曹穎 綜述 張湘燕△ 張翊玲 審校

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)研究生院，貴州 貴陽 550004；2.貴州省人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，貴州 貴陽 550004)

近年來，結(jié)核病成為傳染病中的“頭號(hào)殺手”，雖然結(jié)核病的診療不斷標(biāo)準(zhǔn)化，但是全球結(jié)核病的控制情況仍不容樂觀。如果在早期病程中應(yīng)用合理的干預(yù)措施，可能會(huì)得到有效控制，為此就目前結(jié)核疫苗研究進(jìn)展及現(xiàn)狀作一綜述。

1 研究背景及現(xiàn)狀

1.1研究背景 近年來，結(jié)核病已成為傳染病“頭號(hào)殺手”。據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)，全球已有近1/3人口約20億人感染結(jié)核分支桿菌，結(jié)核病患者達(dá)到2 000萬名[1]。95%的結(jié)核感染被認(rèn)為是以無癥狀的潛伏形式存在[2]。肺結(jié)核常發(fā)生在貧窮、邊緣和社會(huì)地位低下群體和社區(qū)，包括營養(yǎng)不良、免疫力低下、流離失所、監(jiān)禁、腸道寄生蟲普遍感染的地方和特定少數(shù)民族的人群[1-2]。雖然大部分感染者體內(nèi)結(jié)核桿菌都處于抑制狀態(tài)，但還是有大約10%的幾率會(huì)“蘇醒”過來，造成各種結(jié)核病變[1]。目前使用最廣泛的結(jié)核疫苗被稱為卡介苗(BCG)，于1921年開發(fā)，在結(jié)核病高發(fā)國家被常規(guī)用于嬰幼兒、兒童急性粟粒性肺結(jié)核與結(jié)核性腦膜炎等嚴(yán)重疾病的預(yù)防。應(yīng)用至今已有90多年，為結(jié)核分枝桿菌的“近親”—牛型結(jié)核分枝桿菌(M.bovis)進(jìn)行多次傳代培養(yǎng)，得到了減毒的活性結(jié)核分枝桿菌疫苗—卡介苗[3-4]。這款疫苗為全球應(yīng)用最廣泛、使用最多的結(jié)核疫苗，雖然新生兒接種卡介苗效果肯定，但對多數(shù)成人肺部疾病的預(yù)防作用不一，有的幾乎無效，防治效果差異顯著。雖然卡介苗能預(yù)防原發(fā)性結(jié)核病，但對已感染結(jié)核分枝桿菌卻束手無策。全球已采取綜合措施有效的控制90%結(jié)核分枝桿菌感染人群，但其中10%仍將發(fā)展成為活動(dòng)性疾病，給全球帶來了嚴(yán)重的疾病壓力及巨大醫(yī)療和經(jīng)濟(jì)挑戰(zhàn)[5-6]。

1.2正確評(píng)價(jià)和認(rèn)識(shí)卡介苗的免疫保護(hù)力 卡介苗本身為牛型結(jié)核分枝桿菌減毒株，其免疫效果一方面受環(huán)境分枝桿菌的影響，一方面經(jīng)反復(fù)傳代培養(yǎng)和保存導(dǎo)致保護(hù)性抗原不同程度丟失，與HRv株比較，在傳代培養(yǎng)過程中，丟失了大量的抗原基因即缺失16個(gè)區(qū)域( RD1～RD16)，共包括129個(gè)開放閱讀框[7]。RD1區(qū)在所有的卡介苗中都缺失；其中RD3～RD7、RD9～RD13區(qū)域在牛分枝桿菌中發(fā)生缺失；RD2、RD8、RD14、RD15、RD16區(qū)域在不同子代卡介苗出現(xiàn)缺失。RD1區(qū)9個(gè)基因全部丟失，基因包括Rv3871～Rv3879。在形成卡介苗的毒力衰減過程中，基因缺失是重要原因之一[7]。ESAT6、CFP10是RD1區(qū)核心的T細(xì)胞抗原，能誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫應(yīng)答。有研究[8]表明敲除RD1基因，可以降低結(jié)核分枝桿菌的毒力。目前研究最多的為RD1區(qū)基因編碼的ESAT-6[9]，能誘導(dǎo)強(qiáng)烈的T細(xì)胞免疫反應(yīng)，檢測ESAT-6抗原特異性反應(yīng)也是一個(gè)非常有價(jià)值的診斷方法，它是一種分泌型蛋白，其功能未知，由于BCG缺失ESAT-6，可利用此種抗原來鑒別為卡介苗接種還是結(jié)核分支桿菌感染。由于ESAT-6特異性反應(yīng)強(qiáng)，可用于鑒別結(jié)核是否處于結(jié)核早期(感染早期)還是潛伏期或亞臨床期[9]。由于環(huán)境因素與卡介苗傳代等因素影響，卡介苗菌株的遺傳特性發(fā)生變化，導(dǎo)致卡介苗本身的不足與局限性。正確認(rèn)識(shí)卡介苗的遺傳特性，對研究新型結(jié)核疫苗具有指導(dǎo)意義。

1.3結(jié)核耐藥情況 本世紀(jì)初以來，由于卡介苗的廣泛應(yīng)用及各種抗結(jié)核藥物的問世，抗結(jié)核治療取得了突破性進(jìn)展。然而，多重耐藥結(jié)核桿菌(MDR-TB)、廣泛耐藥結(jié)核桿菌(XDR-TB)以及完全耐藥結(jié)核桿菌(TDR)的出現(xiàn)，對全球結(jié)核病的控制帶來了新的挑戰(zhàn)與威脅。耐藥結(jié)核病發(fā)生與大多數(shù)結(jié)核病流行國家藥敏試驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)室設(shè)施不足相關(guān)，而實(shí)際的全球耐藥結(jié)核病例數(shù)尚待估計(jì)[4]。在2008年大約44萬例多重耐藥結(jié)核發(fā)生，只有7%的人被鑒定并報(bào)告給世界衛(wèi)生組織。這些病例中，只有五分之一是按WHO標(biāo)準(zhǔn)治療[1]。MDR和XDR結(jié)核的治療可以采用現(xiàn)有的診斷技術(shù)和藥物，但療程大大延長，同時(shí)費(fèi)用更加昂貴及治療難度增加，對于很多發(fā)展中國家的患者是難以承受的，長療程用藥其依從性也存在困難。隨著結(jié)核桿菌耐藥性的增加抗結(jié)核治療的難度越來越大，嚴(yán)重威脅著人類健康。在結(jié)核耐藥方面需進(jìn)一步加強(qiáng)研究與探索，以尋求突破。

1.4結(jié)核分枝桿菌感染不同生長階段表達(dá)不同的抗原 結(jié)核分枝桿菌感染的不同時(shí)期如早期、晚期、潛伏期，因生長階段不同所表達(dá)的抗原也是不同的，而卡介苗在不斷地傳代過程中存在缺陷所以導(dǎo)致相關(guān)的生長階段缺乏相應(yīng)的保護(hù)性抗原編碼的基因，所以不能產(chǎn)生免疫保護(hù)作用(相應(yīng)的免疫保護(hù)作用)[10]。如今潛伏期感染的結(jié)核是全球抗結(jié)核治療最大的挑戰(zhàn)，治療潛伏性結(jié)核感染(LTBI)需要很長化療周期(9個(gè)月)，使治療依從性極困難。有研究[11]表明聯(lián)合使用早期抗原與晚期/潛伏期抗原可大大提高疫苗的免疫原性，引起很好的免疫保護(hù)，類似的很多研究均支持這一結(jié)論。南非的L.Govender等[12]研究與肺結(jié)核疾病比較，人類在潛伏感染中結(jié)核潛伏相關(guān)抗原Rv 2660和Rv 2659對CD4+ T細(xì)胞的反應(yīng)更強(qiáng)。T.Stephen等[13]研究重組的卡介苗表達(dá)抗原Rv2659c、Rv3407和Rv1733c能協(xié)同提高老鼠模型的脾肺遠(yuǎn)期療效，所得的數(shù)據(jù)表明重組卡介苗所表達(dá)的結(jié)核分枝桿菌潛伏相關(guān)抗原能提高對結(jié)核分枝桿菌免疫力與保護(hù)性。R.Virginie等[14]研究了結(jié)核分枝桿菌DNA疫苗及被結(jié)核感染的小鼠其八種休眠調(diào)節(jié)編碼蛋白的免疫原性，包括Rv1733c、Rv1738、Rv2029c(pfkB)、Rv2031c/hspX(acr)、Rv2032(acg)、Rv2626c、Rv2627c與Rv2628，這些抗原除了Rv1738外均能引起較強(qiáng)的體液和/或細(xì)胞Th1型(IL-2和IFN-γ)免疫反應(yīng)。D.Goletti等[15]研究的潛伏期抗原Rv2628與治愈的肺結(jié)核及遠(yuǎn)期感染相關(guān)，在遠(yuǎn)期感染中Rv2628反應(yīng)是近期感染的5倍。由于卡介苗由于在傳代培養(yǎng)過程中，使其丟失了大量的基因，因此存在很大的免疫缺陷。結(jié)核分枝桿菌感染不同生長階段其編碼不同時(shí)期抗原的基因及其重要，能對機(jī)體產(chǎn)生免疫保護(hù)作用。

2 目前候選疫苗的免疫機(jī)制(結(jié)核桿菌感染機(jī)體的免疫機(jī)制及保護(hù)性細(xì)胞因子分析)

目前的候選疫苗尤為關(guān)鍵的免疫機(jī)制是引起Th1細(xì)胞的刺激從而激活巨噬細(xì)胞的抗分枝桿菌能力，記憶性T細(xì)胞產(chǎn)生多種細(xì)胞因子參與免疫反應(yīng)。不同的T細(xì)胞群參與結(jié)核病的免疫反應(yīng)。至關(guān)重要的是CD4 T細(xì)胞產(chǎn)生1型細(xì)胞因子，特別是IFN- γ，與腫瘤腫瘤壞死因子(TNF)[16]。這些1型輔助性T細(xì)胞(Th1細(xì)胞)激活巨噬細(xì)胞，抑制細(xì)胞內(nèi)的結(jié)核分枝桿菌的。因此，它是結(jié)核病的最為重要的免疫保護(hù)方式[17]。CD4 T細(xì)胞被組織相容性復(fù)合體(MHC)Ⅱ類基因產(chǎn)物—抗原肽刺激，結(jié)核分枝桿菌優(yōu)先定植在自噬體里有利于主要組織相容性復(fù)合體MHC II類處理。CD8+T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞毒性分子，如穿孔素，顆粒溶素和顆粒酶，它們不僅能裂解宿主細(xì)胞，而且也直接殺死結(jié)核分枝桿菌。Th17細(xì)胞可能在結(jié)核桿菌在早期階段為單核細(xì)胞和Th1淋巴細(xì)胞進(jìn)入并形成肉芽腫奠定免疫保護(hù)的基礎(chǔ)。然而過度的Th17細(xì)胞刺激，會(huì)導(dǎo)致中性粒細(xì)胞和炎癥細(xì)胞的過度表達(dá)引起損害。有證據(jù)顯示[18]Th2細(xì)胞在結(jié)核分枝桿菌感染后，產(chǎn)生IL-4和IL-5，這些細(xì)胞因子能刺激B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體，由于Th2細(xì)胞能反調(diào)節(jié)Th1細(xì)胞，它們可能會(huì)損害抗結(jié)核的免疫保護(hù)。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)主要的生物學(xué)功能是控制或抑制免疫反應(yīng)。Treg的活化會(huì)導(dǎo)致過早的免疫抑制，Treg和其他免疫調(diào)節(jié)方式一樣如T細(xì)胞耗竭，將有助于肺結(jié)核疾病的復(fù)發(fā)與激活。在慢性感染性疾病中，Treg抑制炎癥反應(yīng)限制組織損傷，可以利用Treg的誘導(dǎo)活性作為疫苗免疫的最佳誘導(dǎo)效應(yīng)[19]。目前的候選疫苗僅能減少初始細(xì)菌感染，不能消滅病原體，僅能預(yù)防疾病。事實(shí)上，疫苗免疫(免疫反應(yīng))應(yīng)該包含肺結(jié)核從增生活躍到停止與休眠的各個(gè)階段。因此未來的疫苗接種策略應(yīng)將加大免疫學(xué)方面的探討與認(rèn)識(shí)。

3 結(jié)核疫苗研究情況

10年前，只有為數(shù)不多的幾個(gè)結(jié)核疫苗產(chǎn)品在開發(fā)，現(xiàn)在已經(jīng)有十幾個(gè)了，由于卡介苗自身存在缺陷與不足，對成人預(yù)防效果不一[1]。但該疫苗應(yīng)用90余年，對嬰幼兒的結(jié)核防治作用肯定。新疫苗的療效評(píng)價(jià)需要仔細(xì)的分析和試驗(yàn)來盡可能地檢測其安全性[4]。一般而言，第一代候選疫苗大致可以分為兩種，第一種是指可以完全取代卡介苗；第二種是提高卡介苗保護(hù)效果的加強(qiáng)劑。與此同時(shí)，科學(xué)家們正致力于一種治療型疫苗研究，就是通過激活人體免疫系統(tǒng)，清除體內(nèi)潛伏感染的結(jié)核桿菌[9-11]。肝素結(jié)合血凝素(HBHA)是一個(gè)有趣又有挑戰(zhàn)性的候選疫苗，疫苗的保護(hù)價(jià)值在于對潛伏感染病人具有免疫原性。HBHA疫苗刺激卡介苗誘導(dǎo)的保護(hù)作用。因?yàn)榈鞍踪|(zhì)是高度甲基化，這種結(jié)構(gòu)使得它很難在一個(gè)不相關(guān)的表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生蛋白質(zhì)的重組。我們常指的是預(yù)防性疫苗，主要針對于預(yù)防。而治療性疫苗主要指疾病的治療。現(xiàn)今研究的疫苗大多集中在治療性疫苗，但主要局限于小鼠研究。根據(jù)結(jié)核病疫苗的種類可以分為全菌疫苗(包括減毒活疫苗和全菌失活疫苗等) 和亞單位疫苗( 包括蛋白質(zhì)/多肽、DNA疫苗、以病毒為載體的重組疫苗等)；但目前尚無一種候選疫苗的保護(hù)性和持續(xù)性優(yōu)于卡介苗[1-4]。隨著相關(guān)疫苗的進(jìn)一步理解與深入，每種疫苗都各有特點(diǎn)與優(yōu)勢，同時(shí)又存在一定的缺陷與不足。

4 新型TB疫苗的研發(fā)現(xiàn)狀

4.1亞單位疫苗 由一種或多種MTB蛋白組分與免疫佐劑聯(lián)合應(yīng)用而成的疫苗。亞單位疫苗是將致病菌主要的保護(hù)性免疫原存在的組分制成的疫苗。此類疫苗能通過一種或者幾種保護(hù)性抗原刺激產(chǎn)生有效的免疫反應(yīng)。該疫苗具有以下特點(diǎn)：安全性高；純度高，穩(wěn)定性好；產(chǎn)量高；用于有免疫病理作用的，或病原體難于培養(yǎng)疫苗研究[1-5,20]。亞單位疫苗易于被人們接受，不過需要對免疫佐劑做更深入的探索研究。使用蛋白質(zhì)多肽疫苗主要考慮抗原的選擇和佐劑的應(yīng)用，將多個(gè)抗原融合表達(dá)，有助于提高疫苗的免疫保護(hù)效率。

4.2佐劑 使用蛋白質(zhì)/多肽疫苗主要考慮抗原的選擇和佐劑的應(yīng)用，只有有效的佐劑輔助才能產(chǎn)生理想的免疫應(yīng)答。不同的免疫佐劑可以引起Thl或Th2型不同的免疫反應(yīng)[20]。亞單位疫苗易于被人們接受，不過需要對免疫佐劑做更深入的探索研究，避免終生應(yīng)用佐劑來保持亞單位疫苗的免疫性。

4.3重組卡介苗疫苗 卡介苗是牛型結(jié)核分枝桿菌的減毒株，與人型致病的結(jié)核分枝桿菌基因組比較，缺失129個(gè)編碼基因，重組卡介苗是對卡介苗本身進(jìn)行改造，彌補(bǔ)卡介苗的缺陷，使其能夠表達(dá)MTB的某些重要抗原來增強(qiáng)卡介苗的免疫原性[19]。此外，在卡介苗中重組表達(dá)干擾素和IL-12等細(xì)胞因子，可以增強(qiáng)卡介苗誘導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)的能力，促進(jìn)免疫反應(yīng)向Thl型轉(zhuǎn)化，具有重要的免疫調(diào)節(jié)作用[21]。雖然rBCG30保護(hù)力超過其它的候選疫苗，但是否存在其它影響該疫苗免疫保護(hù)的未知因素我們還不得而知，需繼續(xù)加以觀察與研究；其生物安全性仍需進(jìn)一步分析與深入研究[22]。

4.4重組活載體疫苗 重組活載體疫苗應(yīng)用無病原性或弱毒疫苗株細(xì)菌和病毒，例如卡介苗分枝桿菌和沙門氏菌弱毒疫苗株、痘病毒等作為載體，插入外源性保護(hù)基因，構(gòu)建重組活載體疫苗[23]。首先要確保作為載體的微生物對機(jī)體是安全的，同時(shí)要求各成分之間一般不發(fā)生相互干擾或排拆現(xiàn)象，并在體內(nèi)持續(xù)表達(dá)結(jié)核特異性抗原，載體本身具有佐劑的作用，因此產(chǎn)生強(qiáng)烈的T細(xì)胞免疫反應(yīng)，免疫保護(hù)效果更強(qiáng)，該類疫苗常應(yīng)用于加強(qiáng)免疫中，其開發(fā)和應(yīng)用前景較好[24]。重組活疫苗利用安全的微生物將抗原送入體內(nèi)發(fā)揮相應(yīng)的作用，載體本身就具有免疫佐劑的作用等優(yōu)勢，值得我們進(jìn)一步深入研究與探討。

4.5DNA疫苗 DNA疫苗，又稱“裸”DNA疫苗、基因疫苗，核酸疫苗等相關(guān)名稱。DNA疫苗是將編碼某種抗原蛋白的外源基因重組于真核表達(dá)元件，構(gòu)成重組質(zhì)粒DNA，通過各種方法將質(zhì)粒導(dǎo)入機(jī)體，使外源基因在活體內(nèi)表達(dá)，產(chǎn)生免疫反應(yīng)[25]。DNA疫苗具有以下優(yōu)點(diǎn)：DNA導(dǎo)入的載體(如質(zhì)粒)其結(jié)構(gòu)簡單，生產(chǎn)成本較低；DNA疫苗制作與更新方便容易；外源基因在體內(nèi)能夠持續(xù)刺激產(chǎn)生持久的免疫應(yīng)答；不同抗原基因的質(zhì)?？梢酝瑫r(shí)聯(lián)合免疫；可以混合多種生化特性類似的質(zhì)粒DNA；DNA疫苗不用加佐劑，成本低；基因疫苗在接種后，可以誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞和體液免疫；DNA分子很穩(wěn)定；毒性逆轉(zhuǎn)的可能性不大；質(zhì)粒載體可以反復(fù)使用[26]。然而DNA疫苗尚未得到廣泛的應(yīng)用，因?yàn)镈NA疫苗涉及到如何應(yīng)用抗原、佐劑、及DNA本身的生物安全性等問題，而安全問題則是人們對它的最大顧慮。結(jié)核病DNA疫苗既能成為預(yù)防性疫苗，還可以成為治療性疫苗。DNA疫苗的優(yōu)點(diǎn)多于其他一切疫苗。但DNA疫苗最大缺陷就是對較大哺乳動(dòng)物缺乏免疫原性[25]，因此，如何提高DNA疫苗的免疫效力仍需要繼續(xù)研究與進(jìn)一步探討。

5 當(dāng)前困境與展望

雖然隨著WHO推薦的肺結(jié)核診斷和治療的標(biāo)準(zhǔn)化的方法廣泛應(yīng)用，在1995和2008之間超過3600萬人被治愈的，避免了600萬人死亡，然而全球結(jié)核病控制是遠(yuǎn)遠(yuǎn)沒有完成。結(jié)核病仍然嚴(yán)重威脅全球公共健康，幾個(gè)關(guān)鍵的挑戰(zhàn)依然存在，如技術(shù)診斷、治療落后和不充分的預(yù)防[1-6]。多重耐藥(MDR)結(jié)核病仍是一個(gè)嚴(yán)重的威脅。慶幸的是，現(xiàn)有的藥物療法可以治愈大多數(shù)的患者，如果在早期病程中應(yīng)用合理的干預(yù)措施，可有效降低傳播率、防止疾病蔓延[1-4,20]。加強(qiáng)結(jié)核病例發(fā)現(xiàn)，感染控制，和異煙肼預(yù)防性治療聯(lián)合對艾滋病毒相關(guān)的結(jié)核病防治，通過個(gè)體的免疫重建和降低HIV的傳播引起結(jié)核病發(fā)病率短期和長期的下降[5,26]。雖然2050年消除肺結(jié)核作為一個(gè)全球性公共健康問題的長期遠(yuǎn)大目標(biāo)，只有通過新的干預(yù)措施和發(fā)展新型疫苗，才可以實(shí)現(xiàn)這一重大貢獻(xiàn)。