李夢，劉艷麗，王真，宋云揚，蔣輝

國民核生化災害防護國家重點實驗室，北京 102205

已往的研究[1-4]表明，南美洲響尾蛇恐怖亞科蛇的蛇毒（venom of crotalus durissus terrificus，VCDT）具有鎮(zhèn)痛作用。2008年，Konno等證實這種響尾蛇毒素中發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用的是一條由14個氨基酸殘基（＜EFSPENC QGESQPC，＜E代表焦谷氨酸，含有一對二硫鍵C7-C14）構(gòu)成的多肽，命名為crotalphine（CRP）[5-6]。Konno等在熱板實驗、炎癥模型等多種疼痛模型上，證實CRP注射給藥和口服鎮(zhèn)痛均具有良好的鎮(zhèn)痛活性[5-12]，因而CRP可以作為新型鎮(zhèn)痛藥物先導物，具有非常好的開發(fā)前景。然而，迄今有關CRP的結(jié)構(gòu)與其鎮(zhèn)痛活性關系的研究報道并不多，需要進一步闡明。

丙氨酸掃描即是將蛋白的某段目標序列或多肽中重要的氨基酸殘基替換成無特殊側(cè)鏈、中性的丙氨酸，研究突變前后目標多肽的特定屬性的變化，從而確定關鍵的氨基酸位點，為氨基酸定點突變提供指導。為進一步研究CRP結(jié)構(gòu)與其鎮(zhèn)痛活性之間的關系，我們采用丙氨酸掃描策略將CRP中所有非丙氨酸殘基位點進行突變，共設計合成14個突變體（結(jié)構(gòu)見表1）。采用化學致痛的醋酸扭體實驗模型對CRP突變體進行鎮(zhèn)痛活性評價，研究CRP結(jié)構(gòu)中關鍵的氨基酸位點，為后續(xù)CRP的結(jié)構(gòu)改造研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

ICR 小鼠，3～4周齡，體重 20±2 g，購于北京華阜康生物責任有限公司。

CRP的丙氨酸突變體多肽由南京金斯瑞責任有限公司合成（純度＞98%）；冰醋酸（北京北化精細化學品有限責任公司，分析純）；生理鹽水（0.9%氯化鈉注射液，石家莊四藥有限公司）。

1.2 多肽合成

采用丙氨酸掃描策略將CRP中所有非丙氨酸殘基位點進行突變，編號、相對分子質(zhì)量及對應關系見表1。

表1 CRP突變體的氨基酸序列

1.3 CRP的時間-鎮(zhèn)痛效應關系研究

健康ICR小鼠，雌雄各半，隨機分為生理鹽水對照組（0.9%氯化鈉溶液）和CRP給藥組（100 μg/kg），均灌胃給藥。小鼠于實驗前禁食12 h，給藥后 1、2、3、4、5、6 h腹腔注射 2%醋酸（現(xiàn)配）。觀察并記錄注射醋酸后15 min內(nèi)小鼠扭體次數(shù)，扭體反應抑制率（%）=［（生理鹽水對照組平均扭體次數(shù)-給藥組平均扭體次數(shù)）/生理鹽水對照組平均扭體次數(shù)］×100%。數(shù)據(jù)以x±s表示，采用GraphPad Prism 6.0進行統(tǒng)計學分析，采用獨立樣本t檢驗確定各指標組間差異是否具有統(tǒng)計學意義，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

1.4 CRP的劑量-鎮(zhèn)痛效應關系研究

根據(jù)CRP的時間-鎮(zhèn)痛效應關系研究結(jié)果，選擇給藥后2 h，腹腔注射2%醋酸，設計以25、50、100、200、400、800、1600 μg/kg的劑量研究CRP的劑量-鎮(zhèn)痛效應關系，方法參照1.3。

1.5 丙氨酸掃描的突變體活性評價

根據(jù)CRP的時間-鎮(zhèn)痛效應關系和劑量-鎮(zhèn)痛效應關系研究結(jié)果，CRP突變體的給藥劑量選擇100 μg/kg，給藥后2 h腹腔注射2%醋酸，對CRP突變體進行鎮(zhèn)痛活性評價，方法參照1.3。

2 結(jié)果

2.1 CRP的時間-鎮(zhèn)痛效應關系研究

100 μg/kg CRP抑制醋酸引起小鼠的扭體反應隨時間的變化關系見圖1。隨著給藥時間的變化，CRP抑制醋酸引起小鼠的扭體反應也相應發(fā)生改變，其中，給藥后2～3 h，CRP對醋酸引起小鼠扭體反應的抑制作用達到最強，與生理鹽水對照組相比，抑制率為44%（P＜0.01）。因此，對于突變體的活性評價選擇給藥后2 h進行。

圖1 CRP的時間-鎮(zhèn)痛效應關系

2.2 CRP的劑量-鎮(zhèn)痛效應研究

在醋酸扭體模型中對CRP的劑量-鎮(zhèn)痛效應進行研究，結(jié)果見圖2。給藥后2 h，CRP對由醋酸引起小鼠扭體反應的抑制作用呈一定的劑量效應關系，在25～1600 μg/kg劑量范圍，隨著給藥劑量的增加，抑制作用也逐漸增強。

圖2 CRP的劑量-鎮(zhèn)痛效應關系

2.3 CRP-丙氨酸掃描突變體的活性評價

CRP-丙氨酸掃描突變體鎮(zhèn)痛活性評價結(jié)果見圖3。丙氨酸掃描并合成14個CRP突變體。在醋酸扭體實驗模型中，與生理鹽水對照組相比，突變體CRP-F2A、CRP-S3A、CRP-P4A、CRPE5A、CRP-N6A、CRP-C7A、CRP-Q8A、CRP-G9A、CRP-E10A、CRP-S11A、CRP-Q12A、CRP-P13A和CRP-C7S均有鎮(zhèn)痛作用，具有顯著性差異（P＜0.05）。與CRP相比，突變體CRP-Q12A的鎮(zhèn)痛作用無顯著變化，突變體CRP-Q8A鎮(zhèn)痛活性下降約17%（P＜0.05）。與CRP相比，突變體CRP-C14A鎮(zhèn)痛活性下降約30%（P＜0.01），突變體CRP-E5A鎮(zhèn)痛活性明顯增強約20%（P＜0.05）。其他位點的突變未能產(chǎn)生顯著的鎮(zhèn)痛活性變化。由此可見，CRP的第5位谷氨酸、第8位谷氨酰胺、第14位半胱氨酸是CRP的關鍵氨基酸位點。

圖3 丙氨酸掃描策略的CRP突變體的鎮(zhèn)痛活性評價

3 討論

本研究通過醋酸扭體實驗模型對CRP及丙氨酸掃描的突變體進行活性評價。結(jié)果顯示，與生理鹽水對照組相比，除CRP-C14A外，均有鎮(zhèn)痛作用。其中，與CRP相比，突變體CRP-E5A鎮(zhèn)痛活性增加約20%，推測該位點極性（或電荷）的改變對于鎮(zhèn)痛活性是有增強作用的。與CRP相比，突變體CRP-Q8A鎮(zhèn)痛活性下降約17%，但突變體CRP-Q12A的鎮(zhèn)痛活性變化不大。Konno[6]和Oliveira[13]等先后對這2個位點分別進行突變，生成突變體Q8K和Q12K、Q12R，結(jié)果表明CRP的12位谷氨酰胺突變不會對CRP的鎮(zhèn)痛活性產(chǎn)生影響，CRP的第8位谷氨酰胺突變對CRP的活性影響較大。本研究結(jié)果與Konno等一致，第8位谷氨酰胺是CRP發(fā)揮鎮(zhèn)痛活性的的關鍵氨基酸位點，而第12位谷氨酰胺不是CRP發(fā)揮鎮(zhèn)痛活性的關鍵氨基酸位點。

另外，本研究發(fā)現(xiàn)第7位半胱氨酸的突變對CRP的鎮(zhèn)痛活性影響不明顯，說明第7位半胱氨酸并非CRP的關鍵氨基酸位點，而第14位（C端）半胱氨酸突變（C14A）導致CRP的鎮(zhèn)痛活性下降約30%，推測C端半胱氨酸是CRP與靶點結(jié)合的關鍵氨基酸位點。

南美洲響尾蛇毒素CRP是一類由14個氨基酸殘基構(gòu)成的小肽，經(jīng)口服就可以發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用，是難得的鎮(zhèn)痛藥物先導物，具有潛在應用前景。本研究初步探討了CRP的一級結(jié)構(gòu)與其鎮(zhèn)痛活性的關系，確定其重要的氨基酸位點，為該肽進行構(gòu)性優(yōu)化提供了理論依據(jù)。