隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)水平發(fā)展及人們生活水平不斷改善，巨大兒的發(fā)生率大幅度增加，不僅增加了妊娠期糖尿病、剖宮產(chǎn)、嬰兒死亡等風(fēng)險(xiǎn)，而且對(duì)子代遠(yuǎn)期健康造成不良影響[1]。探討巨大兒發(fā)生的分子機(jī)制，將成年代謝疾病的防控節(jié)點(diǎn)提前，具有非常重要的意義。胎兒生長(zhǎng)發(fā)育所需的一切營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)都是由母體通過胎盤供應(yīng)，胎盤細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育類似腫瘤細(xì)胞，常常被稱作“偽腫瘤”[2]。去泛素化酶（Ubiquitin specific protease 2a，USP2a）與細(xì)胞增殖和凋亡有關(guān)，參與腫瘤細(xì)胞周期調(diào)控[3]。但USP2a與巨大兒發(fā)生的相關(guān)研究國(guó)內(nèi)外尚未見報(bào)道。本研究旨在通過分析USP2a在巨大兒胎盤中的作用，為探討巨大兒的發(fā)病機(jī)制提供新思路。

1 材料與方法

1.1 一般資料 采用病例對(duì)照研究，經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，孕婦簽署知情同意書。選擇我院2014年9月～2015年6月分娩的非糖尿病性巨大兒29例（巨大兒組），另選擇同期住院足月分娩正常體重兒31例（正常兒組），采集產(chǎn)婦胎盤樣本。兩組孕婦年齡、孕前BMI、分娩孕周差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），排除混雜因素。所有研究對(duì)象均為單胎初產(chǎn)，無(wú)肝炎、結(jié)核等急慢性傳染病史，無(wú)心臟病、甲亢、肝腎疾病等內(nèi)科疾病，常規(guī)產(chǎn)檢，在孕24～28周進(jìn)行75g OGTT檢查，以排除妊娠期糖尿病等其他妊娠合并癥和并發(fā)癥。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集 無(wú)菌條件下，胎盤娩出后5min內(nèi)，在胎盤母體面中央避開出血、梗死及鈣化區(qū)取絨毛組織1cm×1cm×1cm，生理鹽水沖洗干凈后置于無(wú)菌凍存管內(nèi)，置液氮中保存。

1.2.2 ELISA實(shí)驗(yàn) 酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)USP2a、MDM2、P53蛋白的表達(dá)，試劑盒購(gòu)自上海滬宇生物科技有限公司，實(shí)驗(yàn)步驟按照說(shuō)明書進(jìn)行。

1.2.3 Real Time PCR檢測(cè)選擇USP2a下游底物MDM2、CCND1及FASN進(jìn)行qPCR驗(yàn)證。①引物及探針的設(shè)計(jì)和合成：用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)GAPDH、MDM2、CCND1及FASN的 引物和 探針，委托擎科生物技術(shù)有限公司合成，經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證能擴(kuò)增目的基因后采用。引物及探針序列（5′-3′）。②胎盤組織中RNA的提取：取出保存的胎盤組織，每次剪取100mg左右，置入研缽中，倒入液氮研磨；研磨至粉狀，加入1ml TRIzol，然后根據(jù)總RNA提取試劑盒說(shuō)明書提取組織總RNA，紫外分光光度法檢測(cè)RNA濃度與純度，-70℃保存。③逆轉(zhuǎn)錄：用Takara RR036TA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒在T100 thermal cycler儀器中進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)體系核酸500ng，MIX 2μl，加水補(bǔ)充到10ml，反應(yīng)條件：37℃ 15min，85℃ 5s，逆轉(zhuǎn)完畢后補(bǔ)充190μl的無(wú)酶水，4℃保存。④Real Time PCR：所有Real Time PCR反應(yīng)均在Roche LightCycler 480Ⅱ儀上進(jìn)行，每一個(gè)標(biāo)本均做3個(gè)復(fù)孔，每次反應(yīng)都帶入標(biāo)準(zhǔn)品。PCR反應(yīng)體系為：SYBR 2.5μl、前引物0.1μl、后引物0.1μl、ROX 0.1μl、無(wú)酶水1.7μl，混勻后取4μl加入384孔板，再取1μl的cDNA加入384孔板中，形成5μl的體系。⑤數(shù)據(jù)分析：根據(jù)擴(kuò)增曲線，由SDS2.4軟件系統(tǒng)輸出得到每個(gè)PCR循環(huán)反應(yīng)的閾值，即模板cDNA擴(kuò)增達(dá)到某一熒光強(qiáng)度的循環(huán)次數(shù)，每個(gè)樣本檢測(cè)重復(fù)3次，取其平均值，其中檢測(cè)基因表達(dá)時(shí)GAPDH作為內(nèi)參，用來(lái)校正濃度差異引起的誤差。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Stata 10.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，定量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）描述，符合正態(tài)分布的組間比較采用t檢驗(yàn)；而呈偏態(tài)分布的組間比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。數(shù)據(jù)作圖采用GraphPad Prism 5.0。

2 結(jié)果

2.1 兩組一般情況比較 兩組孕婦年齡、分娩孕周等差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），兩組胎兒體重有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05），見表1。

表1 兩組一般情況比較（±s）

表1 兩組一般情況比較（±s）

項(xiàng)目 巨大兒組 對(duì)照組 t/z P例數(shù) 29 31孕婦年齡（歲） 26.76±3.46 26.10±2.71 0.820 0.420孕前BMI（kg/m2）20.93±4.59 19.73±1.91 1.312 0.200分娩孕周（周） 39.63±0.62 39.60±1.08 0.170 0.870孕次（次） 1.38±0.86 1.19±0.48 1.030 0.312新生兒性別 1.791 0.181男19 15女10 16新生兒出生體重（g） 4280.69±319.35 3330.00±321.55 11.480＜0.05

2.2 兩組孕婦胎盤中USP2a、MDM2及P53蛋白含量比較 經(jīng)過ELISA檢測(cè)，巨大兒胎盤中USP2a蛋白含量高于正常體重兒，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=1.990，P=0.047）。經(jīng)過ELISA檢測(cè)，巨大兒胎盤中MDM2蛋白含量高于對(duì)照組，而P53蛋白含量低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表2。

表2 兩組胎盤中USP2a、MDM2、P53蛋白含量比較（±s）

表2 兩組胎盤中USP2a、MDM2、P53蛋白含量比較（±s）

蛋白 巨大兒組 對(duì)照組 Z P USP2a 1863.74±637.57 1573.77±421.449 1.990 0.047 MDM2 60.80±28.15 46.84±12.77 2.160 0.027 P53 292.04±297.32 627.48±709.58 -2.040 0.042

2.3 兩組孕婦胎盤中MDM2、CCND1及FASN mRNA水平比較 巨大兒組胎盤中MDM2表達(dá)水平高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=-2.025，P=0.043），而CCND1及FASN表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=-0.500，P=0.617；Z=-1.202，P=0.229），見圖1。

圖1 兩組胎盤中MDM2、CCND1及FASN mRNA表達(dá)情況

3 討論

泛素化及去泛素化是機(jī)體生命進(jìn)程中必不可少的翻譯后修飾過程，蛋白經(jīng)泛素化修飾后被降解，去泛素化酶則能逆轉(zhuǎn)泛素化過程使蛋白免受降解[4]。USP2基因位于人類染色體11q23.3，是一種重要的去泛素化酶，通過特異性識(shí)別靶蛋白，使靶蛋白去泛素化并阻礙其降解，與細(xì)胞增殖和凋亡有關(guān)，參與細(xì)胞周期調(diào)控[5]。USP2具有3個(gè)亞型，其中USP2a能對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行周期調(diào)控[6]。胎盤細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育類似腫瘤細(xì)胞，常常被稱作“偽腫瘤”，USP2a對(duì)腫瘤細(xì)胞周期的調(diào)控作用提示USP2a可能也調(diào)控胎盤細(xì)胞的增殖、凋亡和浸潤(rùn)，影響胎盤、胎兒的生長(zhǎng)發(fā)育。目前國(guó)內(nèi)外未見USP2a與巨大兒關(guān)系的研究報(bào)道。我們檢測(cè)巨大兒胎盤中USP2a的蛋白表達(dá)水平，研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，巨大兒胎盤中USP2a蛋白表達(dá)水平上調(diào)，提示胎盤中USP2a與巨大兒發(fā)生有關(guān)。

研究證實(shí)USP2a通過特異性識(shí)別靶蛋白（底物），使靶蛋白去泛素化并阻礙其降解[6]。常見的靶蛋白底物有脂肪酸合成酶（Fatty Acid Synthetase，F(xiàn)ASN），泛素蛋白連接酶（Murine Double Minute 2，MDM2），細(xì)胞周期蛋白D1（Cyclin-D1，CCND1）等。研究表明在前列腺癌中FASN的蛋白水平是通過USP2a去泛素化調(diào)控，從而激活細(xì)胞程序性死亡[7]。作為一種癌基因，USP2a異位表達(dá)最終改變MDM2的穩(wěn)定性[8]。Kim等[9]發(fā)現(xiàn)在膀胱癌細(xì)胞中USP2a加速CCND1降解從而導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯?；谏鲜鰧?shí)驗(yàn)理論，我們選擇USP2a下游底物MDM2、CCND1及FASN進(jìn)行qPCR驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)巨大兒胎盤中MDM2表達(dá)水平高于正常兒，而CCND1及FASN表達(dá)并無(wú)差異。我們推斷，在巨大兒胎盤中USP2a可能通過去泛素化作用，特異性識(shí)別靶蛋白MDM2，抑制MDM2降解。

MDM2-P53是機(jī)體內(nèi)一種重要的作用模式，同時(shí)MDM2是USP2a底物之一。而MDM2同時(shí)也是P53的泛素連接酶，因此MDM2的增多又促進(jìn)了P53的泛素化及降解，最終導(dǎo)致P53誘導(dǎo)胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡減少，胎盤過度生長(zhǎng)，巨大兒發(fā)生。而且進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)也驗(yàn)證了我們的假設(shè)，結(jié)果顯示巨大兒胎盤中MDM2蛋白表達(dá)增高，P53蛋白表達(dá)降低。

近年來(lái)多個(gè)腫瘤耐藥研究中心發(fā)現(xiàn)USP2a能夠減少腫瘤細(xì)胞的凋亡，從而使其對(duì)許多化療藥物產(chǎn)生耐藥性[10]。研究發(fā)現(xiàn)USP2a在體內(nèi)與MDM2相關(guān)。在腫瘤來(lái)源的細(xì)胞系中用siRNA干擾USP2a轉(zhuǎn)染后導(dǎo)致P53蛋白增加與P53靶基因的表達(dá)上調(diào)[8]。P53作為基因組衛(wèi)士發(fā)揮阻滯細(xì)胞周期、促進(jìn)細(xì)胞凋亡及基因組穩(wěn)定性的作用。如MDM2結(jié)合P53使其失活，導(dǎo)致正常生物學(xué)功能喪失。USP2a-MDM2-P53通路在腫瘤方面的研究結(jié)果也從另一方面支持我們的假設(shè)，后期我們還將在胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞系中通過體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，胎盤中USP2a表達(dá)上調(diào)通過MDM2-P53通路參與巨大兒發(fā)生，本研究結(jié)果為巨大兒的研究提供新思路，并為臨床巨大兒防治提供理論依據(jù)。尋找特異性阻斷MDM2與USP2a之間相互作用的小分子多肽，可能有助于指導(dǎo)臨床有效干預(yù)巨大兒的發(fā)生。