式直接殺滅結(jié)核分枝桿菌和受感染的宿主細(xì)胞或者通過調(diào)節(jié)早期炎癥反應(yīng)增強(qiáng)巨噬細(xì)胞對結(jié)核桿菌的清除能力，這些對于控制結(jié)核感染至關(guān)重要[8，9]。結(jié)核分枝桿菌利用吞噬細(xì)胞復(fù)制，也作為傳播至整個(gè)宿主生物體的一種方式。中性粒細(xì)胞聯(lián)合巨噬細(xì)胞可以有效地抑制結(jié)核感染，并有助于早期肉芽腫形成[10]。肉芽腫是一種由免疫細(xì)胞組成的結(jié)構(gòu)，用于應(yīng)對原發(fā)性感染。結(jié)核分枝桿菌通過增加中性粒細(xì)胞的凋亡以阻止其產(chǎn)生肉芽腫來包裹這些細(xì)菌，凋亡中性粒細(xì)胞的胞葬作用導(dǎo)致免疫應(yīng)答向促炎方向轉(zhuǎn)化。不同基因型的結(jié)核分枝桿菌都可誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞形成NETs。NETs 能夠有效地捕獲侵入的分枝桿菌，隔離有毒物質(zhì)以保護(hù)周圍組織免受損害，但無法殺滅捕獲的結(jié)核分枝桿菌[11，12]。

大量的體內(nèi)和體外試驗(yàn)研究證實(shí)中性粒細(xì)胞具有吞噬結(jié)核分枝桿菌的能力。在小鼠感染BCG或MTB一天后，中性粒細(xì)胞聚積在小鼠肺組織和呼吸道中，其中1.6%的中性粒細(xì)胞內(nèi)含有結(jié)核分枝桿菌[13]。在體外分離的感染結(jié)核分枝桿菌的人肺組織中，大約7%的感染細(xì)胞是中性粒細(xì)胞[14，15]。而關(guān)于中性粒細(xì)胞殺死結(jié)核分枝桿菌的數(shù)據(jù)相互矛盾。有研究發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞的抗細(xì)菌活性較差，即使被IFN-γ刺激（能夠激活巨噬細(xì)胞的抗菌性能），抗細(xì)菌活性也沒有明顯增強(qiáng)[13，16]。而另外的研究報(bào)道中性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞衍生的殺菌分子確實(shí)能在體外殺死結(jié)核分枝桿菌[17，18]。中性粒細(xì)胞對MTB的殺傷能力較差，這使得一些研究者認(rèn)為它們隱藏著結(jié)核分枝桿菌，從而逃避巨噬細(xì)胞的殺傷作用[19]。另一方面，中性粒細(xì)胞增加了巨噬細(xì)胞的殺菌活性：巨噬細(xì)胞吞噬凋亡的中性粒細(xì)胞，并利用其殺菌肽對抗細(xì)胞內(nèi)MTB[20]。部分中性粒細(xì)胞的殺菌活性是由中性粒細(xì)胞胞外捕獲網(wǎng)介導(dǎo)的，中性粒細(xì)胞經(jīng)MTB刺激能釋放含有中性粒細(xì)胞彈性酶和組蛋白的胞外捕獲網(wǎng)，但不能殺死MTB[21]。此外，有人認(rèn)為胞外捕獲網(wǎng)可能為細(xì)胞外結(jié)核的生長提供了一個(gè)平臺(tái)，從而有助于迅速擴(kuò)大肺部病變[22]。另外中性粒細(xì)胞胞外捕獲網(wǎng)可通過降低T細(xì)胞的活化閾值直接激活T細(xì)胞[23]。熱休克蛋白72（HSP-72）對消除結(jié)核分枝桿菌具有重要作用，HSP-72存在于凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞中，同時(shí)在NETs內(nèi)的DNA也被發(fā)現(xiàn)，這些對于遏制和消除結(jié)核分枝桿菌具有重要意義[24]。

綜上所述，關(guān)于中性粒細(xì)胞是否能夠殺死MTB存在很大爭議。這些具有極高殺菌潛力的中性粒細(xì)胞及NETs對分枝桿菌是否有明確的殺菌作用，還有待進(jìn)一步研究探討。