張椿鈺，侯世科，吳 超， 程 明

胃癌是全球范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤之一，在所有惡性腫瘤中，其發(fā)病率排在第5位，病死率居第3位[1]。因此，進一步尋找能提示其預(yù)后的指標(biāo)并探索胃癌發(fā)生發(fā)展的相關(guān)分子機制，對早期制定治療策略并提高療效具有重要意義[2]。研究表明，趨化因子受體4(chemokine receptor 4, CXCR4)相關(guān)通路能夠激活腫瘤干細胞，可促進胃癌細胞的增殖，并通過激活腫瘤細胞逃逸宿主免疫機制以抑制腫瘤細胞凋亡[3]。但多數(shù)臨床研究僅限于腫瘤組織中CXCR4表達高低與基礎(chǔ)臨床數(shù)據(jù)的相關(guān)性分析，長期隨訪數(shù)據(jù)鮮有報道。本研究擬通過利用公開的癌癥基因組圖譜(the cancer genome atlas, TCGA)數(shù)據(jù)庫和生物信息學(xué)方法，分析CXCR4對胃癌患者腫瘤分期及遠期生存率的影響，并探討潛在的相關(guān)機制，從而為胃癌的預(yù)后判斷和治療方案制定提供一定的參考?，F(xiàn)報告如下。

1 資料和方法

1.1一般資料及生存曲線比較 從包含TCGA數(shù)據(jù)網(wǎng)站(http://www.linkedomics.org)下載胃癌患者數(shù)據(jù)集TCGA_STAD RNASeq和TCGA_STAD Clinical，篩選出同時包含生存時間數(shù)據(jù)信息和CXCR4基因表達數(shù)據(jù)的患者共375例，比較CXCR4基因表達水平與年齡、種族、放療狀況的相關(guān)性。按照CXCR4表達水平由高到低排序，將排在前50%的患者設(shè)為高表達組(188例)，其余患者設(shè)為低表達組(187例)，繪制2組患者的生存曲線。

1.2不同腫瘤分期的CXCR4比較 根據(jù)腫瘤的病理學(xué)分期及TNM分期，將患者分別歸入相應(yīng)的各組，比較不同分期CXCR4的基因相對表達水平。

1.3CXCR4相關(guān)基因篩選 利用Omisc軟件，將檢測的所有基因表達水平逐一與CXCR4表達水平進行Pearson相關(guān)性檢驗，根據(jù)相關(guān)系數(shù)，選取出與CXCR4表達水平相關(guān)性最高的50個基因，并繪制基因熱圖[4]。

1.4富集分析 將篩選出的50個CXCR4相關(guān)基因?qū)隓AVID在線數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)進行基因本體(gene ontology, GO)富集分析和京都基因與基因組百科全書通路(the kyoto encyclopedia of genes and genomes pathway, KEGG通路)富集分析。

1.5蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析 將篩選出的差異基因?qū)隨tring在線數(shù)據(jù)庫(http://string-db.org/)，獲得相關(guān)基因所編碼的蛋白質(zhì)之間的相互作用，并進行聚類分析，從而找出處于網(wǎng)絡(luò)核心的關(guān)鍵蛋白。

2 結(jié)果

2.1CXCR4基因表達水平與年齡、種族及放療狀況的相關(guān)性 CXCR4表達水平與胃癌患者年齡呈顯著相關(guān)性(P<0.01)；放療狀況及不同種族間胃癌患者的CXCR4表達水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖1。

圖1 CXCR4基因表達水平與胃癌患者年齡、放療狀況及種族的相關(guān)性

A.CXCR4基因表達水平與年齡相關(guān)性；B.放療狀況對CXCR4基因表達水平的影響；C.不同種族CXCR4基因表達水平情況；CXCR4為趨化因子受體4

2.2CXCR4表達差異對生存時間的影響 胃癌患者CXCR4高表達組的中位生存時間低于CXCR4低表達組(P<0.01)。見圖2。

圖2 2組胃癌患者生存曲線比較CXCR4為趨化因子受體4

2.3不同分期胃癌患者CXCR4表達差異 病理分期Ⅰ期患者CXCR4表達水平顯著低于Ⅱ～Ⅳ期的患者(P<0.05)，見圖3A；T1期患者CXCR4表達水平顯著低于T2～T4期患者(P<0.05)，見圖3B；N分期各期患者間CXCR4表達水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖3C；M0期患者CXCR4表達水平低于M1期患者(P<0.05)，見圖3D。

圖3 不同分期胃癌患者CXCR4表達水平差異

A.不同病理分期胃癌患者CXCR4表達；B.T分期胃癌患者CXCR4表達;C.M分期胃癌患者CXCR4表達；D.N分期胃癌患者CXCR4表達；CXCR4為趨化因子受體4

2.4CXCR4相關(guān)基因的篩選 在檢測的20 225個基因中，有11623個基因與CXCR4存在相關(guān)性(P<0.05)。見圖4A。選取與CXCR4表達相關(guān)系數(shù)最高的前50個基因，并繪制基因熱圖。見圖4B。其中氫電壓門控通道1(hydrogen voltage gated channel 1， HVCN1)和RCSD結(jié)構(gòu)域1(RCSD domain containing 1， RCSD1)與CXCR4表達水平的相關(guān)系數(shù)最高(r=0.749，0.738，均P<0.001)。見圖4C和圖4D。

圖4 CXCR4相關(guān)基因篩選結(jié)果

A.CXCR4與各基因的相關(guān)性分析結(jié)果；B.與CXCR4表達相關(guān)系數(shù)最高的前50個基因；C.HVCN1與CXCR4表達的相關(guān)系數(shù)；D.RCSD1與CXCR4表達的相關(guān)系數(shù)；CXCR4為趨化因子受體4，HVCN1為氫電門控制通道，RCSD1為RCSD結(jié)構(gòu)域1

2.5GO富集分析和KEGG通路富集分析 對篩選的50個基因進行GO富集分析可見，主要涉及的生物學(xué)過程包括對刺激的反應(yīng)、生物調(diào)節(jié)、細胞通訊、多細胞生物過程和發(fā)育過程；主要定位的細胞組分為膜、囊泡、細胞質(zhì)、細胞外空間和內(nèi)膜系統(tǒng)；主要涉及的分子功能為蛋白質(zhì)結(jié)合、分子換能器活動、酶調(diào)節(jié)劑活性、離子結(jié)合和脂質(zhì)結(jié)合。見圖5。KEGG通路富集分析可見主要涉及的信號通路為負性胸腺T細胞選擇、B細胞活化參與免疫反應(yīng)、免疫球蛋白介導(dǎo)的免疫反應(yīng)、調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫反應(yīng)和T細胞分化。見圖6。

圖5 GO富集分析

圖6 KEGG通路富集分析

2.6編碼蛋白相互作用分析 相關(guān)基因所編碼的蛋白之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)。見圖7。酪氨酸蛋白激酶BTK(tyrosine-protein kinase BTK，BTK)、胞質(zhì)分裂蛋白2脫除劑(dedicator of cytokinesis protein 2，DOCK2)、受體型酪氨酸蛋白磷酸酶C(receptor-type tyrosine-protein phosphatase C，PTPRC)是處于網(wǎng)絡(luò)核心的蛋白。見圖7。

3 討論

CXCR4由352個氨基酸構(gòu)成，其分子量為48 000，基因定位于2q21，在腫瘤形成和轉(zhuǎn)移中起重要作用[5]。CXCR4活化后可影響腫瘤細胞增殖、血管生成、侵襲和遠處轉(zhuǎn)移[3]。陳佳棟等[6]通過對300例胃癌患者病理標(biāo)本研究發(fā)現(xiàn)，CXCR4的轉(zhuǎn)錄及表達水平在胃癌組織中明顯升高，可能與胃癌患者的臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。Nikkhoo等[7]報道，CXCR4在胃癌細胞中表達增加，且細胞核優(yōu)勢表達患者較細胞質(zhì)優(yōu)勢表達患者的預(yù)后更佳。但多數(shù)研究缺乏長期隨訪數(shù)據(jù)，CXCR4對于胃癌患者長期生存率的影響仍有待進一步探討。本實驗通過分析公開數(shù)據(jù)庫中的患者信息發(fā)現(xiàn)，胃癌患者CXCR4高表達組的中位生存時間顯著低于CXCR4低表達組，表明CXCR4高表達與胃癌患者預(yù)后不良相關(guān)。進一步對CXCR4表達與腫瘤分期的相關(guān)性進行分析發(fā)現(xiàn)，腫瘤分期級別越高，CXCR4的表達越高。這與Nikzaban等[8]結(jié)果一致，其發(fā)現(xiàn)CXCR4水平在胃癌晚期顯著升高，CXCR4水平與疾病的分期和淋巴侵襲有關(guān)。但CXCR4可參與多條信號通路，其造成胃癌患者預(yù)后不良的相關(guān)機制尚未完全闡明，為此本研究進一步探索并分析了與CXCR4表達相關(guān)系數(shù)較高的基因，以期尋找潛在相關(guān)機制。

圖7 相關(guān)基因編碼蛋白的相互作用網(wǎng)絡(luò)

本研究結(jié)果顯示，HVCN1和RCSD1與CXCR4表達水平的相關(guān)系數(shù)最高，其中HVCN1基因編碼電壓門控蛋白質(zhì)通道蛋白，其可介導(dǎo)高選擇性氫離子外向電流，能在短時間內(nèi)補償酸負荷。腫瘤細胞由于耗能增加可造成細胞內(nèi)酸性物質(zhì)聚積，若酸性物質(zhì)聚積過量則會誘導(dǎo)發(fā)生細胞凋亡，而HVCN1的過表達則可緩解癌細胞內(nèi)酸性物質(zhì)的聚積，促進腫瘤細胞的增殖[9-10]。RCSD 1又稱為CapZ相互作用蛋白(capZ-interacting protein， CAPZIP)，在應(yīng)激條件下誘導(dǎo)的磷酸化可調(diào)節(jié)F-肌動蛋白加帽蛋白重塑肌動蛋白絲組裝的能力。CAPZIP主要高表達于免疫細胞和骨骼肌，當(dāng)細胞暴露于外界應(yīng)激時，可被多個應(yīng)激蛋白激酶磷酸化，導(dǎo)致CapZIP中CapZ的分離，從而進一步影響CD28胞漿內(nèi)結(jié)構(gòu)域的磷酸化[11]。CD28的磷酸化是激活T 細胞發(fā)揮抗腫瘤免疫效應(yīng)時重要的共刺激信號，其磷酸化程度降低將有利于腫瘤細胞的免疫逃逸[12]。CAPZIP在腫瘤細胞中高表達或可與免疫細胞中的CAPZIP競爭性結(jié)合應(yīng)激蛋白激酶，從而促進腫瘤細胞的免疫逃逸。

本研究對相關(guān)基因進行富集分析和相互作用分析可見，無論是對刺激的反應(yīng)功能、蛋白質(zhì)結(jié)合功能，還是主要定位于細胞膜和囊泡，這都與通路富集分析中的負性胸腺T細胞選擇、B細胞活化參與免疫反應(yīng)、免疫球蛋白介導(dǎo)的免疫反應(yīng)、調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫反應(yīng)和T細胞分化等結(jié)果相一致。這提示CXCR4促進胃癌患者預(yù)后不良的機制可能與對應(yīng)激后免疫系統(tǒng)的調(diào)控有關(guān)。蛋白相互作用分析也同樣再次印證了這一點。相互作用分析結(jié)果可見BTK、DOCK2和PTPRC處于網(wǎng)絡(luò)核心，其中BTK對B淋巴細胞的發(fā)育、分化和信號傳導(dǎo)是必不可少的[13]，DOCK2可參與趨化因子響應(yīng)的淋巴細胞遷移所需的細胞骨架重排[14]，PTPRC與DPP4結(jié)合后可作為T細胞共激活的正調(diào)節(jié)劑[15]。

綜上所述，CXCR4在提示胃癌患者預(yù)后中發(fā)揮重要作用，這可能與其通過調(diào)控免疫系統(tǒng)而促進腫瘤細胞免疫逃逸有關(guān)，這為胃癌的機制和藥物治療研究提供了一定參考。