国产日韩欧美一区二区三区三州_亚洲少妇熟女av_久久久久亚洲av国产精品_波多野结衣网站一区二区_亚洲欧美色片在线91_国产亚洲精品精品国产优播av_日本一区二区三区波多野结衣 _久久国产av不卡

?

不同水深地雷爆炸對(duì)脊髓損傷特點(diǎn)及機(jī)制研究

2020-02-27 02:45張成生張志龍韓庚奮
解放軍醫(yī)藥雜志 2020年2期
關(guān)鍵詞:大白兔淺水深水

張成生,張志龍,馬 驍,王 鵬,劉 成,韓庚奮

淺灘登陸作戰(zhàn)遭遇地雷爆炸時(shí)因水下沖擊波會(huì)造成嚴(yán)重?fù)p傷,水下沖擊波的傳播特點(diǎn)是峰值超壓較高、正壓持續(xù)時(shí)間較短[1]。水下沖擊波強(qiáng)度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于空氣中,且傳播速度快、能量損耗少,致死范圍較大[2]。同質(zhì)量同距離的地面爆炸與水下爆炸相比,峰值壓力可相差200倍左右[3]。淺灘地雷爆炸的損傷特點(diǎn)和機(jī)制可能與陸地不同;沖擊波傳導(dǎo)的機(jī)制及強(qiáng)度可能因水深的不同而不同。既往研究表明,淺灘區(qū)觸雷爆炸肢體局部軟組織損傷較陸地輕,但是骨骼損傷較陸地觸雷爆炸明顯嚴(yán)重[4]。水下地雷爆炸的沖擊波除引起局部損傷,還會(huì)引起遠(yuǎn)處臟器或組織的損傷,由于沖擊波在氣體-液體界面產(chǎn)生剪力波,導(dǎo)致附近組織及臟器嚴(yán)重?fù)p傷,由于椎管和脊髓密度差別較大,可因剪力波及瞬間加速度而損傷脊髓。因此,研究淺灘區(qū)肢體觸雷爆炸造成的脊髓損傷特點(diǎn)及機(jī)制,為兩棲登陸作戰(zhàn)觸雷爆炸傷的救治和防護(hù)提供依據(jù)十分必要。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 新西蘭大白兔64只,由中國(guó)人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)附屬大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用批準(zhǔn)證書:SYXK(渝2017-0005)。使用品紅溶液于兔耳內(nèi)外側(cè)直接標(biāo)號(hào)進(jìn)行編號(hào),隨機(jī)分為對(duì)照組、陸地組、淺水組、深水組,每組16只。淺水組水深至新西蘭大白兔膝關(guān)節(jié);深水組水深至新西蘭大白兔第3腰椎(L3)。

1.2動(dòng)物致傷及標(biāo)本取材

1.2.1動(dòng)物致傷:所有新西蘭大白兔通過(guò)耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉30 mg/kg進(jìn)行麻醉,麻醉平穩(wěn)后將其固定于塔形金屬支架,支架與水平面成約75°角,將新西蘭大白兔俯臥位置于支架一側(cè),使其成半直立狀態(tài),右后肢著地,左后肢呈屈曲狀態(tài)。將600 mg 三硝基甲苯(TNT)防水處理后,置于新西蘭大白兔右后肢,然后電引爆。致傷后立刻給予止血、包扎。觀察時(shí)間為12 h。

1.2.2標(biāo)本取材:傷后3、6、12 h分別抽4組大白兔取動(dòng)脈血3 ml,血液在1500 g離心力下離心10 min,提取上清,超低溫冰箱保存。傷后12 h沿新西蘭大白兔腰背部切一縱形切口,分離肌肉,咬骨鉗咬除棘突及兩側(cè)椎弓根,充分暴露椎管,取L3~4脊髓,部分用于Western Blot 檢測(cè),置于凍存管,立刻放于液氮罐中保存;部分使用4%多聚甲醛固定,用于病理學(xué)檢查。

1.3病理切片制作及染色步驟 將固定好的標(biāo)本用蒸餾水稍洗后,脫水,透明,石蠟包埋,切片機(jī)切為厚度4 μm。蘇木精染色3 min, 0.6%鹽酸乙醇分化30 s,1%醇溶性伊紅染色2 min,之后使用濃度為80%、95%、100%乙醇各浸泡2次,每次浸泡2 min。使用二甲苯透明,中型樹膠封片。

1.4脊髓膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrilary acidic protein, GFAP)蛋白含量 采用Western Blot進(jìn)行檢測(cè):將脊髓樣品放在研缽中研磨后分裝在離心管中。將酶蛋白抑制劑混合物與組織蛋白抽提試劑按照1∶99混合,每個(gè)樣品中加入250 μl,在沸水中煮10 min,1200 r/min,4℃離心5 min。取上清,分裝于0.5 ml的離心管中,將玻璃板先后用洗滌劑、無(wú)水乙醇清洗,待干燥后固定于垂直電泳槽上,用0.8%瓊脂糖密封玻璃板邊緣;配制分離膠,灌膠。加入足夠的電泳液后,上樣,每泳道加入50 μg的總蛋白。電泳完畢后,剝膠,留取具有目的蛋白的分離膠,用于轉(zhuǎn)膜,轉(zhuǎn)膜條件為250 mA,2 h。之后使用脫脂奶粉封閉,37℃搖床上搖動(dòng)封閉1 h;PVDF膜漂洗后,一張加入多克隆山羊抗兔GFAP抗體溶液(稀釋濃度為1∶1000);另一張加入GAPDH抗體溶液(稀釋濃度為1∶2000),4℃冰箱中孵育過(guò)夜。棄去一抗溶液,分別浸入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠抗體(稀釋濃度1∶10 000)溶液中,在37℃恒溫振蕩器中孵育2 h。之后,棄去抗體溶液,使用PBST溶液脫色搖床洗膜5次,每次5 min。顯色后使用Quantity one 4.6.2軟件進(jìn)行蛋白條帶灰度分析。

1.5中樞神經(jīng)損傷標(biāo)志物檢測(cè) 采用蛋白免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)神經(jīng)元特異性烯醇酶(neuron-specific enolase, NSE)和髓磷脂堿性蛋白質(zhì)類(myelin basic protein, MBP):配制標(biāo)準(zhǔn)品液,在酶標(biāo)包被板上加入稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品或兔動(dòng)脈血清100 μl,將反應(yīng)板充分混勻后置于37℃溫育20 min;洗滌;每孔加入蒸餾水和第一抗體工作液各50 μl,空白孔除外。將反應(yīng)板充分混勻后置于37℃溫育40 min;棄去液體,洗滌;每孔加酶標(biāo)抗體工作液100 μl,將反應(yīng)板置于37℃ 15 min。棄去液體,甩干,洗滌。每孔加入底物工作液100 μl,置于37℃暗處顯色15 min。取出酶標(biāo)板,每孔加入100 μl終止液,充分混合均勻;在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)量每個(gè)孔的吸光度值。同法檢測(cè)MBP。

1.6生物力學(xué)測(cè)試 取陸地組、淺水組、深水組新西蘭大白兔共48只,將壓力傳感器布放于其的L3椎管內(nèi),加速度傳感器固定于L3橫突。測(cè)試L3椎管內(nèi)沖擊波壓力峰值和加速度峰值。使用TST6150采集儀采集信號(hào),DAP6.01軟件分析。

2 結(jié)果

2.1兔脊髓損傷大體形態(tài)變化 地雷爆炸后陸地組脊髓未發(fā)現(xiàn)異常,見(jiàn)圖1A。淺水組蛛網(wǎng)膜下腔出血發(fā)生率為43.75%(7/16),見(jiàn)圖1B。神經(jīng)根周圍點(diǎn)狀出血發(fā)生率為12.50%(2/16),見(jiàn)圖1C。深水組脊髓挫傷發(fā)生率為37.50%(6/16),損傷均發(fā)生在水平面附近的脊髓,見(jiàn)圖1D;神經(jīng)根周圍點(diǎn)狀出血發(fā)生率為62.50%(10/16),蛛網(wǎng)膜下腔出血發(fā)生率為25.00%(4/16),見(jiàn)圖1E。

圖1 各致傷組新西蘭大白兔脊髓損傷的大體形態(tài)觀察

A.陸地組脊髓無(wú)異常;B.淺水組蛛網(wǎng)膜下腔出血;C.淺水組神經(jīng)根周圍的點(diǎn)狀出血;D.深水組脊髓胸段的挫傷;E.深水組蛛網(wǎng)膜下腔出血

2.2兔脊髓病理形態(tài)變化 對(duì)照組脊髓未見(jiàn)異常;陸地組脊髓神經(jīng)元細(xì)胞水腫變性,核仁不清;淺水組可見(jiàn)神經(jīng)元細(xì)胞水腫變性、及紅細(xì)胞滲出;深水組可見(jiàn)神經(jīng)元細(xì)胞水腫變性及大量紅細(xì)胞滲出。見(jiàn)圖2。

圖2 各組新西蘭大白兔脊髓病理變化(HE×400)

A.對(duì)照組;B.陸地組;C.淺水組;D.深水組

2.3兔脊髓及腦皮質(zhì)GFAP蛋白含量比較 淺水組、深水組脊髓及腦皮質(zhì)GFAP蛋白表達(dá)水平高于對(duì)照組及陸地組(P<0.05);淺水組與深水組、陸地組與假致傷組間兩兩比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖3和表1。

圖3 各組新西蘭大白兔脊髓及腦皮質(zhì)GFAP蛋白含量

GFAP為膠質(zhì)纖維酸性蛋白,GAPDH為甘油醛-3-磷酸脫氫酶

2.5高速攝像下爆破情景 陸地組起爆后1 ms可見(jiàn)巨大的火球向四周擴(kuò)散。淺水組并未形成起泡,而是在起爆后2 ms爆炸氣體直接沖出水平面,形成水柱。深水組起爆后3 ms形成一氣泡,氣泡快速擴(kuò)大,并產(chǎn)生沖擊波損傷肢體,氣泡快速上升,56 ms后沖出水面。見(jiàn)圖4。

表1 4組新西蘭大白兔致傷后兔脊髓GFAP蛋白印跡灰度變化

注:GFAP為膠質(zhì)纖維酸性蛋白,GAPDH為甘油醛-3-磷酸脫氫酶;與對(duì)照組比較,aP<0.05;與陸地組比較,cP<0.05

2.4中樞神經(jīng)損傷標(biāo)記物表達(dá)水平比較

2.4.1NSE水平比較: 4組傷前及對(duì)照組傷前和傷后3、6、12 h的NSE水平比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),陸地組、淺水組、深水組傷后3、6、12 h的NSE水平均高于傷前(P<0.05)。傷后3 h淺水組和深水組NSE水平高于對(duì)照組和陸地組(P<0.05)。陸地組和對(duì)照組NSE水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。傷后6、12 h陸地組、淺水組、深水組NSE水平均高于對(duì)照組,且深水組高于淺水組和陸地組,淺水組高于陸地組(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 4組新西蘭大白兔動(dòng)脈血清NSE表達(dá)水平

注:NSE為神經(jīng)元特異性烯醇化酶;與傷前比較,aP<0.05;與對(duì)照組比較,cP<0.05;與陸地組比較,eP<0.05;與淺水組比較,gP<0.05

2.4.2MBP水平比較:4組傷前MBP水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。對(duì)照組傷前和傷后3、6、12 h的MBP水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。陸地組、淺水組、深水組傷后3、6、12 h的MBP水平均高于傷前(P<0.05)。陸地組、淺水組、深水組傷后3、6、12 h的MBP水平均高于對(duì)照組,且深水組高于淺水組和陸地組(P<0.05)。淺水組和陸地組傷后3、6、12 h 的MBP 水平比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3。

表3 4組新西蘭大白兔動(dòng)脈血清 MPB表達(dá)水平比較

注:MBP為髓鞘堿性蛋白;與傷前比較,aP<0.05;與對(duì)照組比較;cP<0.05;與陸地組比較,eP<0.05;與淺水組比較,gP<0.05

圖4 高速攝像下爆破情景

A.陸地組起爆后1 ms;B.淺水組起爆后2 ms;C.深水組起爆后20 ms

2.6生物力學(xué)檢測(cè)比較 深水組椎管內(nèi)壓力峰值均高于淺水組及陸地組(P<0.05),淺水組椎管內(nèi)壓力峰值與陸地組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。深水組的椎體加速度峰值均高于淺水組及陸地組,且淺水組椎體加速度高于陸地組(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 3組新西蘭大白兔生物力學(xué)測(cè)試結(jié)果比較

注:與陸地組比較,aP<0.05,與淺水組比較,cP<0.05

3 討論

爆炸傷多由于臟器傷情嚴(yán)重而掩蓋了脊髓損傷的表現(xiàn)。脊髓爆震傷是爆炸后脊髓損傷的主要類型,其損傷從細(xì)胞水平觀察主要表現(xiàn)為細(xì)胞凋亡[5]。爆炸沖擊波可導(dǎo)致脊髓硬膜外出血,如不能早期發(fā)現(xiàn)快速治療,易發(fā)生較高的致殘率和病死率[6]。如果能早期判斷傷情特點(diǎn),及時(shí)分類后送,在盡可能短的時(shí)間內(nèi)積極治療,對(duì)于傷員后期的功能恢復(fù)具有重要的意義。

本研究結(jié)果顯示,淺水組蛛網(wǎng)膜下腔出血發(fā)生率高于深水組;深水組出現(xiàn)脊髓的挫傷,且挫傷多發(fā)生與氣-液平面,但淺水組卻未見(jiàn)此種損傷特點(diǎn)。陸地組肉眼觀察未見(jiàn)異常,這證明淺水組和深水組脊髓損傷較陸地嚴(yán)重,且淺水組和深水組的損傷特點(diǎn)不同。深水組地雷爆炸,由于水的密度較大且不可壓縮,沖擊波損耗較小,強(qiáng)度較大,較陸地有更嚴(yán)重的破壞效應(yīng),所以損傷較淺水組及陸地組嚴(yán)重。生物力學(xué)測(cè)試結(jié)果表明,深水組椎管內(nèi)壓力峰值和加速度峰值均高于淺水組及陸地組,與上述傷情相一致。深水組出現(xiàn)脊髓的挫傷,且挫傷多發(fā)生在氣-液平面,但淺水組卻未發(fā)現(xiàn)。筆者認(rèn)為主要原因是水與空氣密度不同,在交界面發(fā)生剪力所致?lián)p傷。淺水組脊髓損傷主要表現(xiàn)為蛛網(wǎng)膜下腔出血及神經(jīng)根周圍的點(diǎn)狀出血。二者損傷特點(diǎn)不同,與爆炸損傷的機(jī)制不同相關(guān),高速攝像提示深水組起爆后3 ms形成氣泡,氣泡快速擴(kuò)大,并快速上升,56 ms后沖出水面;而淺水組并未形成起泡,而是在起爆后2 ms爆炸氣體直接沖出水平面,形成水柱,這充分說(shuō)明不同水深的爆炸損傷機(jī)制不同。 此外,生物力學(xué)測(cè)試表明,淺水組椎管內(nèi)壓力峰值與陸地組無(wú)明顯差別,而加速度峰值明顯高于陸地組,說(shuō)明淺水爆炸的脊髓損傷主要因瞬間加速度所致,這可能與水柱的產(chǎn)生有關(guān)。

沖擊波可損傷脊髓內(nèi)血管而造成脊髓出血、缺血性損傷,脊髓損傷主要是白質(zhì)結(jié)構(gòu)的異常、水腫及脫髓鞘改變,以及神經(jīng)元細(xì)胞核濃聚、偏位甚至破裂[7]。高壓空氣沖擊波在脊髓實(shí)質(zhì)內(nèi)產(chǎn)生拉伸、壓縮和剪切力,從而導(dǎo)致廣泛的軸索損傷,主要表現(xiàn)出三種不同的病理形式:微管斷裂、神經(jīng)絲致密化和鈣蛋白酶介導(dǎo)的血影蛋白破壞[8]。郭大興等[9]研究表明沖擊波超壓峰值為3 MPa時(shí)脊髓病理可見(jiàn)大量散在的出血壞死灶,可造成大鼠雙后肢運(yùn)動(dòng)誘發(fā)電位潛伏期延長(zhǎng)或波幅下降。本研究中光鏡下觀察陸地組脊髓神經(jīng)元細(xì)胞僅見(jiàn)水腫變性,核仁不清。淺水組可見(jiàn)前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元細(xì)胞水腫變性,及紅細(xì)胞滲出。深水組可見(jiàn)脊髓前角大量紅細(xì)胞滲出。病理學(xué)檢查證明淺水區(qū)地雷爆炸后脊髓的嚴(yán)重?fù)p傷。脊髓損傷由于軸突和神經(jīng)細(xì)胞的變性、凋亡,而失去感覺(jué)、運(yùn)動(dòng)和自主功能。脊髓受沖擊傷后自由基產(chǎn)生增多,如脊髓內(nèi)丙二醛,白介素-1β(IL-1β)、IL-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α等,這些物質(zhì)使脊髓細(xì)胞壞死凋亡進(jìn)一步發(fā)展[10],誘導(dǎo)一系列生化反應(yīng)引起脫髓鞘改變。軸突的變性和周圍的免疫反應(yīng)被稱之為“二次損傷”。脊髓的二次損傷會(huì)進(jìn)一步影響突觸重塑及神經(jīng)環(huán)路再生,成為脊髓損傷修復(fù)的主要障礙之一[11],如及時(shí)治療可能會(huì)減輕“二次損傷”。脊髓損傷后常使用甲基強(qiáng)的松龍抑制炎癥反應(yīng),以減少對(duì)脊髓的二次損害[12]。靜脈注射甲強(qiáng)龍能夠有效緩解脊髓損傷急性神經(jīng)痛,阻止急性神經(jīng)痛轉(zhuǎn)變?yōu)殡y治性慢性神經(jīng)痛,能夠顯著改善患者的生活質(zhì)量[13]。因此,在后送和治療中必須給予高度關(guān)注,力爭(zhēng)做到早診斷,早治療。

本研究結(jié)果顯示,致傷后淺水組及深水組GFAP、NSE、MBP表達(dá)水平較陸地組明顯增高,與顯微組織形態(tài)觀察結(jié)果相一致。證明不同水深的地雷爆炸脊髓損傷均較陸地地雷爆炸嚴(yán)重。中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元細(xì)胞的損傷可能會(huì)導(dǎo)致一些蛋白滲漏,如果有血腦屏障被破壞,這些蛋白會(huì)進(jìn)入外周血液。在創(chuàng)傷性中樞神經(jīng)損傷患者的血清中,這些蛋白的濃度通常會(huì)增高。急性脊髓損傷患者的血清NSE 蛋白水平均顯著高于未伴脊髓損傷及正常人群,且其血清水平 24 h 達(dá)到峰值,隨后逐漸降低[14]。血清 NSE>6.26 ng/ml 時(shí)提示可能出現(xiàn)了脊髓損傷[15]。血清 NSE 結(jié)合 CT 檢查可預(yù)測(cè)急性脊髓損傷的嚴(yán)重程度[16]。

GFAP主要表達(dá)在纖維性星形膠質(zhì)細(xì)胞和反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞,對(duì)神經(jīng)元的存活和膠質(zhì)細(xì)胞的增生有促進(jìn)作用,其表達(dá)水平的高低可反映星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖、壞死等改變的程度,是早期診斷中樞神經(jīng)損傷的可靠指標(biāo)[17]。本研究結(jié)果顯示,兔脊髓GFAP、NSE和MBP蛋白含量,損傷最為嚴(yán)重的是深水組,其次是淺水組,陸地組損傷不明顯。這說(shuō)明水越深,爆炸對(duì)脊髓的損傷越嚴(yán)重。脊髓損傷后,一方面星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)GFAP,自我復(fù)制有利于損傷修復(fù)和功能恢復(fù);另一方面,因過(guò)度膠質(zhì)化形成的膠質(zhì)瘢痕影響了神經(jīng)結(jié)構(gòu)修復(fù)和神經(jīng)功能恢復(fù)。由于受損的神經(jīng)元的軸突末梢GFAP含量增加, GFAP的合成可促進(jìn)形成膠質(zhì)瘢痕。脊髓損傷后損傷脊髓組織中 GFAP 的表達(dá)增加,損傷后14 d 達(dá)到最高[18]。早期減少GFAP的合成可阻止膠質(zhì)瘢痕的形成。有學(xué)者通過(guò)下調(diào)GFAP的表達(dá)水平從而達(dá)到臨床治療的目的。Toyooka等[19]將siRNAs 導(dǎo)入GFAP抑制膠質(zhì)活性發(fā)現(xiàn)可以改善急性排尿功能障礙,證明下調(diào)GFAP等蛋白活性,抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的過(guò)度增殖,可以有效的治療脊髓損傷。王芳等[20]研究結(jié)果表明,干細(xì)胞通過(guò)促進(jìn)兔損毀側(cè)交感神經(jīng)節(jié)內(nèi)微管相關(guān)蛋白-2的表達(dá),同時(shí)抑制GFAP的表達(dá)來(lái)發(fā)揮神經(jīng)功能的修復(fù)作用。薛成蓮等[21]通過(guò)給予急性腦梗死患者采取阿替普酶靜脈溶栓及銀杏葉提取物注射液治療,結(jié)果表明可下調(diào)血清GFAP水平,提高疾病整體治療效果。GFAP與腦損傷嚴(yán)重程度和死亡相關(guān),通過(guò)檢測(cè)GFAP可預(yù)測(cè)腦損傷程度及病死率。本研究中淺水區(qū)地雷爆炸傷對(duì)脊髓的損傷較陸地嚴(yán)重,傷后GFAP表達(dá)增強(qiáng),通過(guò)對(duì)GFAP的檢測(cè)可為臨床診斷和治療提供指導(dǎo)。

綜上所述,不同水深的地雷爆炸會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的脊髓損傷,包括蛛網(wǎng)膜下腔出血、神經(jīng)根周圍出血及脊髓的挫傷等表現(xiàn);且不同水深的地雷爆炸損傷機(jī)制不同,傷情特點(diǎn)也不同。脊髓損傷的治療十分復(fù)雜,因此在后送和入院治療時(shí)要考慮到脊髓損傷的特點(diǎn),要盡早進(jìn)行檢查和治療,確保功能的恢復(fù)。

猜你喜歡
大白兔淺水深水
淺水區(qū)域船舶航行下沉量的數(shù)值計(jì)算
大白兔全球旗艦店
“國(guó)民”奶糖須順勢(shì)改變
識(shí)人需要“涉深水”
微笑的大白兔
藕農(nóng)水中采收忙
大白兔奶糖
深水油氣何時(shí)能夠走出“冬天”?
基于LabWindows的淺水水聲信道建模
楊敬:深水區(qū)醫(yī)改設(shè)計(jì)者