奈文青, 戴萌

南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院健康管理科(廣東廣州 510515)

心腦血管疾病的發(fā)病率、病死率在全球均位居首位，動脈粥樣硬化是引起心腦血管疾病發(fā)生的主要原因[1-2]。目前普遍認(rèn)為動脈粥樣硬化是一種慢性、炎癥性、進(jìn)展性疾病，而明確動脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制是防治心腦血管病的關(guān)鍵。盡管該領(lǐng)域存在大量研究，但是動脈粥樣硬化進(jìn)展和斑塊破裂的分子機(jī)制目前仍不完全清楚，迫切需要新的研究來闡明斑塊進(jìn)展機(jī)制[3]。在生物技術(shù)層面，基因芯片發(fā)展非常迅速，目前使用也非常普遍，可以同時識別成千上萬個差異基因，為動脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制研究提供新的方向。國內(nèi)外大量研究通過基因芯片技術(shù)探尋動脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展的病理過程，旨在尋找動脈粥樣硬化進(jìn)展過程中的差異表達(dá)基因，識別動脈粥樣硬化進(jìn)展過程中的重要的信號通路和相關(guān)的致病基因，但是上述這些研究設(shè)計方面或多或少存在一些問題，如樣本收集不規(guī)范、樣本量過少、不同來源不同部位的血管進(jìn)行比較，這些會引入一些試驗偏差，影響研究結(jié)果的準(zhǔn)確性和可推廣性[4-7]。在本次研究中，為了克服不同個體、不同部位血管帶來的研究偏差，我們采用相同個體的動脈粥樣硬化斑塊和對應(yīng)的斑塊旁組織進(jìn)行基因芯片表達(dá)譜分析，獲取斑塊組織和斑塊旁組織間差異表達(dá)基因，并運用系統(tǒng)生物信息學(xué)方法獲取與動脈粥樣硬化相關(guān)的信號通路和風(fēng)險基因，初步探索動脈粥樣硬化斑塊形成的潛在分子病理機(jī)制。這些為深度挖掘動脈粥樣硬化斑塊發(fā)生機(jī)制、探尋動脈粥樣斑塊潛在治療靶點和篩選心腦血管疾病早期預(yù)警靶標(biāo)奠定一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑與儀器 TRIGene提取RNA試劑,Takara公司；PrimeScriptTM RT reagent Kit,RR047Q，Takara； SYBR? Premix Ex Taq(Tli RNaseH Plus)-QPCR Kit，RR420A, Takara。蛋白質(zhì)定量試劑盒(BCA法)，碧云天;RIPA裂解液，9806S,CST；雞尾酒蛋白酶抑制劑，5872S，CST； SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5X)，P0051，碧云天；Western一抗二抗去除液(中性)，P0025N，碧云天；胎牛血清，Gibco；鼠抗VAV1單克隆抗體，Cell Signaling Technology,兔抗LYN單克隆抗體，Abcam，兔抗LYN單克隆抗體，Abcam, 兔抗PTPN6單克隆抗體，Abcam;GAPDH一抗、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔、山羊抗鼠、兔抗山羊二抗、化學(xué)發(fā)光試劑盒均采購于Santa Cruz；本次實驗研究所使用儀器主要有PCR儀Lightcycler96 (Roche Applied Science)和蛋白印跡掃描儀ChemiDocTMXRS Imaging System。

1.2 樣本數(shù)據(jù)描述與處理 本次研究使用的GSE43292數(shù)據(jù)集來源于GENE EXPRESSION OMNIBUS數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geoprofiles/)，采用的芯片是Affymetrix Human Gene1.0 ST Array[8]。該芯片數(shù)據(jù)集樣本： 32例頸動脈斑塊組織和32例斑塊旁組織，為頸動脈內(nèi)膜剝脫術(shù)后的病變血管組織。術(shù)后切除的組織樣本根據(jù)國際AHA的分類標(biāo)準(zhǔn)判定：斑塊組織多是處于IV或V期，而斑塊旁組織絕大多數(shù)為Ⅰ和Ⅱ期病變。

下載GSE43292的CEL原始文件后,然后對探針?biāo)叫盘栔颠M(jìn)行系統(tǒng)預(yù)處理，包括：質(zhì)控、變異穩(wěn)定性的分析、背景的矯正、數(shù)據(jù)歸一化處理和基因注釋，最后轉(zhuǎn)為基因水平表達(dá)值。斑塊組織和斑塊旁組織間差異基因采取SAM(significance analysis of microarrays)檢驗和倍比法(fold-change, FC)獲取，篩選閾值為FDR≤0.05且FC>1.5或<0.667。采用R環(huán)境下的GO功能富集包[9]進(jìn)行后續(xù)的GO功能注釋，采用超幾何檢驗，篩選閾值P<0.01。利用SubpathwayMiner[10]進(jìn)行后續(xù)通路分析，采用超幾何檢驗，篩選閾值P<0.01。通過Human Protein Reference (Release 9)數(shù)據(jù)庫[11](http://www.hprd.org/)和Cytoscape[12-13](版本號3.6.1)實現(xiàn)蛋白網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及可視化。利用CFinder軟件[14-15]在蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中篩查疾病風(fēng)險模塊。

1.3 提取RNA及檢測其濃度和純度 從超低溫冰箱中取出8對頸動脈動脈斑塊和斑塊旁組織，Trizol法提取總RNA，瓊脂糖凝膠電泳判斷RNA是否降解，最后用紫外分光光度法檢測RNA的濃度和純度，其中A260/280吸光值比率在1.8～2.1范圍內(nèi)者方可進(jìn)行后續(xù)系列實驗。

1.4 RT-PCR檢測目標(biāo)基因mRNA表達(dá)水平 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 反應(yīng)依據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行相應(yīng)操作。采用SYBR 法Q-PCR 試劑盒(SYBR? Premix Ex Taq,Takara)在熒光定量PCR(Lightcycler96)上熒光定量PCR操作，實驗條件：45 個循環(huán)包括95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，然后60～95 ℃融解曲線分析。目標(biāo)基因引物的序列從引物數(shù)據(jù)庫下載，并委托生工生物工程股份有限公司進(jìn)行合成(表1)。內(nèi)參基因采用GAPDH，并采用2-ΔΔCt方法[16]計算各基因?qū)?yīng)的表達(dá)值。各個基因的表達(dá)值測量均重復(fù)3次。

1.5 組織標(biāo)本蛋白表達(dá)水平分析 從-80℃實驗室超低溫冰箱中拿出4對頸動脈粥樣斑塊組織，稱取重量后放入研缽，并用液氮研磨成粉末，用RIPA裂解液提取組織蛋白，測定蛋白濃度，按照標(biāo)準(zhǔn)制膠配方表來配制所需的5%和12%分離膠，并使用Bio-Rad微型電轉(zhuǎn)移系統(tǒng)進(jìn)行跑膠，參數(shù)采用恒流即32 mA(16 mA/gel)，時間約為70～90 min，轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜電壓為恒壓100 V，時間70 min，封閉及孵育抗體，在蛋白印跡掃描儀ChemiDocTM XRS Imaging System上掃描條帶。并使用ImageJ軟件測定條帶的顏色深度，并用內(nèi)參GAPDH進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，頸動脈粥樣硬化斑塊和斑塊旁組織之間采用Wilcoxon符號秩檢驗對每個基因表達(dá)情況差異進(jìn)行統(tǒng)計分析。統(tǒng)計檢驗水準(zhǔn)為α=0.05，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基因表達(dá)譜芯片分析結(jié)果 通過頸動脈粥樣硬化斑塊的基因表達(dá)譜分析，我們獲取了816 個差異基因，包括上調(diào)差異表達(dá)基因443個，下調(diào)差異表達(dá)基因373個(圖1)。生物信息學(xué)分析中GO的富集結(jié)果：差異表達(dá)基因在細(xì)胞激活、細(xì)胞因子、適應(yīng)性免疫應(yīng)答和肌肉系統(tǒng)過程富集顯著性是最高，上述生物過程可能參與了動脈粥樣硬化斑塊的進(jìn)展。而通路的生物信息學(xué)分析結(jié)果：77個通路被差異上調(diào)基因顯著富集，26個通路被差異下調(diào)基因顯著富集。其中滿足富集閾值要求的前5個顯著性最高的通路如B細(xì)胞受體信號通路和轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)信號通路等(表2)。最后，我們構(gòu)建了上述差異基因?qū)?yīng)蛋白的互作網(wǎng)絡(luò)，網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點為差異基因和與差異基因直接互作的鄰居基因。在該網(wǎng)絡(luò)中，本研究共獲取了10個在蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中具有密切互作聯(lián)系的差異基因節(jié)點，說明這些節(jié)點在網(wǎng)絡(luò)中與其他節(jié)點具有更緊密的互作關(guān)系，在生物網(wǎng)絡(luò)中占據(jù)更重要的位置，提示在疾病進(jìn)展中可能發(fā)揮著更重要作用。這些密切互作的節(jié)點基因包括SMAD9、LYN、PTPN6、ZBTB16、SYK、PRKCB、SVIL、VAV1、BMPR1B 和 BTK(圖2-A)。此外，在蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中使用CFinder軟件尋找疾病風(fēng)險模塊。圖2-B顯示在默認(rèn)參數(shù)下識別到的疾病風(fēng)險模塊，這個模塊中包括8個差異表達(dá)的基因，分別是CSF2RB、LCP2、LYN、PLCG2、PTPN6、PTPRC、SYK和VAV1。結(jié)合蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中的前10個重要的差異基因節(jié)點和疾病風(fēng)險模塊中的差異基因，我們發(fā)現(xiàn)SYK、LYN、PTPN6和VAV1無論在蛋白互作網(wǎng)絡(luò)還是疾病風(fēng)險模塊中都占據(jù)關(guān)鍵的位置，即為聯(lián)合分析的重要差異基因，可能是疾病發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用的基因。

注：紅色圓點代表上調(diào)差異基因共443個，差異程度最大的基因為FABP4，藍(lán)色圓點代表下調(diào)差異基因373個，差異程度最大的基因為CNTN1。Atheroma plaque:頸動脈粥樣硬化斑塊組織，Macroscopically intact plaque：斑塊旁組織

圖1動脈粥樣硬化斑塊和斑塊旁組織間差異表達(dá)基因火山圖

2.2 實驗驗證關(guān)鍵的差異基因 所有實驗均重復(fù)3次。采用熒光定量PCR對8對頸動脈斑塊(n=8)和斑塊旁標(biāo)本(n=8)進(jìn)行分析，驗證上述標(biāo)本中SYK,LYN,PTPN6和VAV1基因的表達(dá)改變：VAV1(13.2±4.7), LYN(3.6±0.9), SYK(12.1±4.4)和PTPN6(11.8±4.6)。結(jié)果顯示，4個差異表達(dá)基因在mRNA表達(dá)層面與芯片分析結(jié)果趨勢完全一致，且差異表達(dá)程度較芯片更明顯(圖3)。

表1 實時熒光定量PCR引物

表2 差異表達(dá)基因富集KEGG排名前5的通路結(jié)果

使用蛋白免疫印跡分析4對頸動脈粥樣斑塊(n=4)和斑塊旁組織(n=4)，結(jié)果顯在斑塊組織中LYN,SYK和PTPN6的蛋白表達(dá)水平顯著增加：LYN(2.2±0.3)、SYK(26.3±5.3)和PTPN6(1.8±0.2)，與基因芯片檢測趨勢相符。但是VAV1在蛋白印跡條帶上并未檢測出來。

3 討論

本研究運用基因芯片技術(shù)對頸動脈斑塊組織和斑塊旁組織進(jìn)行分析，芯片分析結(jié)果顯示有816個差異表達(dá)基因，其中上調(diào)基因443個，下調(diào)基因373個，上述差異基因可能參與與斑塊的發(fā)生、發(fā)展。生物信息學(xué)分析結(jié)果：動脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展可能與免疫應(yīng)答、炎癥、NK細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用和FcεRI信號通路等有關(guān)。而進(jìn)一步的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)與風(fēng)險模塊聯(lián)合分析提示：VAV1,SYK,LYN和PTPN6可能在動脈粥樣斑塊進(jìn)展中發(fā)揮著重要作用。

前期已有一些研究表明SYK和VAV1在動脈粥樣斑塊過程中發(fā)揮重要作用。SYK通過激活單核細(xì)胞趨化蛋白-1參與動脈粥樣硬化進(jìn)展[17]。SYK抑制劑BAY61-3606可以顯著抑制血管平滑肌細(xì)胞的病理增值和遷移，提示SYK可能是動脈粥樣硬化的潛在治療靶點[18]。Choi等[19]發(fā)現(xiàn)TLR4/SYK介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞應(yīng)答促進(jìn)動脈粥樣斑塊中慢性炎癥的發(fā)生發(fā)展。體外實驗顯示在血管平滑肌細(xì)胞中激活的SYK通過釋放IL-1β促進(jìn)動脈粥樣斑塊中炎癥的進(jìn)展和微鈣化形成[20]。另一項研究也顯示，SYK抑制劑fostamatinib可以削弱小鼠體內(nèi)斑塊的進(jìn)展，提示SYK可能是動脈粥樣硬化進(jìn)展的潛在抗炎治療靶點[21]。

VAV1僅表達(dá)于血液細(xì)胞，作為鳥嘌呤核苷酸交換因子參與RAC1和Rho GTP酶的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。VAV1參與的生物學(xué)過程與動脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，如NADPH氧化酶介導(dǎo)活性氧產(chǎn)生、細(xì)胞死亡和白細(xì)胞激活[22]。Rahaman等[23]發(fā)現(xiàn)在輔以高脂飲食條件下，apoE-/-/vav1-/-小鼠較apoE-/-小鼠主動脈血管動脈粥樣斑塊面積顯著減少，免疫組化結(jié)果提示apoE-/-/vav1-/-小鼠較apoE-/-小鼠斑塊組織中巨噬細(xì)胞和皂泡細(xì)胞數(shù)量減少，提示Vav1與動脈粥樣斑塊發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。敲除Vav1基因只是適度抑制氧化低密度脂蛋白的吸收和皂泡細(xì)胞的形成，同時敲除Vav1和Vav3基本完全抑制該病理過程，Vav家族在動脈粥樣斑塊形成中可能發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，作為新型潛在治療靶點值得期待[24]。在我們此次研究中，VAV1在頸動脈粥樣斑塊組織中的免疫印跡實驗中未能檢測到，更換VAV1抗體后仍未能檢測到，雖然在基因芯片和qPCR中可以檢測到其mRNA的表達(dá)，考慮VAV1在蛋白翻譯層面可能被阻斷，從而表達(dá)量過低引起無法檢測到相關(guān)數(shù)值。

LYN編碼酪氨酸蛋白激酶參與肥大細(xì)胞脫顆粒。LYN屬于Src家族激酶，參與調(diào)節(jié)糖蛋白Ⅵ信號，其缺失會導(dǎo)致血小板激活延遲和凝聚障礙[25]。體外實驗證實，在巨噬細(xì)胞中oxLDL通過激活Lyn從而促使CD36募集并激活Na+/K+-ATPase-Lyn復(fù)合物，促使巨噬細(xì)胞攝入oxLDL和皂泡細(xì)胞形成[26]。Miki等[27]研究揭示Lyn在血脂代謝中發(fā)揮重要作用，通過誘導(dǎo)單核細(xì)胞趨化蛋白1表達(dá)可能參與動脈粥樣硬化斑塊的發(fā)生、發(fā)展。我們此次研究發(fā)現(xiàn)LYN在動脈粥樣硬化斑塊組織中mRNA和蛋白水平都是增加的，提示LYN可能促進(jìn)動脈粥樣斑塊的發(fā)生、發(fā)展。

注：A、B：節(jié)點代表基因編碼的蛋白，節(jié)點間的邊代表蛋白間的互作關(guān)系，紅色節(jié)點代表上調(diào)差異基因編碼的蛋白，藍(lán)色節(jié)點代表下調(diào)差異基因編碼的蛋白，粉色節(jié)點代表非差異基因編碼的蛋白，但是與差異基因編碼蛋白之間存在直接互作關(guān)系。B：在上述蛋白互作構(gòu)建的網(wǎng)絡(luò)中通過CFinder軟件發(fā)現(xiàn)的疾病風(fēng)險模塊

圖2差異表達(dá)基因蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和疾病相關(guān)風(fēng)險模塊聯(lián)合分析

注：ATH:頸動脈粥樣硬化斑塊；MIT:斑塊旁組織；A：通過qRT-PCR在8對頸動脈粥樣斑塊和斑塊旁組織中驗證VAV1、LYN、SYK和PTPN6表達(dá)情況，**與MIT比較P<0.01；B：在4對頸動脈斑塊組織和斑塊旁組織中蛋白的表達(dá)情況，并使用ImageJ軟件進(jìn)行灰度值分析

圖3通過手術(shù)標(biāo)本驗證基因芯片分析的4個差異表達(dá)基因

PTPN6是蛋白酪氨酸磷酸酶家族成員，作為信號分子參與調(diào)控細(xì)胞生長、分化、細(xì)胞周期和腫瘤轉(zhuǎn)化[28]。PTPN6除參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展外，還參與氣道炎癥反應(yīng)和血糖穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)[29-30]。本研究顯示PTPN6在動脈粥樣斑塊組織mRNA和蛋白水平都是表達(dá)增加的，首次表明PTPN6可能參與動脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展，其功能研究將是我們后續(xù)研究的重點。

綜上所述，本次研究通過系統(tǒng)生物信息學(xué)方法研究動脈粥樣硬化斑塊發(fā)生、發(fā)展過程中基因的表達(dá)變化，對全面、綜合、系統(tǒng)化的認(rèn)識動脈粥樣硬化斑塊發(fā)生、發(fā)展奠定一定的基礎(chǔ)，為頸動脈斑塊發(fā)生機(jī)制研究提供了一些新的方向和思路。本次研究發(fā)現(xiàn)了VAV1,SYK,LYN和PTPN6可能與動脈粥樣硬化斑塊形成相關(guān)，并實驗驗證了上述基因的表達(dá)變化，而PTPN6可能是參與動脈粥樣硬化斑塊發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵基因，其功能研究有待進(jìn)一步分析。