鄒晨偉，黃義德

福建師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350117

第一株畢赤酵母于1920年被Guilliermond從法國栗樹上分離出來，命名為Zygosaccharomyces pastori[1]。1956年，Phaff在美國加利福尼亞的黑橡樹中分離得到畢赤酵母菌株，命名為Pichia pastoris[2]。1989年，Cregg等找到了強(qiáng)的AOX1啟動(dòng)子，將畢赤酵母用于外源蛋白生產(chǎn)[3]。1995年，基于核糖體基因序列數(shù)據(jù)，Yamadat等將畢赤酵母歸到新屬Komagataella中[4]。該屬目前共有6個(gè)成員，即K.pastoris、K.phaffii、K.pseudopastoris、K.poluli、K.ulmi和K.kurtzmanii[5]。其中，K.pastoris和K.phaffii目前作為外源蛋白表達(dá)宿主。常用的外源蛋白表達(dá)菌株GS115和X-33屬于K.phaffii，SMD蛋白酶缺陷菌株如SMD1168則屬于K.pastoris。

2019年，Schutter等對K.phaffii全基因組進(jìn)行測序，獲得了9.43 Mb的基因組序列，并為編碼基因提供人工注釋[6]。同年，Mattanovich等測定了K.pastoris的9.4 Mb基因組，并分析了分泌蛋白質(zhì)組和糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，以此建立了一個(gè)以畢赤酵母基因組為數(shù)據(jù)基礎(chǔ)的開放性網(wǎng)站（http://www.pichiagenome.org）[7]。這項(xiàng)工作為后來的畢赤酵母相關(guān)研究提供了便利的平臺(tái)，該網(wǎng)站時(shí)至今日仍在維護(hù)和更新。2011年Küberl等結(jié)合454和Illumina測序技術(shù)，提供了9.35 Mb的更加精確的K.phaffii基因組數(shù)據(jù)，該工作還報(bào)道了該菌種第一個(gè)線粒體基因組的完整DNA序列[8]。隨后的研究則是對之前基因組數(shù)據(jù)的不斷補(bǔ)充更新，2016年Sturmberger等給出了一組更為精確的K.phaffii參考基因組，主要是開放讀框和染色體定位的更新[9]。在基因組測序技術(shù)不斷迭代更新的背景下，這些測序工作為研究人員對畢赤酵母菌株進(jìn)行基因工程改造打下了堅(jiān)實(shí)的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1 α-factor信號肽

1.1 α-factor信號肽結(jié)構(gòu)和功能

當(dāng)前畢赤酵母系統(tǒng)中應(yīng)用最廣也最為成功的信號肽是釀酒酵母的α-factor信號肽，因而它的結(jié)構(gòu)和功能也得到了較為詳細(xì)的研究。α-factor信號肽是酵母α細(xì)胞分泌的交配信息素（mating factor 1，MF1）N端一段α交配因子前導(dǎo)肽，其編碼基因位于釀酒酵母的染色體XV1上[10]。

α-factor信號肽由86個(gè)氨基酸殘基組成，實(shí)則包含前肽（Pre-sequence）和前導(dǎo)區(qū)（Pro-region）序列。1～19位氨基酸殘基為Pre-sequence序列，20～86位殘基為Pro-region序列。其中，Pre-sequence 又分為 N-region（1～6）、H-region（7～15）和C-region（16～19）等3個(gè)不同的功能區(qū)。N-region是帶正電的極性氨基酸殘基；H-region是一段疏水性氨基酸序列，它的疏水性α螺旋結(jié)構(gòu)能夠有效促進(jìn)新生肽的轉(zhuǎn)運(yùn)[10]；C-region由保守的中性氨基酸組成，能被Ⅰ型信號肽酶所識別切割[11]。Pro-region N端前6個(gè)氨基酸殘基為進(jìn)化上保守的輸出信號6肽APVNTT，它們的共同特征是疏水性的脂肪鏈氨基酸。Pro-region是目前研究較多的部分，因?yàn)槠溟L達(dá)66個(gè)氨基酸殘基，表明它有一定的結(jié)構(gòu)和功能。據(jù)Chahal等研究，Pro-region由1個(gè)α螺旋和5個(gè)β折疊組成，如果57～60區(qū)間的氨基酸殘基全部被刪除，會(huì)改變Pro-region的結(jié)構(gòu)，從而影響它的功能[12]。此外，在釀酒酵母中研究發(fā)現(xiàn)，Pro-region上有3個(gè)N-糖基化位點(diǎn)（N23，N57，N67），消除會(huì)導(dǎo)致α-factor的分泌量減少但不會(huì)消失，這表明N-糖基化對于多肽通過分泌途徑是重要的但不是必要的[13]。Pro-region糖基化可能有助于分泌效率的提高，研究表明適度糖基化有助于外源蛋白的表達(dá)[14]。此外，Proregion本身還存在自我聚集傾向，而N-糖基化能夠防止Pro-region在內(nèi)質(zhì)腔內(nèi)的聚焦，從而提高分泌效率[15]。Pro-region還扮演分子伴侶的角色，提高所引導(dǎo)蛋白的有效折疊，減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)未折疊蛋白通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)降解（endoplasmic reticulum associated degradation，ERAD）途徑被轉(zhuǎn)運(yùn)到蛋白酶體中被降解[12]。

1.2 α-factor信號肽引導(dǎo)的外源蛋白在分泌通路中的加工

α-factor信號肽引導(dǎo)的外源蛋白在畢赤酵母中分泌要經(jīng)過一系列加工過程。首先，α-factor信號肽引導(dǎo)外源蛋白進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的膜轉(zhuǎn)位方式為翻譯后轉(zhuǎn)位[16]。在細(xì)胞質(zhì)上的核糖體翻譯出包含α-factor信號肽和外源蛋白在內(nèi)的全長未成熟蛋白。伴侶蛋白Hsp40和Hsp70阻止核糖體翻譯完成的多肽的廣泛折疊，以維持α-factor信號肽序列的未折疊狀態(tài)，使蛋白能夠順利靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)并進(jìn)入Sec復(fù)合物通道[17]。Sec復(fù)合物中主要相關(guān)的亞基有Sec61/62/63，Sec61作為多肽穿過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的通道，Sec63作為撐開該通道的支架，Sec62起到錨定作用[18]。細(xì)胞質(zhì)中翻譯完成的多肽被轉(zhuǎn)運(yùn)到Sec復(fù)合物中，α-factor信號肽Pre-sequence會(huì)被內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的信號肽酶復(fù)合物（signal peptidase complex，SPC）中的Ⅰ型信號肽酶（SPaseⅠ）切割[18]。蛋白進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔后，被內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)熱激蛋白家族成員Bip/Kar2p輔助初步折疊[19]。第二步是進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔的初步折疊Pro-region和未成熟蛋白的早期N-糖基化[20]，在這個(gè)位置錯(cuò)誤折疊蛋白的累積容易引起未折疊蛋白響應(yīng)（unfold protein response，UPR）的上調(diào)[21]，然后錯(cuò)誤折疊蛋白會(huì)通過ERAD途徑被運(yùn)往溶酶體進(jìn)行降解[22]。第三步則是Pro-region和外源蛋白通過COPⅡ囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)到高爾基體，在高爾基體中進(jìn)行進(jìn)一步的N-糖基化修飾和折疊[23]。在此期間信號肽的Pro-region與外源蛋白連接處的2個(gè)堿性氨基酸殘基KR被位于高爾基體上Kex2基因編碼的類枯草菌素蛋白酶（subtilisin-like protease，一種鈣離子依賴性絲氨酸蛋白酶）剪切[24]。該酶所識別的基序?yàn)镵R/RR-X，這個(gè)切割過程需要鈣離子作為輔助因子進(jìn)行[25]。隨后N端攜帶4個(gè)氨基酸殘基（EAEA）的成熟蛋白隨著分泌小泡向胞外前行，4個(gè)氨基酸殘基就在此過程中被位于液泡的STE13基因所編碼的二肽蛋白酶氨基肽酶A（dipeptidyl aminopeptidase A）所切割[26]，它所識別的基序是EA。這個(gè)切割過程是非常迅速的，因而不能保證百分之百的切割效率[27]。因此，分泌的外源蛋白上可能會(huì)殘留2或4個(gè)氨基酸殘基[28]。最后，成熟的外源蛋白通過胞吐方式分泌到胞外。

1.3 α-factor信號肽的改造

Jungoh等對α-factor信號肽進(jìn)行了單個(gè)密碼子、密碼子上下文，以及單個(gè)和上下文聯(lián)用的密碼子優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)密碼子上下文的優(yōu)化能夠使得南極假絲酵母脂肪酶CAL-B的產(chǎn)量達(dá)到野生型的4倍[29]。基于Chahal等對α-factor信號肽Pro-region的二級結(jié)構(gòu)與分泌水平的相關(guān)性進(jìn)行研究的背景[12]，Barrero等對Pro-region上的第42位亮氨酸和第83位天冬氨酸對應(yīng)的密碼子進(jìn)行點(diǎn)突變，發(fā)現(xiàn)42位亮氨酸突變成絲氨酸后有效減少了E2-Crimison在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的聚集[30]。由于前面已有研究者發(fā)現(xiàn)Ost1信號序列能夠引導(dǎo)分泌蛋白進(jìn)行翻譯共轉(zhuǎn)位[15]，他們還設(shè)計(jì)了一個(gè)由畢赤酵母Ost1蛋白信號肽和α-factor信號肽的Pro-region組成的混合分泌信號肽，結(jié)果表明這種改造使得具有高級結(jié)構(gòu)且難以分泌的四聚體紅色熒光蛋白E2-Crimson和脂肪酶BTL2的分泌量分別增加了20倍和10倍[30]。以上研究表明對于畢赤酵母現(xiàn)有引導(dǎo)外源蛋白信號肽的改造和優(yōu)化是可行的，這也為開發(fā)更為高效的信號肽提供了新的思路。

2 畢赤酵母內(nèi)源信號肽

畢赤酵母自身會(huì)通過分泌途徑分泌蛋白到胞外、細(xì)胞膜/壁或不同細(xì)胞器中。Mattanovich等對畢赤酵母菌株DSMZ70382（K.pastoris）基因組測序后，對其分泌組（secretome）進(jìn)行預(yù)測分析，結(jié)果顯示有88個(gè)蛋白分泌到胞外，另有172個(gè)開放讀框預(yù)計(jì)可以進(jìn)入分泌途徑被轉(zhuǎn)運(yùn)到不同的細(xì)胞器中[7]。還有其他一些研究也對畢赤酵母分泌蛋白進(jìn)行了預(yù)測，預(yù)測的分泌蛋白中許多具有典型的信號肽序列[6,31-32]。這些畢赤酵母內(nèi)源信號肽可以為分泌蛋白提供除α-factor信號肽之外更為廣泛的信號肽選擇。表1總結(jié)了研究者利用不同報(bào)告蛋白對其中一些信號肽進(jìn)行的表達(dá)研究，研究結(jié)果顯示有些信號肽可有效引導(dǎo)外源蛋白的分泌。遺憾的是，迄今還沒有人對預(yù)測的所有內(nèi)源信號肽引導(dǎo)外源蛋白分泌效果進(jìn)行系統(tǒng)的研究。

表1 引導(dǎo)外源蛋白在畢赤酵母中表達(dá)的內(nèi)源信號肽

3 結(jié)語

隨著畢赤酵母種屬信息的不斷完善，越來越多的外源蛋白能夠借由畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)得到不錯(cuò)的產(chǎn)量。作為非常具有產(chǎn)業(yè)化發(fā)展前景的表達(dá)宿主，期望它未來在醫(yī)藥行業(yè)發(fā)光發(fā)熱。對α-factor信號肽的結(jié)構(gòu)和功能及相關(guān)分泌通路的詳細(xì)研究，表明信號肽在協(xié)助胞外分泌中不可或缺，而目前對信號肽的改造大多處于摸索狀態(tài)。因此，后續(xù)還需要更全面更系統(tǒng)地對畢赤酵母αfactor信號肽的內(nèi)源信號肽進(jìn)行篩選和優(yōu)化，以尋得能夠高效引導(dǎo)外源蛋白分泌的信號肽。