閆雪梅

新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院醫(yī)學檢驗中心，新疆烏魯木齊 830000

膿毒癥是因為感染產(chǎn)生的全身炎癥反應綜合征，進一步發(fā)展會引起患者膿毒性休克，影響患者生命健康[1-2]。膿毒癥患者體內(nèi)有強烈的炎癥應答，可能有促炎和抗炎反應失衡紊亂的現(xiàn)象。在膿毒癥的炎癥應答調(diào)控中，多種免疫細胞和免疫分子扮演著重要的角色[3-4]。本研究旨在觀察治療前后膿毒癥患者中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)(cf-DNA/NETs)、炎癥細胞亞群變化以及血清白細胞介素-6(IL-6)、白細胞介素-10(IL-10)水平變化，并探討其臨床意義，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取本院2016年11月至2018年11月收治的膿毒癥患者48例作為膿毒癥組。納入標準:(1)符合膿毒癥 3.0[5]中的膿毒癥診斷標準；(2)年齡>18歲；(3)患者知情同意。排除標準:(1)伴有嚴重基礎疾病，如心肺復蘇后、特重型顱腦損傷，預后極差，可能成為主要死因的病癥；(2)合并原發(fā)性心、腦、腎、肺等器官功能障礙；(3)惡性腫瘤；(4)合并自身免疫性疾病。膿毒癥組中男29例，女19例；年齡19～77歲，平均(45.3±9.5)歲；急性生理學及慢性健康狀況評分系統(tǒng)(APACHE)Ⅱ評分為(22.35±5.12)分；序貫器官衰竭(SOFA)評分為(12.35±3.12)分；膿毒癥的誘因:肺部感染24例，腹腔感染18例，植入物感染3例，化膿性膽管炎2例，盆腔膿腫1例。納入同期30例健康志愿者作為健康組，其中男22例，女8例；年齡19～76歲，平均(44.8±8.6)歲。兩組研究對象在年齡、性別之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2方法

1.2.1治療方法 膿毒癥組按照《中國嚴重膿毒癥/膿毒性休克治療指南(2014)》[6]的推薦意見進行集束化治療，給予針對原發(fā)病的對癥治療、抗感染、營養(yǎng)支持、免疫調(diào)節(jié)、對癥支持等治療，并加用烏司他丁30萬IU/次靜脈注射，3次/日，連續(xù)7 d。

1.2.2外周血單個核細胞(PBMCs)和血清的分離 膿毒癥組患者在治療前及治療7 d后清晨、健康組在清晨采集外周靜脈血13 mL，其中抗凝靜脈血10 mL采用密度梯度離心法分離PBMCs，調(diào)整細胞水平為106個/mL，在37 ℃、5%CO2濕化空氣環(huán)境選擇含10%胎牛血清的RPM11640中培養(yǎng)。非抗凝靜脈血3 mL,3 000×g離心10 min分離血清。

1.2.3流式細胞術(shù)測定外周血炎癥細胞 取1×106個細胞置于流式細胞檢測專用試管中，分別加入抗CD3-FITC、抗CD4-perCPCy5.5、抗CD8-APC(購自美國eBioscience公司)各10 μL。4 ℃ 避光孵育20 min，用PBS緩沖液沖洗1次，1 200 r/min離心5 min，用PBS緩沖液沖洗1次，采用FACSCalibur型流式細胞儀(購自美國R&D公司)，采用CellQuest軟件獲取并分析，采用FlowJo軟件分析測定結(jié)果。

1.2.4細胞因子測定 采用人Luminex細胞因子檢測試劑盒，Luminex LX-200分析儀(包括xPONENT 3.1軟件購自美國BD公司)檢測血清IL-6、IL-10水平。

1.2.5cf-DNA/NETs檢測 血漿復溫后取100 μL，采用基于PicoGreen熒光染料法，用熒光酶標儀測定熒光值，按照標準曲線計算游離DNA(cf-DNA/NETs)水平。

2 結(jié) 果

2.1膿毒癥組治療前后及健康組炎癥細胞比例比較 膿毒癥組患者治療前殺傷性T 細胞比例明顯低于健康組，NK 細胞比例明顯高于健康組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。兩組的輔助性T 細胞上比例差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與治療前相比，膿毒癥組治療后的輔助性T 細胞和殺傷性T 細胞比例明顯增高，NK 細胞比例明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

2.2膿毒癥組治療前后及健康組cf-DNA/NETs、IL-6、IL-10水平比較 如表2所示，膿毒癥組患者治療前血清IL-6、 IL-10水平以及血漿cf-DNA/NETs明顯高于健康組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與治療前相比，膿毒癥組患者治療后血清IL-6、 IL-10水平及血漿cf-DNA/NETs明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表1 膿毒癥組治療前后及健康組炎癥細胞 比例比較

注：與健康組比較，*P<0.05；與組內(nèi)治療前比較，#P<0.05。

表2 膿毒癥組治療前后及健康組血清IL-6、 IL-10水平比較

注：與健康組比較，*P<0.05；與組內(nèi)治療前比較，#P<0.05。

3 討 論

如今膿毒癥被認為是宿主對感染應答失調(diào)引起臟器功能失衡的癥候群，關(guān)于其病理機制尚未完全清楚，主要與促炎反應和抗炎反應的失衡，微循環(huán)障礙，免疫功能紊亂等有關(guān)。嚴重感染引起的全身性炎性反應及器官功能損害是因為激活單核/巨噬細胞、內(nèi)皮細胞等炎癥細胞所引起的[7-8]。免疫應答過度激活，活化的單核/巨噬細胞能夠識別其特異性受體，釋放前炎癥介質(zhì)(如TNF-α、IFN-γ、IL-1、IL-6、IL-8等)，進而引起細胞因子的瀑布樣分級反應。但是相關(guān)學者發(fā)現(xiàn)，免疫抑制并非相對促炎反應而發(fā)生的代償性反應，是在感染或損傷一開始就有的，說明嚴重感染最早是免疫低反應[9]。為此，嚴重感染一方面可能有免疫亢進，另一方面也有免疫抑制，免疫治療的重點在于重建免疫平衡穩(wěn)態(tài)。

本研究結(jié)果顯示，膿毒癥組治療前殺傷性T 細胞比例明顯低于健康組，NK 細胞比例明顯高于健康組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，但輔助性T細胞在膿毒癥患者中的水平與健康組無明顯差異。相關(guān)學者在動物實驗中發(fā)現(xiàn)NK細胞的表達和本研究類似[10]。在細菌感染中，NK細胞具有促進免疫應答的作用。本研究結(jié)果顯示膿毒癥組患者治療前血清IL-6、 IL-10水平明顯高于健康組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。IL-6主要由T細胞和巨噬細胞合成，具有強烈的致炎活性，升高的IL-6對前炎性反應有分化作用，也可引起免疫功能失調(diào)[11]。既往研究認為，IL-6在嚴重膿毒癥和膿毒性休克中的上調(diào)與預后存在緊密聯(lián)系，提示該細胞因子在膿毒癥發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用[12-13]。 IL-10是抗炎細胞因子，主要由Th2細胞、單核/巨噬細胞合成，能釋放TNF-ɑ、IL-6、IL-8等致炎介質(zhì)，還可以抑制炎性細胞的增殖作用，是體內(nèi)的抗炎細胞因子[14-15]。本研究結(jié)果顯示，膿毒癥組患者治療前血清 IL-10水平明顯高于健康組，提示患者可能處于輕微的免疫抑制狀態(tài)。本研究對膿毒癥組進行集束化治療并加用烏司他丁，烏司他丁可以獨立抑制多種酶的活性，是理想的抗炎藥物。治療后膿毒癥組患者的輔助性T 細胞和殺傷性T 細胞比例明顯高于治療前，NK 細胞比例明顯低于治療前，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。進一步說明NK細胞在膿毒癥的發(fā)生、發(fā)展中有促進免疫應答的作用，烏司他丁起到了清除氧自由基以及抑制炎性遞質(zhì)釋放的作用，能增加輔助性T 細胞和殺傷性T 細胞的數(shù)量，減少NK細胞的數(shù)量[16-17]。本研究中，與治療前相比，膿毒癥組治療后的血清IL-6、 IL-10水平明顯更低，說明該治療方案可降低血清IL-6、 IL-10水平。相關(guān)學者在膿毒癥合并多臟器功能衰竭綜合征病例中也得到了類似的結(jié)論[18]，患者血清中炎癥因子IL-4、IL-6、IL-10均有不同程度的下降，但只有在IL-6上有明顯差異，提示烏司他丁可誘導降低炎性遞質(zhì)的表達，調(diào)控膿毒癥治療過程中的免疫應答。

在膿毒癥發(fā)展過程中，中性粒細胞的凋亡發(fā)揮了重要作用，其受到脂多糖刺激后，部分表面抗體釋放增加，能夠反映細菌感染，并且使NETs釋放增加，誘導IL-1β、IL-8等炎癥介質(zhì)的釋放。而且當病原體侵入機體后，NETs核心成分組蛋白水平可進行多種修飾，進而對免疫功能產(chǎn)生影響，造成損傷。本研究結(jié)果顯示，膿毒癥組患者治療前血漿cf-DNA/NETs明顯高于健康組，治療后血漿cf-DNA/NETs明顯下降。提示NETs可作為膿毒癥某時期反映炎癥損傷程度的標志物，值得進一步深入探討。

綜上所述，cf-DNA/NETs、炎癥細胞亞群與IL-6、 IL-10在膿毒癥發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用，患者存在嚴重的免疫平衡紊亂。集束化治療并加用烏司他丁能改善炎癥細胞亞群的比例，發(fā)揮免疫調(diào)控作用，調(diào)節(jié)IL-6、IL-10、cf-DNA/NETs水平，有增強機體免疫防御的作用，但炎癥因子間的作用形成錯綜復雜的調(diào)控網(wǎng)絡，免疫狀態(tài)形成確切機制十分復雜，有待于進一步深入研究。