蔣菲婭 劉文 伍洋科 谷俊遠(yuǎn)

研究進(jìn)展，以闡明mTOR信號通路在肺纖維化中的作用機(jī)制。

mTOR

mTOR即哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)，它是磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B, Akt)下游的一種重要的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶。mTOR由兩種蛋白復(fù)合物組成，即對雷帕霉素敏感的mTORC1和不敏感的mTORC2。mTORC1由mTOR、mLST8、Raptor、DEPTOR和PRAS40組成，mTORC1的上游調(diào)節(jié)因子主要是胰島素、生長因子、血清、磷脂酸、氨基酸及氧化應(yīng)激等刺激因素，其主要促進(jìn)能量代謝、蛋白質(zhì)合成、脂肪生成、抑制溶酶體形成和自噬作用。mTORC1的下游主要是S6K1及4EBP1這兩個效應(yīng)器，兩者在蛋白質(zhì)合成過程中發(fā)揮重要作用。磷酸化核糖體蛋白S6激酶(P-S6K1)是mTORC1活化的標(biāo)記，激活的mTORC1通過磷酸化下游的S6K1和4EBP1促進(jìn)細(xì)胞生長關(guān)鍵蛋白的轉(zhuǎn)錄、翻譯和自噬，影響了蛋白質(zhì)的合成和細(xì)胞生長；mTORC2由mTOR、mSIN1、mLST8、DEPTOR、Protor、和Rictor組成，其活性受胰島素/PI3K信號通路調(diào)控，AGC蛋白激酶家族(PKC、PKA與PKG)是mTORC2的主要下游信號，mTORC2在調(diào)節(jié)細(xì)胞存活和代謝以及肌動蛋白細(xì)胞骨架等方面起重要作用[4]。

mTOR是細(xì)胞生理病理進(jìn)程中的關(guān)鍵調(diào)控因子，可受細(xì)胞內(nèi)外營養(yǎng)物質(zhì)、生長因子、能量轉(zhuǎn)化、缺氧應(yīng)激和激素水平等多種因素的影響，其介導(dǎo)的信號通路在生命過程中起著非常重要的作用。mTOR信號通路異常與臨床上多種疾病有關(guān)，如腫瘤、增生性疾病、自閉癥譜系障礙、2型糖尿病、神經(jīng)退行性疾病以及免疫失調(diào)等。近年來，越來越多研究發(fā)現(xiàn)mTOR信號通路與肺纖維化的發(fā)生和病理進(jìn)展密切相關(guān)，但其具體病理機(jī)制需要我們進(jìn)一步去研究。

mTOR與肺纖維化的關(guān)系

一、mTOR與自噬

細(xì)胞自噬是指細(xì)胞通過溶酶體清除“廢物”的自我消化過程，包括異常修飾的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)聚集體以及受損的細(xì)胞器，細(xì)胞自噬以細(xì)胞質(zhì)內(nèi)自噬體的出現(xiàn)為標(biāo)志。自噬主要分為三種類型，微自噬/小自噬、巨自噬/大自噬、和分子伴侶介導(dǎo)的自噬。微自噬是一種非選擇性的溶酶體降解過程，溶酶體直接通過溶酶體膜的突起、隔膜和內(nèi)陷，吞噬和降解細(xì)胞質(zhì)中的底物。分子伴侶介導(dǎo)的自噬是溶酶體蛋白水解的主要途徑之一，它具有高度的選擇性，只能降解溶酶體中某些特定的可溶性蛋白質(zhì)而不能降解細(xì)胞器。這些可降解蛋白質(zhì)含有特定的氨基酸序列，可被熱休克蛋白分子伴侶或其復(fù)合物識別和結(jié)合，然后直接運(yùn)輸?shù)饺苊阁w進(jìn)行降解。通常說的細(xì)胞自噬即巨自噬，在巨自噬過程中，由細(xì)胞膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或高爾基體衍生的雙層膜結(jié)構(gòu)，通過胞質(zhì)物質(zhì)和某些細(xì)胞器、蛋白質(zhì)等包合，形成自噬體(autophagosome)，然后自噬體的外膜與溶酶體膜融合形成自噬溶酶體，并最終在一系列水解酶的作用下將其所包裹內(nèi)容物降解[5]。自噬作為細(xì)胞的一種自我保護(hù)機(jī)制，廣泛存在于真核細(xì)胞中，在調(diào)節(jié)細(xì)胞存活和死亡中起著至關(guān)重要的作用。在正常情況下，自噬可通過降解細(xì)胞內(nèi)異常蛋白質(zhì)、受損或多余的細(xì)胞器、細(xì)胞內(nèi)的病毒和細(xì)菌，以維持細(xì)胞功能[6]。缺氧、營養(yǎng)不足、生長因子缺乏、微生物感染、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和氧化應(yīng)激等因素都能誘發(fā)細(xì)胞自噬[7]。近年來，自噬作為除細(xì)胞凋亡以外的另一種重要的程序性死亡方式，已被證實(shí)參與了許多疾病的發(fā)生發(fā)展過程。自噬的發(fā)生存在多種信號通路，其中磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/mTOR信號通路在自噬過程中起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用[8]。PI3K/Akt/mTOR信號通路在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長與存活、細(xì)胞增殖、細(xì)胞運(yùn)動、以及蛋白質(zhì)合成和轉(zhuǎn)錄等生理功能方面發(fā)揮著重要作用，是細(xì)胞內(nèi)重要的信號通路之一[9]。在自噬啟動階段，mTOR扮演著關(guān)鍵調(diào)控因子的角色，對自噬的形成和成熟起著關(guān)鍵作用。mTOR的激活可以抑制自噬的發(fā)生，是自噬的負(fù)性調(diào)控分子。ULK與酵母Atg1作用相似，作用于mTOR復(fù)合物的下游。ULK與Atg13和支架蛋白FIP200形成一個大的復(fù)合物，是哺乳動物啟動自噬的重要調(diào)節(jié)因子。當(dāng)營養(yǎng)充足時，mTOR被激活，繼而使Atg13高度磷酸化，降低其與ULK的結(jié)合能力，隨之ULK的活性降低，從而抑制自噬的發(fā)生。在缺氧、營養(yǎng)匱乏的情況下，AMP/ATP比值升高并活化AMPK，被活化的AMPK直接作用于mTOR或通過TSC1/TSC2抑制Rheb活性間接作用于mTOR，并抑制其活性，引發(fā)ULK激酶活性升高和Atg13、ULK去磷酸化，導(dǎo)致ULK自磷酸化和Atg13、FIP200磷酸化，從而促進(jìn)細(xì)胞自噬的發(fā)生[10]。

肺間質(zhì)纖維化是許多肺部疾病中導(dǎo)致肺功能衰竭的常見病理過程，其具體發(fā)病機(jī)制迄今為止仍未得到明確的闡明。一般認(rèn)為是多種因素綜合作用的結(jié)果，涉及肺成纖維細(xì)胞活化成肌成纖維細(xì)胞，并在肺間質(zhì)中聚集、致纖維化細(xì)胞因子表達(dá)上調(diào)、細(xì)胞外基質(zhì)合成增多及降解減少、單核巨細(xì)胞等炎癥細(xì)胞的浸潤、氧自由基生成過多及清除減少等方面。細(xì)胞自噬作為哺乳動物細(xì)胞對抗外界壓力或環(huán)境改變的自我調(diào)控方式，可以利用溶酶體降解細(xì)胞內(nèi)受損的細(xì)胞器和入侵的微生物來維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)。有文獻(xiàn)報(bào)道肺纖維化過程中自噬水平發(fā)生了改變，肺纖維化模型組與對照組相比，肺組織自噬水平顯著降低，而提升肺組織的自噬水平明顯減輕了肺纖維化的程度[11]。mTOR能夠通過調(diào)控自噬參與IPF的調(diào)節(jié)。肺纖維化患者的肺成纖維細(xì)胞也觀察到mTOR通路持續(xù)激活，且p62表達(dá)和自噬體數(shù)目增加，LC3B的表達(dá)減少[12]，證明肺泡上皮細(xì)胞mTOR通路的過度激活，伴隨自噬能力降低并參與肺纖維化的發(fā)病機(jī)制。在Ⅰ型聚合膠原上培養(yǎng)IPF成纖維細(xì)胞，異常的PTEN/Akt軸激活mTOR，高表達(dá)的mTOR抑制自噬活性，且IPF成纖維細(xì)胞的死亡減少[13]。雷帕霉素是一種常用的的mTOR信號通路特異性抑制劑，可抑制mTOR通路下游關(guān)鍵分子S6K1和4EBP1，在肺纖維化治療中起重要作用[14]。目前研究報(bào)道，在早期急性肺損傷方面，wang等[15]在脂多糖誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷模型中發(fā)現(xiàn)mTOR信號通路被激活，而經(jīng)雷帕霉素干預(yù)后支氣管肺泡灌洗液中相關(guān)炎性因子的表達(dá)水平明顯減少。以上研究表明，mTOR的過度激活及自噬能力的降低是包括肺泡上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等多細(xì)胞誘導(dǎo)的肺纖維化的原因之一。通過mTOR調(diào)節(jié)調(diào)控自噬能力可能是治療肺纖維化的一種合理方法。

二、mTOR與肺成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化

肺纖維化的病理表現(xiàn)為肺間質(zhì)內(nèi)大量基質(zhì)蛋白積聚和肌成纖維細(xì)胞聚集與活化，α平滑肌肌動蛋白(alpha smooth muscle actin,α-SMA)是肌成纖維細(xì)胞的標(biāo)志蛋白。細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)蛋白的過度沉積也是肺纖維化的特征之一，在肺纖維化過程中，細(xì)胞外基質(zhì)的生物力學(xué)特性發(fā)生改變并通過影響轉(zhuǎn)化生長因子-β1( transforming growth factor β1，TGF-β1)的活化促進(jìn)肺纖維化的發(fā)展。肌成纖維細(xì)胞是一類活化形式的成纖維樣細(xì)胞，其增殖活躍能夠分泌ECM蛋白，是ECM 的主要來源。肌成纖維細(xì)胞分泌ECM在肺損傷修復(fù)過程中是必不可少的，正常情況下?lián)p傷修復(fù)活躍期結(jié)束時，肌成纖維細(xì)胞會通過細(xì)胞凋亡逐漸降解。但肺處于長期慢性損傷或IPF等病理情況下，肌成纖維細(xì)胞持續(xù)存在并引起ECM 過度沉積，ECM發(fā)生病理性改變最終發(fā)展為肺纖維化。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)mTOR可能參與了成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的調(diào)控。在IPF患者中，肺內(nèi)肌成纖維細(xì)胞存在過度增生和持續(xù)凋亡并存。有研究者觀察到，在IPF患者肺分離的成纖維細(xì)胞中，LC3B水平降低，磷酸化Akt和磷酸化mTOR增加[12]。Tulek等[16]在雷帕霉素抗博來霉素誘導(dǎo)的大鼠肺纖維化研究中也發(fā)現(xiàn)，在肺纖維化早期階段使用mTOR信號通路抑制劑，能減少成纖維細(xì)胞增殖，對肺纖維化的發(fā)生有一定的抑制作用。PTEN(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10)是mTOR信號通路上游的調(diào)節(jié)蛋白，有研究表明，肺纖維化患者成纖維細(xì)胞PTEN表達(dá)降低，PTEN過度表達(dá)時，成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞的過程受到明顯抑制，而PTEN缺失的成纖維細(xì)胞更容易向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，暗示著PTEN下游的mTOR信號通路也可能參與了肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化[17]。為進(jìn)一步探討了mTOR信號通路在肺纖維化發(fā)病中的作用機(jī)制，研究發(fā)現(xiàn)肺組織中mTOR的活化伴膠原蛋白mRNA表達(dá)增多并與肺纖維化形成有關(guān)，提示兩者具有相關(guān)性。研究表明異常激活的mTOR通路參與了肺纖維化的發(fā)病進(jìn)程，其機(jī)制可能與肺組織內(nèi)肌成纖維細(xì)胞增生、纖維化細(xì)胞因子表達(dá)增加，從而促進(jìn)了膠原蛋白的合成有關(guān)。也有數(shù)據(jù)顯示，在體外培養(yǎng)的IPF患者肺纖維母細(xì)胞中使用mTORC1/2抑制劑P529，有效抑制了TGF-β誘導(dǎo)的肌成纖維細(xì)胞的分化和基質(zhì)金屬蛋白酶的沉積[18]。證明抑制mTOR通路的異?；罨蓽p少細(xì)胞外基質(zhì)沉積，緩解肺纖維化膠原蛋白形成，進(jìn)而達(dá)到抑制或減輕肺纖維化發(fā)生與發(fā)展的目的。

三、mTOR與EMT

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化(epithelial mesenchymal transition，EMT)即上皮細(xì)胞受到持續(xù)性損傷轉(zhuǎn)變成間充質(zhì)細(xì)胞，細(xì)胞功能發(fā)生改變，同時上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-鈣黏蛋白(E-cadherin)表達(dá)減少，間質(zhì)標(biāo)志物ɑ-平滑肌動蛋白(α-SMA)和N-鈣黏蛋白(N-cadherin)表達(dá)增加?，F(xiàn)普遍認(rèn)為，持續(xù)的肺泡上皮損傷導(dǎo)致的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化與特發(fā)性肺纖維化關(guān)系密切，TGF-β1過表達(dá)是導(dǎo)致EMT重要的分子機(jī)制。Molina等[19]用TGF-β1誘導(dǎo)人肺泡上皮細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)肺泡上皮細(xì)胞中α-SMA、Ⅰ型膠原蛋白、波形蛋白等表達(dá)增加且細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槌衫w維細(xì)胞，證實(shí)TGF-β1可誘導(dǎo)EMT發(fā)生。經(jīng)過深入研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1主要是通過Smad依賴途徑和非Smad依賴途徑誘導(dǎo)EMT的發(fā)生[13]。TGF-β1/Smads誘導(dǎo)下游的轉(zhuǎn)錄因子Snail導(dǎo)致α-SMA表達(dá)增加，促進(jìn)EMT；mTOR信號通路異常也參與EMT過程。有研究表明TGF-β1激活PI3K/AKT/mTOR信號通路，可促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)Snail1、 Snail2、Twist 、和E盒結(jié)合鋅指蛋白(ZEB1、 ZEB2)等核轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)，直接抑制E-cadherin表達(dá)，從而促進(jìn)EMT發(fā)生。此外，TGF-β1激活PI3K/AKT/mTOR信號通路可使基質(zhì)金屬蛋白酶水平上升，促進(jìn) E-cadherin 的降解，間接促進(jìn)EMT發(fā)生[20]。也有研究發(fā)現(xiàn)，激活mTOR信號通路抑制自噬活化能有效誘導(dǎo)上皮細(xì)胞分化，加速上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程，進(jìn)而促進(jìn)肺纖維化的發(fā)生與發(fā)展。瘦素可經(jīng)過PI3K /Akt /mTOR途徑抑制A549細(xì)胞的自噬，從而加速其EMT進(jìn)程[21]。在小鼠肺纖維化的模型中，使用雷帕霉素阻斷mTOR通路可抑制上皮細(xì)胞ɑ-SMA上調(diào)和E-cadherin下調(diào)，有效抑制了博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化并減弱體內(nèi)的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[22]。因此，阻斷mTOR可通過調(diào)節(jié)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化抑制肺纖維化的發(fā)展。

總 結(jié)

肺纖維化的發(fā)病率和死亡率不斷上升，嚴(yán)重威脅著人類的生命健康，目前缺乏較佳的治療方案，其常規(guī)應(yīng)用的藥物，如N-乙酰半胱氨酸、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑、抗氧化劑、細(xì)胞毒藥物等，均無明顯療效，且副作用較大，不能從根本上解決問題。隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)mTOR通路過活化和表達(dá)水平增加參與肺纖維化的發(fā)生發(fā)展，mTOR可能是通過調(diào)控細(xì)胞自噬、成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等過程參與肺纖維化的調(diào)節(jié)。抑制mTOR信號通路也在實(shí)驗(yàn)動物中取得了較滿意的結(jié)果，因此靶向調(diào)控mTOR信號通路有望為肺纖維化的診療提供新的靶點(diǎn)。