薄明井，寇航，陳靜，張惟材，葛欣，熊向華

1.河北大學 生命科學學院，河北 保定 071000；2.軍事醫(yī)學研究院 生物工程研究所，北京 100071

吡咯喹啉醌（pyrroloquinoline quinone，PQQ）是甲基營養(yǎng)菌合成的一種醌類化合物，是NAD和FAD之外的第三類氧化還原酶輔酶[1]。PQQ具有重要的生理功能，如清除氧自由基、增強線粒體功能、調(diào)節(jié)免疫、促進認知、防治輻射損傷和肝損傷、促進創(chuàng)傷愈合等[2]。PQQ作為促進認知的功能食品成分在美國已上市多年[3]，顯示其具有良好的藥用保健價值和廣闊的市場應用前景。

PQQ的化學合成工藝復雜、污染嚴重、成本高昂，生物合成是目前PQQ工業(yè)化制備的首選工藝。迄今發(fā)現(xiàn)只有某些革蘭陰性菌能產(chǎn)生PQQ，如乙酸鈣不動桿菌、肺炎克雷伯菌、扭脫甲基桿菌、氧化葡糖桿菌等[4]。本實驗室前期通過山梨糖脫氫酶（sorbose dehydrogenase，SDH）活性電泳法從土壤中篩選得到一株P(guān)QQ產(chǎn)生菌MP688[5]，已完成全基因組測序和基因組規(guī)模代謝網(wǎng)絡(luò)模建[6-7]。MP688經(jīng)過多輪物理和化學誘變后得到高產(chǎn)菌株J1-1，搖瓶培養(yǎng)PQQ產(chǎn)量達到100 mg/L左右。繼續(xù)通過傳統(tǒng)物理化學誘變來提高PQQ產(chǎn)量已經(jīng)很難，J1-1菌株的代謝工程改造是另一種有效手段。代謝工程理性改造建立在PQQ生物合成相關(guān)基因的完整注釋之上，但目前已知的PQQ生物合成相關(guān)基因功能并不能組成完整的PQQ生物合成路線，依然存在未知的PQQ生物合成相關(guān)基因等待發(fā)現(xiàn)。為篩選到新的PQQ生物合成相關(guān)基因，本研究對J1-1菌株進行Tn5轉(zhuǎn)座誘變，篩選得到1株P(guān)QQ生物合成水平顯著下降的突變株，經(jīng)插入位點鑒定確認了突變基因，同源重組敲除對應基因后進一步驗證表型。

1 材料與方法

1.1 材料

食甲基菌J1-1、大腸桿菌DH5α λ-pir感受態(tài)細胞、質(zhì)粒pCM66和pGX由本實驗室保存；大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞、快速質(zhì)粒小提試劑盒、細菌基因組DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收純化試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；限制性內(nèi)切酶購自Thermo公司；T4DNA連接酶、pEASY-Uni Seamless Cloning and Assembly Kit、DNA標準分子量購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；RNA提取試劑盒Bacteria RNA Extraction Kit、逆轉(zhuǎn)錄 HiScriptⅢ1st Strand cDNA Synthesis Kit（+gDNA Wiper）試劑盒購自南京諾唯贊有限公司；PCR引物（表1）合成及測序由北京擎科科技股份有限公司完成；其他生化試劑（分析純）購自國藥集團。

表1 PCR引物序列

低產(chǎn)培養(yǎng)基（LM）：MgSO4·7H2O 0.2 g/L，KH2PO41.4 g/L，（NH4）2SO43.0 g/L，Na2HPO43.0 g/L，MnCl2·4H2O 5.0 mg/L，ZnSO4·7H2O 5.0 mg/L，CuSO4·5H2O 0.5 mg/L，檸檬酸鐵 60.0 mg/L，甲醇10 mL/L，pH7.0，115℃滅菌30 min。

高產(chǎn)培養(yǎng)基（HM）：MgSO4·7H2O 0.2 g/L，KH2PO42.8 g/L，（NH4）2SO43.0 g/L，Na2HPO46.0 g/L，MnCl2·4H2O 5.0 mg/L，ZnSO4·7H2O 5.0 mg/L，CuSO4·5H2O 0.5 mg/L，檸檬酸鐵60.0 mg/L，甲醇10 mL/L，pH7.0，115℃滅菌30 min。

1.2 分子生物學操作

PCR、酶切、連接、轉(zhuǎn)化等常規(guī)分子生物學操作參照文獻方法[8]。

1.3 Tn5突變體庫構(gòu)建

從 EN-Tn5＜R6Kγori/KAN-2＞TNP Transposome Kit中取 1 μL Transposome加入 100 μL 食甲基菌J1-1感受態(tài)細胞混勻，冰浴5 min后轉(zhuǎn)移到預冷的電擊杯中，2.5 kV電壓電擊后迅速加入1 mL LM培養(yǎng)基，30℃、200 r/min復蘇培養(yǎng)2 h，涂布于LM平板（含卡那霉素50 μg/mL），倒置培養(yǎng)2～3 d。挑取單菌落于5 mL LM液體培養(yǎng)基（含卡那霉素50 μg/mL）中，30℃、200 r/min培養(yǎng)3 d，連續(xù)傳3代后仍有卡那霉素抗性，說明轉(zhuǎn)座序列可以穩(wěn)定傳代，以此方法建立突變體庫。

1.4 PQQ合成突變株篩選及PQQ合成水平檢測

PQQ是棕紅色小分子化合物，在食甲基菌J1-1發(fā)酵過程中被逐漸分泌到胞外[9]，使發(fā)酵液呈紅色，發(fā)酵液顏色深淺可直觀反映PQQ合成水平高低。挑取1.3的單菌落于5 mL LM液體培養(yǎng)基（含卡那霉素50 μg/mL）中，以J1-1為對照，30℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)3 d，挑選與對照菌發(fā)酵液顏色差異較大的菌株，采用分光光度法[10]檢測發(fā)酵液中PQQ合成水平。

1.5 質(zhì)粒拯救法鑒定插入位點

按照質(zhì)粒拯救法[11]進行。測序結(jié)果與J1-1基因組DNA序列進行比對，確定Tn5插入位點。

1.6 mpq-0708基因敲除

以J1-1基因組為模板，用引物0708-up-F/0708-up-R和0708-down-F/0708-down-R擴增上游及下游同源臂基因；以質(zhì)粒pGX-Gm為模板，用引物0708-gen-F/0708-gen-R擴增慶大霉素（Gm）基因片段。擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收。將上、下游同源臂基因、Gm基因和經(jīng)XhoⅠ、NotⅠ雙酶切的載體pGX-Gm用pEASYUni Seamless Cloning and Assembly Kit重組轉(zhuǎn)化，獲得pGX-up-Gm-down重組質(zhì)粒。

質(zhì)粒構(gòu)建成功后，以pGX-up-Gm-down質(zhì)粒為模板，用引物0708-up-F/0708-down-R擴增片段up-Gm-down，純化后電擊轉(zhuǎn)入J1-1感受態(tài)細胞，涂布LM平板（含Gm 50 μg/mL），30℃培養(yǎng)3 d，從平板上挑取單菌落，用引物0708-1700-F/0708-gen-R及0708-1700-R/0708-gen-F擴增2500 bp的up-gm及gm-down片段，用引物0708-gen-F/0708-gen-R擴增800 bp的Gm片段，驗證是否敲除成功。

1.7 敲除菌株表型測定

挑取野生菌J1-1、敲除菌J1-1Δ0708單菌落于5 mL LM液體培養(yǎng)基中于30℃活化24 h，按1%的接種量分別接種至100 mL LM及HM液體培養(yǎng)基中，30℃同步培養(yǎng)，間隔12 h取樣測定菌液D600nm值及PQQ相關(guān)指標，繪制生長曲線及PQQ生物合成曲線。

1.8 NADH/NAD+比率測定

采用CheKine NAD/NADH Assay Kit試劑盒測定野生菌J1-1和敲除菌J1-1Δ0708的NADH及NAD+含量，計算 NADH/NAD+比值。

1.9 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析

試管活化野生菌J1-1后按1%接種量分別接種至100 mL LM及HM液體培養(yǎng)基中，30℃、200 r/min培養(yǎng)60 h后收集菌體，用試劑盒提取RNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，送擎科公司進行轉(zhuǎn)錄組測序，分析高產(chǎn)低產(chǎn)條件下相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平。

2 結(jié)果

2.1 Tn5轉(zhuǎn)座突變體庫構(gòu)建、突變株篩選及表型鑒定

Tn5轉(zhuǎn)座誘變構(gòu)建的J1-1突變體庫庫容量為1.0×105，從中篩選到1株與野生菌J1-1發(fā)酵液顏色差異顯著的突變株5-179，與野生菌J1-1發(fā)酵液呈紅色相比，該突變株發(fā)酵液顏色接近白色（圖1）。菌體量及PQQ合成水平定量檢測結(jié)果表明，突變菌5-179的生長速度、PQQ生物合成速度、最終菌體量及PQQ產(chǎn)量都比野生菌J1-1低。到達平臺期后突變菌5-179最終菌體量為野生菌J1-1的55.93%，最終PQQ產(chǎn)量僅為野生菌J1-1的23.76%（圖2）。實驗結(jié)果表明5-179突變菌的PQQ生物合成水平顯著下降。

圖1 野生型J1-1及突變株5-179發(fā)酵液

圖2 突變株5-179在HM中的生長曲線（A）和PQQ合成水平曲線（B）

2.2 Tn5轉(zhuǎn)座突變株插入位點鑒定

質(zhì)粒拯救法擴增得到的片段測定序列經(jīng)與J1-1基因組序列比對后，確定插入位點為染色體第705454位，位于mpq-0708基因內(nèi)部（705337～705933）。如圖 3，mpq-0708基因位于 NADH-醌氧化還原酶基因簇（nuoABCDEF）內(nèi)，編碼NADH-醌氧化還原酶（EC：1.6.5.3）C亞基。KEGG分析結(jié)果表明NADH-醌氧化還原酶的功能是將NADH轉(zhuǎn)化為NAD+并產(chǎn)生能量。5-179突變株中nuoC基因為Tn5轉(zhuǎn)座插入而失活，nuoC基因3′端其他基因轉(zhuǎn)錄也會受到影響，最終會導致NADH-醌氧化還原酶整體功能受損。

圖3 5-179突變株Tn5插入位點

2.3 mpq-0708基因敲除

以敲除菌基因組為模板進行組合PCR鑒定，上游同源臂up-Gm基因、下游同源臂down-Gm基因和單獨Gm基因3個組合分別擴增出2500、2500、800 bp的片段，而以野生菌J1-1基因組為模板時均為陰性，說明mpq-0708基因敲除成功。結(jié)果見圖4。

圖4 敲除菌J1-1Δmpq-0708的組合PCR鑒定

2.4 敲除菌表型測定

定量檢測高產(chǎn)HM培養(yǎng)基中敲除菌J1-1Δmpq-0708和野生菌J1-1的菌體量及PQQ合成水平，結(jié)果表明敲除菌生長速度和最終菌體量均低于野生菌，PQQ生物合成速度及最終PQQ產(chǎn)量同樣如此。敲除菌到達平臺期時最終菌體量僅為野生菌的14.87%，最終PQQ產(chǎn)量僅為野生型J1-1的3.15%（圖5A）。敲除菌與Tn5轉(zhuǎn)座誘變突變菌表型變化方向一致，相對于野生菌均下降，敲除菌下降幅度相對更大一些。

低產(chǎn)LM培養(yǎng)基中敲除菌及野生菌檢測結(jié)果表明，前期敲除菌生長速度稍快于野生菌，后期生長速度和菌體量與野生菌均無顯著差異。敲除菌PQQ生物合成速度顯著低于野生菌，最終PQQ產(chǎn)量僅為野生菌的52.80%（圖5B），變化趨勢與在HM培養(yǎng)基中相同。

同時測定了低產(chǎn)LM培養(yǎng)基中敲除菌及野生菌的NADH及NAD+含量，前48 h敲除菌NADH/NAD+比值低于野生菌（圖5C），推測是因為敲除了mpq-0708基因，導致NADH醌氧化還原酶將NADH轉(zhuǎn)化為NAD+的能力下降。NADH/NAD+比值反映細胞的能量狀態(tài)，比值越高表明細胞代謝越旺盛，低產(chǎn)LM培養(yǎng)基中敲除菌及野生菌的NADH/NAD+比值均在第48 h達到最大值，與菌體比生長速度及PQQ比生產(chǎn)速率相符（圖5B、C）。

2.5 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析

轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示，與低產(chǎn)培養(yǎng)基相比，在高產(chǎn)培養(yǎng)基中，mpq-0708基因所在基因簇的6個基因的轉(zhuǎn)錄水平是上調(diào)的（圖6A），PQQ生物合成相關(guān)基因mpq-1589（pqqE）、mpq-1590（pqqD）、mpq-1591（pqqC）、mpq-1592（pqqB）的轉(zhuǎn)錄水平也是上調(diào)的（圖6B），mpq-0708基因簇與PQQ生物合成基因簇及PQQ產(chǎn)量變化方向一致，證明能量代謝與PQQ生物合成正相關(guān)（圖5A），提示mpq-0708基因的轉(zhuǎn)座誘變和敲除有可能通過下調(diào)細菌能量代謝水平從而降低PQQ產(chǎn)量。

圖5 野生菌J1-1、敲除菌J1-1Δmpq-0708在HM培養(yǎng)基（A）、LM培養(yǎng)基（B）中的生長曲線及PQQ合成水平曲線，以及在LM中的NADH/NAD+比值測定（C）

圖6 野生菌J1-1在低產(chǎn)LM及高產(chǎn)HM培養(yǎng)基中NADH-醌氧化還原酶基因簇表達水平（A）和PQQ生物合成相關(guān)基因表達水平（B）

3 討論

Tn5轉(zhuǎn)座子屬于復合型轉(zhuǎn)座子，可通過抗性篩選。因在宿主中單拷貝復制，所以相比于常規(guī)的轉(zhuǎn)座技術(shù)，Tn5具有突變性狀穩(wěn)定、突變位點易定位等優(yōu)勢[12]；同時Tn5轉(zhuǎn)座還有操作簡單、轉(zhuǎn)化效率高，能夠快速獲得大量穩(wěn)定遺傳的Tn5轉(zhuǎn)座突變株等特點。本研究構(gòu)建了庫容量為1.0×105的Tn5突變體庫，篩選到一株P(guān)QQ產(chǎn)量明顯下降的突變株5-179，且其他文獻報道也篩選出相應的PQQ產(chǎn)量下降的菌株[13]，這些結(jié)果表明利用Tn5轉(zhuǎn)座誘變技術(shù)篩選食甲基菌J1-1中PQQ合成基因的方法是可行的。

NAD是氧化還原酶輔酶，其氧化型（NAD+）和還原型（NADH）的比值是細胞能量代謝水平的重要指標，NADH/NAD+比值降低表明細胞新陳代謝能力下降，菌體生長進入衰退[14-15]。經(jīng)鑒定發(fā)現(xiàn)本研究篩選到的突變株5-179其插入位點位于NADH-醌氧化還原酶亞基C（nuoC）編碼區(qū)內(nèi)。nuoC是NADH醌氧化還原酶周質(zhì)空間的一部分，其部分氨基酸殘基（Glu138、Glu140和Asp143）對NADH酶的組裝及活性是必需的[16]。Tn5插入該基因簇內(nèi)部，干擾了細胞能量代謝進而影響菌體生長和PQQ合成。同源重組敲除相應基因后表型與Tn5轉(zhuǎn)座誘變表型一致。

此外，PQQ自身也是除NAD和FAD之外的第三類氧化還原酶輔酶，PQQ和NAD均與細胞能量相關(guān)，本研究結(jié)果提示PQQ合成水平和NADH/NAD+比值相互關(guān)聯(lián)，具體機制有待進一步探討。