袁媛，陳慶麗，李鵬超，楊瀟

南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科(江蘇南京 210009)

尿路上皮癌(urothelial carcinoma, UC)是膀胱癌組織學(xué)類型中最常見的類型。在男性中，它的癌癥發(fā)病率為全球第7位，每年會有約429 000例新發(fā)病例，并導(dǎo)致165 000例患者死亡[1]。趨化因子可以選擇性地吸引和激活不同的細胞類型[2-3]，趨化因子配體通過與七跨膜G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptors, GPCR)相互作用介導(dǎo)它們的活性，從而形成趨化因子配體/受體軸[2]。然而，趨化因子信號傳導(dǎo)過程被破壞可能引發(fā)許多不可預(yù)知的后果，比如影響腫瘤發(fā)生和進展[4-5]。已有報道指出在多種腫瘤中不同趨化因子配體和受體的表達升高[6-8]，并導(dǎo)致潛在的信號傳導(dǎo)效應(yīng)異常，這會影響癌癥發(fā)展的許多過程[9-10]。趨化因子配體13(chemokine ligand 13, CXCL 13)便是這類趨化因子中的一個典型代表，它是一種穩(wěn)態(tài)趨化因子，由次級淋巴組織(例如脾、淋巴結(jié)和扁桃體)B細胞區(qū)中的基質(zhì)細胞分泌[11]。CXCL 13在輔助次級淋巴器官內(nèi)調(diào)控不同區(qū)域的細胞遷移中起關(guān)鍵作用，它可以強烈吸引B淋巴細胞，同時促進少量T細胞和巨噬細胞的遷移[12]。之前的研究表明，CXCL 13及其受體水平升高可引起潛在信號傳導(dǎo)因子的過度活化，從而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生、癌細胞生長和轉(zhuǎn)移[13-14]。在本研究中，我們通過免疫組化技術(shù)檢測了CXCL 13在膀胱尿路上皮癌及癌旁組織中的表達，并探討了CXCL 13表達與患者臨床病理特征和患者預(yù)后之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2011年2月至2014年2月在我院泌尿外科手術(shù)切除且經(jīng)病理證實為膀胱尿路上皮癌的標(biāo)本77例和36例癌旁組織(均為病理科保存的石蠟標(biāo)本)。此外，所有患者術(shù)前均未接受任何抗腫瘤治療且未合并其他惡性腫瘤。患者年齡41～85歲，平均(62.14±12.83)歲。組織病理分級按照WHO 2004標(biāo)準(zhǔn)分為G1、G2和G3，其中G1、G2為低分化組，G3為高分化組，腫瘤分期采用國際抗癌聯(lián)盟 (UICC) 2009 TNM分期法。

1.2 免疫組化試劑 CXCL13多克隆抗體購自Abcam公司，工作濃度：1∶250。二抗及DAB顯色試劑盒購自福州邁新公司。

1.3 實驗方法 取病理科保存的術(shù)后石蠟包埋組織切片標(biāo)本，采用免疫組織化學(xué)染色法對膀胱尿路上皮癌及癌旁組織中的CXCL13表達進行檢測，檢測方法嚴格按照操作說明書進行。

1.4 結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn) 免疫組化結(jié)果由2位資深病理醫(yī)師以雙盲法觀察確定，每張切片選取5個高倍鏡視野(×400)，分別計數(shù)每個視野中陽性細胞占總數(shù)細胞的百分數(shù)及著色程度,平均5個視野結(jié)果,按以下標(biāo)準(zhǔn)進行判定[15]。陽性細胞所占比例: 0、≤1%、2%～10%、11%～33%、34%～67%和>67%分別為0分、1分、2分、3分、4分和5分。染色強度：無著色、輕度著色、中度著色和重度著色分別為0分、1分、2分和3分。以上兩項評分相加，可將蛋白表達分為4級：陰性是0～1分，弱表達是2～3分，中等表達是4～5分，強表達是6～8分，弱表達、中等表達和強表達為陽性。

1.5 臨床數(shù)據(jù)收集 記錄患者的性別、年齡、腫瘤組織大小、病理分級以及是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移?；颊咝g(shù)后每3～6個月復(fù)診1次，記錄患者的隨訪和預(yù)后情況。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，癌和癌旁組織CXCL 13的表達及其與臨床各病理參數(shù)的相關(guān)性采用2檢驗，膀胱尿路上皮癌中CXCL 13表達與患者預(yù)后的關(guān)系采用Kaplan-Meier法和Log-rank檢驗，單因素生存分析采用Cox回歸模型，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 膀胱尿路上皮癌與癌旁組織的表達情況 77例膀胱尿路上皮癌患者的標(biāo)本中CXCL 13陽性53例，陽性率為68.8%，其中弱表達和中等表達數(shù)分別為20和23例；36例癌旁組織標(biāo)本中CXCL 13陽性10例，陽性率為27.8%，其中弱表達和中等表達數(shù)分別為6和4例，CXCL13在膀胱尿路上皮癌標(biāo)本中的表達要顯著強于癌旁上皮組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見表1。

表1 CXCL 13在膀胱尿路上皮癌組織及癌旁正常組織中的表達情況

2.2 CXCL 13與膀胱尿路上皮癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系 CXCL 13蛋白的表達與膀胱尿路上皮癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況和臨床分期相關(guān)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的CXCL 13陽性表達率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者(P<0.05)；Ta～T1期患者的 CXCL 13陽性表達率低于T2～T4期患者(P<0.05)；與患者的性別、年齡和腫瘤大小無關(guān)(P>0.05)。見表2。

表2 CXCL 13在膀胱尿路上皮癌組織中的表達與各臨床病理參數(shù)的關(guān)系 例

2.3 膀胱尿路上皮癌中CXCL 13的表達與患者預(yù)后的關(guān)系 77例膀胱尿路上皮癌患者全部獲得隨訪數(shù)據(jù)，經(jīng)Log-rank檢驗分析結(jié)果顯示CXCL 13陽性表達患者和陰性表達患者的5年生存率分別為62.5%和35.8%，陽性患者5年生存率低于陰性表達患者(2=5.423,P=0.020)。見圖1。COX回歸模型分析顯示CXCL 13是影響患者預(yù)后的獨立因素(Wald= 4.923,HR=2.301, 95%CI:1.102～4.803,P=0.026)。

圖1 CXCL 13表達陽性和陰性患者的生存曲線

3 討論

膀胱尿路上皮癌是尿路疾病發(fā)病和死亡的主要原因之一，它的一個特征是分期較早的腫瘤表現(xiàn)出良好的預(yù)后，很少對患者生命造成嚴重威脅，但晚期腫瘤預(yù)后相當(dāng)差，病程進展迅速，表現(xiàn)出很高的致死率。人們已經(jīng)研究了很多種尿路上皮癌的特征，試圖預(yù)測各種腫瘤進程，其中腫瘤的準(zhǔn)確分期和分級對于治療決策是最重要的，大多數(shù)能夠預(yù)測膀胱尿路上皮癌預(yù)后的參數(shù)取決于術(shù)后病理結(jié)果，這導(dǎo)致臨床醫(yī)生治療前的風(fēng)險評估面臨挑戰(zhàn)[1]。最近，出現(xiàn)許多證據(jù)表明CXCL 13是一種與患者癌癥進展相關(guān)的因素，與各種惡性腫瘤的預(yù)后顯著相關(guān)，可以作為癌癥患者診斷和治療的突破點[16]。

隨著近年與膀胱癌有關(guān)研究不斷進展，大量的分子標(biāo)志物被證實可用于BUC的篩查診斷和預(yù)后判斷，但仍然沒有找到一個非常理想的標(biāo)志物。Zheng等[17]報道了CXCL 13過表達與腎透明細胞癌晚期分期和不良預(yù)后有關(guān)，并且發(fā)現(xiàn)CXCL 13與其受體CXCR 5在腎透明細胞癌組織中顯著相關(guān)，其中CXCL 13和CXCR 5同時過表達組的患者預(yù)后最差，此外，在功能和機制研究表明CXCL 13首先結(jié)合CXCR 5，然后活化PI3K/AKT/mTOR信號通路進而促進腎透明細胞癌細胞的增殖和遷移，所以，他們認為CXCL13/CXCR5軸在腎透明細胞癌的發(fā)生發(fā)展中起了重要作用?？紤]到其在泌尿生殖腫瘤中存在過表達，并且參與了腎透明細胞癌細胞的增殖和遷移，我們想進一步探索它與膀胱上皮細胞癌的關(guān)系。

目前CXCL 13與膀胱尿路上皮癌的關(guān)系研究甚少，且具體作用機制尚不明確。我們的研究結(jié)果表明，CXCL 13在膀胱尿路上皮癌中的陽性表達(68.8%)顯著高于癌旁上皮組織(27.8%)(P<0.01)。我們還探究了CXCL 13表達與膀胱尿路上皮癌患者各臨床病理特征的相關(guān)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在18例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中有17例CXCL 13陽性表達, 陽性表達率達到94.4%，顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，我們還發(fā)現(xiàn)T2～T4期患者CXCL 13蛋白表達比Ta～T1期患者顯著增強,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但CXCL 13的表達與患者的性別、年齡、腫瘤大小無顯著相關(guān)性。此外，我們還收集了患者的生存資料，并通過相關(guān)統(tǒng)計學(xué)方法分析了膀胱尿路上皮癌患者的總生存率與CXCL 13表達的關(guān)系，資料表明CXCL 13陽性表達高的膀胱尿路上皮癌患者5年總生存率低于CXCL 13陽性表達低的患者(P=0.020)。關(guān)于CXCL 13調(diào)控腫瘤進展的研究很多，最新的研究表明在RelA過表達條件下，Nrf 2低表達和CXCR 5啟動子DNA甲基化缺失促使乳腺癌中CXCL13-CXCR5的共表達，從而驅(qū)動疾病進展和轉(zhuǎn)移[18]。我們的實驗結(jié)果也表明CXCL 13可能是促進腫瘤進展的一個因素，這與之前的研究結(jié)果是一致的[16]。

總之，我們的研究表明CXCL 13在膀胱尿路上皮癌患者中呈現(xiàn)過表達，并且它的過表達與膀胱尿路上皮癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及臨床分期顯著相關(guān)，此外CXCL 13過表達增高可能是膀胱尿路上皮癌患者的不良預(yù)后的獨立危險因素。這為膀胱尿路上皮癌的診斷和治療提供了潛在的靶點，但仍需要我們更深入的研究闡明CXCL 13在膀胱尿路上皮癌中發(fā)揮的生物學(xué)作用及其內(nèi)在機制。