朱佳琪，王微，朱晨，陳飛3，，程宏3，，馮寶民，劉剛，陳惠鵬

1.大連大學(xué)，遼寧 大連 116622；2.廊坊師范學(xué)院，河北 廊坊 065000；

3.安徽大學(xué)，安徽 合肥 230601；4.軍事科學(xué)院 軍事醫(yī)學(xué)研究院，北京 100850

安絲菌素（ansamitocins）是由珍貴束絲放線菌（Actinosynnema pretiosum）生產(chǎn)的美登素類生物堿，是一種聚酮大環(huán)內(nèi)酰胺苯安莎類抗生素[1-2]，1977年首次由Hgashide等在諾卡菌的發(fā)酵液中分離得到[3]。安絲菌素類化合物共有20多種[4]，其中在大環(huán)母核C-3位側(cè)鏈連接有異丁?；陌步z菌素 P-3（ansamitocin P-3，AP-3）為發(fā)酵液中的主產(chǎn)物，含量最多，抗腫瘤活性最強(qiáng)。AP-3不僅對(duì)腫瘤細(xì)胞微管蛋白聚合有強(qiáng)烈的抑制作用[5]，同時(shí)表現(xiàn)出可誘導(dǎo)激活基于免疫的抗腫瘤機(jī)制[6-7]，目前以AP-3為化學(xué)前體合成的抗體偶聯(lián)藥物已經(jīng)獲批上市用于治療乳腺癌[8]。

安絲菌素的生物合成主要分為三個(gè)階段，第一階段由葡萄糖進(jìn)入糖酵解（EMP）途徑生成的葡萄糖-6-磷酸（G6P）經(jīng)葡萄糖磷酸變位酶轉(zhuǎn)化為葡萄糖-1-磷酸（G1P），在谷氨酰胺參與下經(jīng)莽草酸途徑合成3-氨基-5羥基苯甲酸（AHBH）[9-10]；第二階段由AHBH經(jīng)asmA、asmB、asmC和asmD編碼依次添加乙酸、丙酸和羥基乙酸合成單元形成安絲菌素母環(huán)結(jié)構(gòu)[11]；第三階段由安絲菌素母環(huán)經(jīng)氯代、甲基化和?；群笮揎棽襟E最終合成為AP-3[12]。

安絲菌素的代謝調(diào)控包括基因asm1～asm48參與結(jié)構(gòu)域載入的催化與調(diào)控、基因asmA～asmD負(fù)責(zé)AHBH聚酮碳鏈的延伸，兩部分共同分布在AP-3生物合成的2條合成基因簇上[10]，其中還有一些基因的功能尚不明確。本研究選取asm合成基因簇中6種功能尚不明確的基因，通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)這些基因在AP-3生產(chǎn)過(guò)程中的動(dòng)態(tài)表達(dá)，分析其與AP-3產(chǎn)量的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 材料

珍貴束絲放線菌橙色亞種（A.pretiosumATCC31565）（本實(shí)驗(yàn)室）；安絲菌素P-3標(biāo)準(zhǔn)品（Enzo）；色譜級(jí)甲醇（Thermo Fisher）；QuantScript RT Kit、RealMaster Mix（SYBR Green）（北京天根生化科技有限公司）；TRIzol試劑（Invitrogen）；Q5 High-Fidelity DNA 聚合酶、dNTPs（NEB）；DNA marker（TaKaRa）；溶菌酶（Solarbio）。

ISP2培養(yǎng)基（g/L）：酵母粉4，麥芽提取物10，葡萄糖4，瓊脂粉20，110℃滅菌20 min。種子培養(yǎng)基（g/L）：酵母提取物4，麥芽糖10，葡萄糖4，NaCl 1.5，110℃滅菌20 min。發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：酵母提取物4，麥芽糖10，可溶性淀粉20，NaCl 1.5，121℃滅菌20 min。

Symmetry Columns C18色譜柱、600高相液相色譜儀（Waters）；DNA Engine PTC-200 PCR儀、IQ5實(shí)時(shí)熒光定量 PCR儀（Bio-Rad）；Nanodrop 2000核酸定量分析儀（Thermo Fisher）。

1.2 AP-3檢測(cè)與提取方法

采用高效液相色譜（HPLC）法檢測(cè)AP-3，固定相為Symmetry Columns C18色譜柱，流動(dòng)相為超聲脫氣的甲醇/水（體積比85∶15），流速1 mL/min，柱溫28℃，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，進(jìn)樣量10 μL。

用色譜級(jí)甲醇配制AP-3標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)溶液，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，稀釋為25、50、125、250、500、750、1000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液分別進(jìn)行HPLC檢測(cè)，每濃度重復(fù)進(jìn)樣3次。以標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，直線擬合方程為y=14520x，R2=0.997。

將斜面培養(yǎng)的放線菌孢子刮下接種于種子培養(yǎng)基中搖制種子液，種子液以2%接種至發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)得到AP-3的發(fā)酵液。發(fā)酵液經(jīng)等體積乙酸乙酯重復(fù)萃取3次，集中萃取液50℃旋轉(zhuǎn)蒸干，以500 μL色譜級(jí)甲醇定容，通過(guò)0.22 μm微孔濾膜后進(jìn)行HPLC檢測(cè)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算發(fā)酵液中的AP-3含量。

1.3 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA

采用TRIzol法提取放線菌總RNA，用Nanodrop 2000核酸定量分析儀檢測(cè)濃度后，用北京天根生化有限公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第一鏈。

1.4 引物設(shè)計(jì)

在NCBI網(wǎng)站檢索安絲菌素生物合成基因簇中相關(guān)未知基因和調(diào)控基因序列，利用軟件設(shè)計(jì)對(duì)應(yīng)的引物（表1），進(jìn)行25 μL體系的普通PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，用凝膠成像儀拍照。

表1 引物及序列

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

擴(kuò)增的基因經(jīng)鑒定后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析。以16S rRNA為內(nèi)參基因，培養(yǎng)1～7 d每天分別提取的放線菌cDNA為模板，與放線菌培養(yǎng)第 1 d 的 cDNA 相比，用 E-ΔΔCt法分析各基因在不同時(shí)間的相對(duì)表達(dá)水平。

1.6 相關(guān)性分析

對(duì)基因相對(duì)表達(dá)量與AP-3產(chǎn)量數(shù)據(jù)進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析，計(jì)算Pearson相關(guān)系數(shù)，用以反映二者的相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 發(fā)酵液中AP-3含量檢測(cè)

放線菌液體搖瓶連續(xù)發(fā)酵10 d，每24 h取樣，經(jīng)乙酸乙酯3次萃取后旋轉(zhuǎn)蒸干，再經(jīng)色譜級(jí)甲醇溶解定容后通過(guò)濾膜進(jìn)行HPLC檢測(cè)發(fā)酵液中AP-3的含量，在發(fā)酵第7 d時(shí)AP-3產(chǎn)量達(dá)到最高，約70 mg/L（圖1）。

圖1 安絲菌素P-3產(chǎn)量

2.2 引物的特異性驗(yàn)證

束絲放線菌的基因組內(nèi)有較高含量的GC堿基對(duì)，因此采用高GC含量擴(kuò)增效果更好的Q5 High-Fidelity DNA聚合酶進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)。在進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR前，進(jìn)行了普通PCR擴(kuò)增，應(yīng)用瓊脂糖凝膠電泳對(duì)擴(kuò)增效果與引物特異性進(jìn)行檢測(cè)。由圖2可看出，所選基因經(jīng)過(guò)普通PCR的驗(yàn)證，均可擴(kuò)增出單一目的條帶，說(shuō)明對(duì)應(yīng)引物具有特異性，可以滿足后續(xù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR的需要。

圖2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)基因表達(dá)量

以16S rRNA為對(duì)照，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)各基因的表達(dá)量，應(yīng)用E-ΔΔCt法分析各基因不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)水平。結(jié)果表明，asm2和asm36基因表達(dá)量隨時(shí)間的增加而提高（圖3A、E）；asm30基因表達(dá)水平最高出現(xiàn)在第6 d，隨后降低（圖3D）；asm20和asm39基因表達(dá)在早期維持低水平，第7 d達(dá)到高點(diǎn)（圖3B、F）；asm28基因在第4 d表達(dá)水平較高，之后快速下降（圖3C）。

圖3 asm基因相對(duì)表達(dá)量

2.4 基因表達(dá)量與AP-3產(chǎn)量相關(guān)性分析

分析表明，asm2和asm36基因表達(dá)量與AP-3產(chǎn)量具有顯著正相關(guān)性（P＜0.001，圖 4A、E）；asm20和asm39基因表達(dá)量與AP-3產(chǎn)量具有正相關(guān)性（P＜0.05，圖4B、F）；asm28和asm30基因表達(dá)量與AP-3產(chǎn)量未表現(xiàn)出明顯相關(guān)性（圖4C、D）。

圖4 asm基因相對(duì)表達(dá)量與AP-3產(chǎn)量相關(guān)性分析

3 討論

安絲菌素的天然發(fā)酵產(chǎn)率較低，目前國(guó)內(nèi)外研究者提高其產(chǎn)量主要通過(guò)對(duì)發(fā)酵工藝優(yōu)化和合成途徑改造兩大方面來(lái)實(shí)現(xiàn)。在安絲菌素生物合成途徑中，已證明asm基因簇內(nèi)較多基因功能直接決定AP-3的結(jié)構(gòu)與產(chǎn)量，但仍有一些相關(guān)基因的功能尚不清楚。研究這些基因的表達(dá)與安絲菌素合成之間的關(guān)系，可以為提高安絲菌素產(chǎn)量的生物學(xué)改造提供候選基因。我們發(fā)現(xiàn)在安絲菌素生產(chǎn)過(guò)程中，asm2和asm36基因的表達(dá)與安絲菌素產(chǎn)量顯著正相關(guān)；asm20、asm30和asm39基因的表達(dá)在安絲菌素生產(chǎn)后期顯著升高；而asm28基因的表達(dá)在生產(chǎn)早期迅速升高，在后期降低。Ng等[13]的研究表明，asm2和asm39基因過(guò)表達(dá)菌株，其AP-3產(chǎn)量分別提高1.6和2.5倍；而Ning等[14]的研究顯示，asm30基因失活使AP-3產(chǎn)量提高66%。結(jié)合我們的結(jié)果，可以發(fā)現(xiàn)在AP-3生產(chǎn)過(guò)程中，表達(dá)量與AP-3產(chǎn)量呈正相關(guān)的基因?qū)P-3的產(chǎn)量呈現(xiàn)正向調(diào)控作用，如asm2和asm36。對(duì)于asm30基因，我們的研究表明其在AP-3生產(chǎn)早期表達(dá)上升，第6 d達(dá)到高點(diǎn)后下降，而AP-3產(chǎn)量在第7 d顯著升高。這與Ning的研究相符合，提示在早期抑制該基因活性可以縮短宿主菌發(fā)酵周期，提高安絲菌素產(chǎn)率。

本研究結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的相關(guān)結(jié)論具有很好的一致性。我們猜測(cè)某些asm基因的表達(dá)量與AP-3產(chǎn)量的相關(guān)性可以揭示該基因?qū)τ贏P-3合成的調(diào)控功能，為今后提高AP-3產(chǎn)量的合成途徑改造提供了候選基因，進(jìn)一步明確其調(diào)控AP-3合成的基因功能，為后續(xù)AP-3產(chǎn)量的提高奠定基礎(chǔ)。