王 嘯，明 丹，王維展，王 璞，李 娜，何佳起

隨著農(nóng)藥的普及，近年來農(nóng)藥中毒的事件逐年遞增[1]。現(xiàn)階段常見的農(nóng)藥包括礦物源農(nóng)藥、生物源農(nóng)藥和化學(xué)合成農(nóng)藥(敵敵畏、百草枯等)[2]。敵敵畏是一種較為常見的有機磷農(nóng)藥，這類農(nóng)藥可抑制乙酰膽堿酯酶，造成延遲周圍神經(jīng)病變[3]。百草枯中毒后會直接作用于中毒者的器官，造成肺、心、肝、腎功能衰竭導(dǎo)致患者死亡[4]。烏司他丁(utinastatin， UTI)是抗炎藥物之一，其作用機制是通過下調(diào)促炎因子和上調(diào)抗炎因子，同時調(diào)控或阻斷機體炎癥反應(yīng)過程實現(xiàn)對炎癥的抑制[5]。UTI是一種高效的酶抑制劑，可抑制多種蛋白酶，具有防御組織破壞的作用。目前已有研究證實UTI可減輕急性百草枯和敵敵畏中毒，但對于UTI對農(nóng)藥中毒大鼠腦組織保護作用機制的報道較少。本文旨在研究UTI對農(nóng)藥中毒大鼠腦組織保護作用，以期了解其作用機制，從而為農(nóng)藥中毒提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1實驗動物：SPF級3周齡SD大鼠60只，體重200～220 g(廣東醫(yī)學(xué)院實驗動物中心，實驗動物許可證號：粵監(jiān)證字 2004A029號)。飼養(yǎng)于本院動物中心實驗室，分12籠飼養(yǎng)，每籠5只。飼養(yǎng)溫度20～25℃，相對濕度50%～65%。該實驗經(jīng)動物倫理委員會批準(zhǔn)同意。

1.1.2藥物與試劑：農(nóng)藥(草銨膦)購自四季豐園有限公司；谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)、丙二醛(malondialdehyde ,MDA)試劑盒購自上海恒遠生物科技有限公司；腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、白介素-6 (interleukin-6, IL-6)試劑盒購自南京森貝伽生物科技有限公司；乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase, AChE)試劑盒購自上海索橋生物有限公司；NMDA受體試劑盒購自江萊生物；超氧化物歧化酶1(superoxide dismutase 1, SOD1)抗體購自艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司；PTEN誘導(dǎo)激酶1(PTEN-inducible kinase 1, Pink1)抗體購自艾美捷科技有限公司；過氧化物還原酶6(peroxide reductase 6, Prdx6)抗體購自上海龍?zhí)锷锛夹g(shù)有限公司；中性福爾馬林、乙醇、二甲苯均購自天津科密歐有限公司。

1.1.3實驗儀器：BS-124s 型電子天平(北京賽多斯儀器系統(tǒng)有限公司)；TDL-5 型臺式離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠)；光學(xué)顯微鏡(東莞市同創(chuàng)儀器有限公司)；低溫離心機(湖南恒諾離心機有限公司)；蛋白電泳及轉(zhuǎn)膜儀(美國Bio-Rad公司)；凝膠成像系統(tǒng)(以色列DNR公司)；BS-124s 型電子天平(北京賽多斯儀器系統(tǒng)有限公司)。

1.2方法

1.2.1實驗分組及建立模型：60只SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng) 1 周后，隨機分為對照組、模型組、低劑量組、高劑量組，每組15只。對照組大鼠腹腔注射生理鹽水2 ml，其余3組大鼠均給予腹腔注射農(nóng)藥2 ml造模，造模后立即觀察大鼠一般狀態(tài)及癥狀并記錄。

1.2.2藥物干預(yù)：建立模型后2 h，低劑量組腹腔內(nèi)注射UTI 75 kU/kg，高劑量組腹腔內(nèi)注射UTI 150 kU/kg，對照組和模型組分別腹腔內(nèi)注射和高劑量組等量的生理鹽水。

1.3觀察指標(biāo)及方法

1.3.1大鼠一般情況觀察：建立模型并使用藥物干預(yù)完成后立即觀察大鼠一般狀態(tài)及癥狀并記錄。當(dāng)大鼠出現(xiàn)全身顫動、口腔分泌物增多、步態(tài)不穩(wěn)中的任意一項即判定為中毒。大鼠肌顫強度分為4級，具體分級方式參考戴旭鋒等[6]研究。

1.3.2血清中氧化應(yīng)激物質(zhì)及炎性因子檢測：建立模型并使用藥物干預(yù)完成后24 h，使用10%水合氯醛350 mg/kg麻醉大鼠，腹主動脈取血分離血清，保存在-20℃條件下待測，按照試劑盒說明書檢測MDA、GSH-Px、TNF-α、IL-6含量。

1.3.3腦組織及全血AChE活力及NMDA受體活性檢測：建立模型并使用藥物干預(yù)完成后24 h，處死大鼠，取大鼠腦組織使用冰生理鹽水沖洗，按照1∶9制成10%的組織勻漿，使用恒溫離心機，在4℃、3500 r/min離心的條件下離心10 min，去上清液，在-20℃凍存待測，測定大鼠全血和腦組織的AChE活力及NMDA受體的活性，使用Scatchard作圖并求出NMDA受體的最大結(jié)合容量(Bmax)和平衡解離常數(shù)(Kd)。

1.3.4Western blot 檢測蛋白表達水平：取各組大鼠海馬區(qū)腦組織并用剪刀剪取小塊，使用胰蛋白酶處理，提取組織總蛋白，使用半干法將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜，置于5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后加入各需要檢測蛋白的一抗，二抗，孵育2 h，TBS洗凈，以β-actin為內(nèi)參蛋白，采用顯色液顯色后行吸光度分析，計算各蛋白相對表達量。

2 結(jié)果

2.1大鼠血清中炎性因子水平 與對照組比較，模型組大鼠血清中TNF-α及IL-6水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與模型組比較，高劑量組和低劑量組大鼠血清中TNF-α及IL-6含量水平顯著降低，且高劑量組低于低劑量組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見圖1。

圖1 4組大鼠血清中炎性因子水平比較

低劑量組為UTI 75 kU/kg，高劑量組為UTI 150 kU/kg；UTI為烏司他丁，TNF-α為腫瘤壞死因子-α，IL-6為白介素-6；與對照組比較，bP<0.01；與模型組比較，dP<0.01；與低劑量組比較，fP<0.01

2.2大鼠血清中MDA、GSH-Px水平比較 與對照組比較，模型組大鼠血清中MDA含量水平顯著升高，GSH-Px含量水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與模型組相比，高劑量組和低劑量組大鼠MDA含量水平顯著降低，GSH-Px水平顯著升高，且高劑量組上述指標(biāo)變化更顯著，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見圖2。

圖2 4組大鼠血清中MDA、GSH-Px水平比較

低劑量組為UTI 75 kU/kg，高劑量組為UTI 150 kU/kg；UTI為烏司他丁，MDA為丙二醛，GSH-Px為谷胱甘肽過氧化物酶；與對照組比較，bP<0.01；與模型組比較，dP<0.01；與低劑量組比較，fP<0.01

2.3大鼠腦組織、全血AChE活力及腦組織NMDA受體活性比較 與對照組比較，模型組大鼠全血AChE活力、腦組織AChE活力、NMDA受體Bmax值顯著降低，NMDA受體Kd值顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與模型組比較，低劑量組和高劑量組大鼠全血AChE活力、腦組織AChE活力、NMDA受體Bmax值顯著升高，且高劑量組上述指標(biāo)變化更顯著，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見圖3。

圖3 4組大鼠腦組織及全血AChE活力及腦組織NMDA受體活性比較

低劑量組為UTI 75 kU/kg，高劑量組為UTI 150 kU/kg；AChE為乙酰膽堿酯酶，Bmax為最大結(jié)合容量，Kd為平衡解離常數(shù)，UTI為烏司他丁；與對照組比較，bP<0.01；與模型組比較，dP<0.01；與低劑量組比較，fP<0.01

2.4大鼠腦海馬區(qū)SOD1、Pink1及Prdx6表達水平比較 與對照組比較，模型組大鼠海馬區(qū)SOD1、Pink1及Prdx6蛋白表達顯著降低(P<0.01)。與模型組相比，UTI低劑量組和高劑量組大鼠海馬區(qū)SOD1、Pink1及Prdx6蛋白表達顯著升高，且高劑量組高于低劑量組(P<0.01)。見圖4。

3 討論

有機磷農(nóng)藥中毒患者的死亡原因包括膽堿酯酶活性降低和炎癥反應(yīng)。炎性因子包括促炎性因子和抗炎癥因子，促炎性因子水平升高，體內(nèi)炎性因子水平降低，表明體內(nèi)炎癥反應(yīng)加??；抗炎性因子升高，體內(nèi)炎性因子受到抑制，則炎癥反應(yīng)減弱[7-8]。目前研究較多的促炎性細胞因子包括TNF-α、IL-1、IL-6 和IL-8 等[9]；抗炎性細胞因子則包括IL-4、IL-10、IL-1等[10]。本研究主要探究了IL-6和TNF-α兩種炎性因子，發(fā)現(xiàn)UTI低劑量組和高劑量組大鼠血清中TNF-α及IL-6含量水平顯著降低，且高劑量組降低更顯著，說明UTI可顯著降低大鼠農(nóng)藥中毒后體內(nèi)炎癥反應(yīng)，且隨著劑量增加效果更顯著。這可能是因為UTI可抑制水解蛋白酶，下調(diào)組織細胞的損傷實現(xiàn)降低TNF-α水平；同時UTI可以抑制中性粒細胞彈性蛋白酶的釋放，實現(xiàn)抑制 TNF-α及IL-6的釋放，達到降低炎癥反應(yīng)的效果。與周慧[11]的報道一致。

圖4 4組大鼠腦海馬區(qū)SOD1、Pink1、Prdx6蛋白表達水平比較

A.SOD1、Pink1、Prdx6蛋白免疫印跡檢測結(jié)果；B.SOD1、Pink1、Prdx6蛋白表達水平比較；低劑量組為UTI 75 kU/kg，高劑量組為UTI 150 kU/kg；SOD1為超氧化物歧化酶1，Pink1為PTEN誘導(dǎo)激酶1，Prdx6為過氧化物還原酶6，UTI為烏司他??；與對照組比較，bP<0.01；與模型組比較，dP<0.01；與低劑量組比較，fP<0.01

研究證實氧自由基的含量在有機磷農(nóng)藥中毒患者的死亡中作用關(guān)鍵。雷間紅[12]研究表明，農(nóng)藥中毒者體內(nèi)過氧化反應(yīng)顯著增強。MDA 會引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，產(chǎn)生的系列降解產(chǎn)物可引起細胞代謝及功能障礙，同時MDA的含量可以反映機體受自由基攻擊后脂質(zhì)過氧化及細胞損傷的程度[13]。細胞內(nèi)氧化程度越高，MDA含量越高。GSH-Px是一種抗氧化保護酶，抗氧化保護酶可清除 H2O2，緩解氧自由基對組織細胞的損傷。當(dāng)GSH-Px含量水平過低時，清除H2O2能力減弱，體內(nèi)氧化反應(yīng)加重。賈書花等[14]報道，SOD、GSH-Px 兩者共同作用能有效地阻止組織細胞過氧化的損傷。SOD1是經(jīng)典的抗氧化酶之一，可有效清除活性氧[12]。機體內(nèi)SOD1水平越高說明機體清除活性氧的能力越強，當(dāng)腦組織損傷時期含量會顯著降低。Pink1也是抗氧化蛋白，Pink1丟失與神經(jīng)元的易損性增加有關(guān)[13]。中毒后Pink1水平降低，表明大鼠腦組織中神經(jīng)元受到損傷，且受損程度與Pink1水平呈負相關(guān)。Prdx6是一種獨特的抗氧化酶，具有過氧化物酶和磷脂酶活性，當(dāng)大鼠有機磷農(nóng)藥中毒后，其活性會受到顯著的抑制[14]。

本研究結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組大鼠體內(nèi)MDA水平顯著升高、GSH-Px水平顯著降低，表明大鼠體內(nèi)氧化反應(yīng)顯著加重。UTI低劑量組和高劑量組大鼠MDA水平顯著降低、GSH-Px水平顯著升高，且高劑量組上述指標(biāo)優(yōu)于低劑量組。說明UTI顯著抑制了大鼠體內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，且隨著使用劑量的增加，效果更為顯著。謝勇[15]報道，使用UTI可以降低患者體內(nèi)氧化反應(yīng)及炎癥反應(yīng)，緩解中毒癥狀，與本研究得出的結(jié)論相一致。本研究中發(fā)現(xiàn)使用UTI的各組大鼠海馬區(qū)SOD1、Pink1及Prdx6蛋白表達顯著升高，說明大鼠神經(jīng)元受到了保護，腦組織神經(jīng)元得到了顯著的保護，與李艷華[16]研究結(jié)論一致。

目前AChE活力及腦組織NMDA受體活性也是評價農(nóng)藥中毒程度的重要指標(biāo)。劉佩強等[17]研究表明NMDA受體與調(diào)節(jié)呼吸功能的有關(guān)，當(dāng)AChE活力下降會抑制呼吸功能導(dǎo)致患者死亡。本研究發(fā)現(xiàn)，使用UTI治療后大鼠體內(nèi)的AChE活力顯著升高，說明大鼠的呼吸抑制程度得到了顯著的緩解。大鼠腦組織NMDA受體的活性有兩個重要指標(biāo)，Bmax和Kd，其中Bmax下降，Kd值上升意味著腦組織NMDA受體密度的減少和親和力的下降。使用UTI低劑量和高劑量組大鼠Bmax下降和Kd值上升受到了抑制，說明UTI可增加NMDA受體密度，同時升高NMDA受體的親和力，從而實現(xiàn)保護中毒后大鼠的腦組織。與張虎等[18]報道的UTI可保護中毒后大腦組織結(jié)論相一致。

綜上所述，大鼠農(nóng)藥中毒后UTI 可保護其腦組織，且在一定濃度范圍內(nèi)呈濃度依賴性，作用機制可能與抑制腦組織和全身炎癥反應(yīng)及氧化反應(yīng)相關(guān)。目前農(nóng)藥種類較多，本實驗使用的農(nóng)藥相對單一，在后續(xù)實驗中將使用不同種類的農(nóng)藥，進一步探討UTI對不同農(nóng)藥中毒中保護大鼠腦組織效果。