徐飏 綜述 趙丹青 審校

(貴州醫(yī)科大學(xué)，貴州 貴陽 550002)

蛋白質(zhì)組(proteome)一詞，源于蛋白質(zhì)(protein)與基因組(genome)兩個詞的組合，意指“一種基因組所表達(dá)的全套蛋白質(zhì)”，即包括一種細(xì)胞乃至一種生物所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)。隨著人類基因組計劃的順利完成，蛋白質(zhì)組學(xué)研究成為世界生命科學(xué)領(lǐng)域的一個極其活躍的部分，并且進(jìn)入“后基因組時代”[1]，蛋白質(zhì)組學(xué)已經(jīng)成為生物醫(yī)學(xué)研究中最重要的應(yīng)用手段之一。子癇前期蛋白質(zhì)組學(xué)成為了研究子癇前期的病因、發(fā)病機制及相關(guān)標(biāo)志物的一個重要組成部分。近年來，將蛋白質(zhì)組學(xué)方法應(yīng)用于子癇前期的診斷，通過分析孕婦血液、腦脊液、尿液、羊水、滋養(yǎng)細(xì)胞或其他代謝產(chǎn)物的研究取得了顯著進(jìn)展，發(fā)現(xiàn)特異性生物標(biāo)志蛋白，對臨床早期診斷、改善母兒結(jié)局、降低母兒嚴(yán)重癥的發(fā)病率及死亡率發(fā)揮明確幫助。

1 蛋白質(zhì)組學(xué)的研究內(nèi)容及相關(guān)技術(shù)方法

蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的核心是對蛋白質(zhì)進(jìn)行大規(guī)模的綜合整體分析，進(jìn)一步對其所執(zhí)行的生理病理的生命活動做出最準(zhǔn)確、最本質(zhì)的闡述。蛋白質(zhì)組學(xué)的飛速發(fā)展離不開技術(shù)手段的支持，得益于包括質(zhì)譜技術(shù)在內(nèi)的多種生物技術(shù)平臺的發(fā)展?，F(xiàn)階段蛋白質(zhì)組學(xué)的主要目標(biāo)是通過功能和表達(dá)兩個方面鑒定和識別潛在的生物標(biāo)志物。功能蛋白質(zhì)組學(xué)是用于確定細(xì)胞器和復(fù)合物中蛋白質(zhì)的特性，表達(dá)蛋白質(zhì)組學(xué)則用于測量在給定的條件或參數(shù)下的蛋白水平的波動[2]。通過識別特異蛋白及其相關(guān)信號通路，可以為疾病的早期診斷提供特異性的生物標(biāo)志物。

1.1雙向凝膠電泳(2-DE)及雙向熒光差異凝膠電泳(DIGE)技術(shù) 2-DE 技術(shù)是目前經(jīng)典的蛋白質(zhì)組學(xué)分離技術(shù)。原理是把復(fù)雜蛋白混合物中的蛋白質(zhì)在二維平面上分開。它可用于蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后修飾研究，蛋白質(zhì)組的比較和蛋白質(zhì)間的相互作用，細(xì)胞分化凋亡研究，致病機制等許多方面。而DIGE 技術(shù)是經(jīng)典2-DE 技術(shù)改進(jìn)的結(jié)果，它可以在給定的樣本中用一套熒光染料標(biāo)記樣本中的所有蛋白質(zhì)，以最小的蛋白移動性干擾實現(xiàn)2-DE分析。該方法有助于完全二維分析和量化，涉及極小數(shù)量的樣品量的蛋白質(zhì)豐度變化[3]

1.2質(zhì)譜技術(shù)(MS) MS是蛋白質(zhì)組學(xué)研究中最重要的鑒定技術(shù)，其基本原理是樣品分子離子化后，根據(jù)不同離子之間的荷質(zhì)比(M/E)的差異來分離并確定分子量。目前常用的質(zhì)譜包括兩種：基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)和表面增強激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(SELDI-TOF-MS)。

1.3同位素親和標(biāo)簽(ICAT)及細(xì)胞培養(yǎng)條件下穩(wěn)定同位素標(biāo)記(SILAC)技術(shù) ICAT是利用一種化學(xué)試劑-同位素親和標(biāo)簽試劑預(yù)先標(biāo)記某一類蛋白質(zhì)，分離純化后，再進(jìn)行MS鑒定分析其母體蛋白質(zhì)在原來細(xì)胞中的相對豐度。SILAC是一種體內(nèi)標(biāo)定技術(shù)，將含有輕、重同位素型必需氨基酸的培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，傳代若干次后，細(xì)胞內(nèi)蛋白會被同位素穩(wěn)定標(biāo)記。

1.4蛋白質(zhì)芯片 蛋白質(zhì)芯片技術(shù)能在實驗中快速、簡單和平行地訪問成千上萬個元素[4]。該技術(shù)近年來已經(jīng)成為大規(guī)模、高通量生物學(xué)的核心組成部分，在基礎(chǔ)研究、診斷和生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)方面顯示出很大的潛力。

1.5生物信息學(xué) 生物信息學(xué)從20世紀(jì)90年代開始發(fā)展起來。它以網(wǎng)絡(luò)和計算機為核心，建立全面、專業(yè)、精準(zhǔn)的數(shù)據(jù)庫，為人們提供相關(guān)實驗結(jié)果的查詢、分析、比對的技術(shù)平臺。在蛋白質(zhì)組學(xué)中生物信息學(xué)有以下應(yīng)用：比對數(shù)據(jù)庫中的已知蛋白質(zhì)，判斷未知蛋白質(zhì)的功能，為蛋白質(zhì)的鑒定、結(jié)構(gòu)分析以及功能預(yù)測提供可靠的實驗依據(jù)。

2 蛋白質(zhì)組學(xué)在妊娠期高血壓疾病中的研究

子癇前期是嚴(yán)重危害母嬰健康的妊娠期間特有嚴(yán)重疾病，對母兒產(chǎn)生嚴(yán)重危害，是母兒危重癥發(fā)病和死亡的主要原因之一。子癇前期多發(fā)生在妊娠中晚期， 臨床以高血壓、水腫和蛋白尿為主要表現(xiàn)，若不及時治療，可導(dǎo)致孕婦腎損害，甚者發(fā)生急性腎衰竭[5]，嚴(yán)重影響母嬰生命安全。目前，對子癇前期的診斷，僅依靠孕婦病史、體征及相關(guān)輔助檢查等診斷方法還不能夠?qū)ζ溥M(jìn)行精確的預(yù)測、早期診斷。隨著蛋白組學(xué)研究的興起，通過對孕婦體液及胎兒附屬物，如血液、腦脊液、尿液、羊水、滋養(yǎng)細(xì)胞等的差異蛋白質(zhì)譜的分析，有望闡明妊娠妊娠期高血壓疾病發(fā)病的相關(guān)分子生物學(xué)基礎(chǔ)，為我們研究妊娠期高血壓疾病的發(fā)病機制、疾病的篩查及預(yù)防提供了全新的方法和思路。

2.1體液研究

2.1.1血液 S.M.Kim等[6]對子癇前期的婦女孕中期的血漿樣品進(jìn)行了大規(guī)模的定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析，并從中鑒定了幾種差異蛋白。在這些研究中，C1組成分(C1S)和蛋白α-1-微球蛋白(AMBP)在子癇前期組中明顯過表達(dá)。H.Watanabe等[7]分析子癇前期患者和正常孕婦的血清，并對其進(jìn)行蛋質(zhì)組學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)在子癇前期患者血清中叢生蛋白水平升高，認(rèn)為研究血清中蛋白質(zhì)組學(xué)的表達(dá)，對闡明子癇前期發(fā)病的病理生理學(xué)機制起到一定的作用。E.Jenny等[8]應(yīng)用質(zhì)譜技術(shù)及ELISA 研究子癇前期孕婦及正常妊娠婦女的血清比較，發(fā)現(xiàn)胰島素樣生長因子亞單位可成為子癇前期的血清標(biāo)志物，對子癇前期的早期診斷、針對性治療以及降低子癇前期的發(fā)病率具有重要意義。V.Kolla等[9]研究了孕早期母體血漿樣品，使用四重同量異位標(biāo)簽進(jìn)行了相對和絕對定量檢測，在子癇前期的妊娠婦女血液樣本中鑒定出表達(dá)的10種蛋白質(zhì)，包括聚集蛋白、纖維蛋白原、纖連蛋白、血管緊張素原、免疫調(diào)節(jié)分子和半乳凝素3結(jié)合蛋白。

2.1.2腦脊液 E.Ciampa等[10]通過對子癇前期患者和對照組患者在分娩前的脊髓麻醉中獲取腦脊液樣本，應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)平臺SOMAscan對其進(jìn)行分析，通過酶聯(lián)免疫吸附試驗驗證了腦脊液中存在表達(dá)蛋白質(zhì)的濃度差異。E.R.Norwitz等[11]應(yīng)用差異蛋白鑒定技術(shù)證實匹配的蛋白峰值為血紅蛋白(Hb) 的a鏈和b鏈。ELISA分析證實臨床診斷重度子癇組患者腦脊液中Hb濃度顯著高于輕度子癇和正常妊娠婦女。由此證明腦脊液蛋白質(zhì)組學(xué)標(biāo)志物可在重度子癇患者及輕度子癇患者和正常妊娠婦女中鑒別出來。B.Irina等[12]應(yīng)用SELDI-TOF-MS 技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)腦脊液中存在4種差異蛋白，可精確的篩查重度子癇前期患者。

2.1.3尿液 王然等[13]研究結(jié)果顯示隨著妊娠期高血壓的加重，尿液中IgG、TRF、mALB、β2-MG 各項指標(biāo)也呈逐漸升高的趨勢，聯(lián)合檢測尿中各種蛋白可有效診斷妊娠期高血壓。A. S.Kononikhin等[14]采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對30例輕度和重度子癇前期婦女和對照組的尿樣進(jìn)行分析，研究表明子癇前期孕婦尿液中存在明顯的差異生物標(biāo)志物。S.M.Lee等[15]研究發(fā)現(xiàn)，尿液的蛋白質(zhì)學(xué)分析可精確區(qū)分子癇前期程度分型。冉雪蓮等[16]研究發(fā)現(xiàn)子癇前期孕婦血清與尿液中的胎盤蛋白13水平均明顯高于正常孕婦，尤其提出重度子癇前期孕婦血清與尿液中的胎盤蛋白13水平明顯升高,而早發(fā)型患者的升高更加明顯。由次推斷胎盤蛋白13可以作為早發(fā)型子癇前期預(yù)測的重要指標(biāo).

2.2胎兒附屬物

2.2.1羊水 有研究[17]對5名先兆子癇患者和5名對照組的羊水通過2DE-MS分析發(fā)現(xiàn)甲狀腺素運載蛋白(TTR)存在于先兆子癇和對照組婦女，盡管這兩種形式在兩組中的性質(zhì)相似，但與對照組相比，先兆子癇婦女顯示出單體蛋白數(shù)量的顯著增加，研究表明羊水中氧化甲狀腺素運載蛋白可作為先兆子癇的早期標(biāo)志物。與之前的研究結(jié)果類似，K.J.Oh等[18]同樣發(fā)現(xiàn)載脂蛋白A-I，可能是子癇前期的特異性標(biāo)志物，在子癇前期早期診斷中具有重要意義。

2.2.2胎盤 Y.L.Feng等[19]通過對比子癇前期組和正常足月組，各20例，將胎盤組織細(xì)胞用相對和絕對定量的等壓標(biāo)簽(iTRAQ)標(biāo)記，加上質(zhì)譜分析出37種差異蛋白質(zhì)，研究發(fā)現(xiàn)iTRAQ技術(shù)可有效篩選子癇前期妊娠胎盤中的差異表達(dá)蛋白。X.H.Jin等[20]研究采用2D液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜定量蛋白質(zhì)組學(xué)策略篩選胎盤組織差異表達(dá)蛋白，有145種蛋白質(zhì)在子癇前期和對照病例之間被成功篩選，生物信息學(xué)分析表明，這些蛋白質(zhì)中GPX1、GPX3、SMS、GGCT、GSTK1、NFκB、GSTT2、SOD1和GCLM參加谷氨酰胺代謝過程，研究結(jié)果表明人類胎盤的蛋白質(zhì)組學(xué)分析揭示谷胱甘肽代謝障礙是先兆子癇的潛在發(fā)病機制。M.Sheon等[21]試驗發(fā)現(xiàn)正常孕婦和先兆子癇孕婦的胎盤蛋白質(zhì)組通過雙向電泳顯示了波形蛋白(蛋白水解片段)的八個差異蛋白點，血壓正常和先兆子癇胎盤的免疫印跡顯示波形蛋白的蛋白水解過程不同，特別是與血壓正常的胎盤相比，子癇前期患者32和20 kDa的低分子量波形蛋白片段分別高出3.3和2.6倍，表明波形蛋白片段在先兆子癇胎盤中存在差異積聚。鄭明燕等[22]研究表明iTRAQ聯(lián)合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜( LC-MS /MS) 技術(shù)能有效篩選出子癇前期胎盤組織差異蛋白。

3 結(jié)語及展望

通過對這些蛋白質(zhì)的深入研究，不僅可以揭示與子癇前期發(fā)病相關(guān)的分子生物學(xué)基礎(chǔ)及其發(fā)病機制提供理論依據(jù)，從而進(jìn)行臨床早期診斷，通過有效的管理和治療，制定出個性化的治療方案，及早進(jìn)行監(jiān)護(hù)，改善母兒結(jié)局，降低母兒嚴(yán)重的發(fā)病率和死亡率，從而減少妊娠期高血壓疾病的發(fā)生率。近年來蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)已經(jīng)開始應(yīng)用于婦產(chǎn)科，并取得了一些成果，但仍處于起步階段，作為新興的領(lǐng)域，其在子癇前期的研究中還應(yīng)有更廣泛的應(yīng)用前景?？梢哉f蛋白質(zhì)組研究的開展不僅是生命科學(xué)研究進(jìn)入后基因組時代的里程碑，也是后基因組時代生命科學(xué)研究的核心內(nèi)容之一。