姜愛君 彭爽 李倩

南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京醫(yī)院內(nèi)分泌科 210006

近年來，胰腺疾病患者逐年增加，許多研究都集中在胰腺細胞再生性治療領(lǐng)域。胰腺的外分泌組織由分泌消化液的腺泡細胞和導(dǎo)管系統(tǒng)構(gòu)成，內(nèi)分泌組織是由許多胰島組成，這些胰島包括多種不同的細胞類型，至少分泌5種不同的激素進入血液循環(huán)(α細胞分泌胰高血糖素；β細胞分泌胰島素；δ細胞分泌生長抑素；ε細胞分泌生長激素；γ或PP細胞分泌胰多肽)。胰腺炎和胰腺癌大部分病源于外分泌胰腺，而糖尿病是病源于內(nèi)分泌胰島，胰腺內(nèi)、外分泌細胞的再生可補充細胞數(shù)量、恢復(fù)細胞功能、延緩或治愈疾病，本文就胰腺細胞再生方法及相關(guān)機制展開綜述。

1 外分泌胰腺再生

外分泌胰腺表現(xiàn)出較強的再生和更新能力。在實驗?zāi)Ｐ拖到y(tǒng)中外分泌組織的部分丟失，如急性胰腺炎或部分胰腺切除術(shù)，可通過擴大存活的腺泡細胞，誘導(dǎo)快速恢復(fù)。多種物質(zhì)可以影響腺泡細胞再生，例如肥胖抑制素、金盞花提取物及雷馬酚[1]可以促進小鼠腺泡細胞分裂，有助于腺泡再生，而嗎啡[2]、布洛芬[3]及高甘油三酯血癥[4]會抑制急性胰腺炎腺泡的再生與恢復(fù)。另外，機體本身也有促進腺泡細胞再生的因子如肝再生增強因子ALR[5]，其通過抑制高遷移率族蛋白B1/Toll樣受體4/核因子-κB信號通路，減輕急性胰腺炎;細胞外基質(zhì)分子POSTN是重癥急性胰腺炎后由活化的胰腺星狀細胞分泌的外分泌譜系特異性再生的關(guān)鍵因子。Chan等[6]研究發(fā)現(xiàn)，在Caerulein誘導(dǎo)的胰腺炎小鼠模型中核因子-κB必需調(diào)節(jié)劑(NEMO)的缺失，可導(dǎo)致急性胰腺炎的炎性反應(yīng)輕微變化，但在慢性胰腺炎中，其缺失會加重胰腺炎性反應(yīng)和纖維化，抑制代償性腺泡細胞增殖，增強腺泡萎縮和引起腺泡導(dǎo)管化生，說明NEMO通過限制炎性反應(yīng)和纖維化以及促進腺泡細胞再生，在慢性胰腺炎中發(fā)揮保護作用。同時，Das等[7]研究發(fā)現(xiàn)，胰腺損傷后再生過程中還會發(fā)生腺泡-導(dǎo)管上皮化生(ADM)，轉(zhuǎn)錄因子Ets差異基因5(Ets variant gene 5, Etv5)是導(dǎo)管細胞特征性因子和ADM的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，Etv5的缺失會導(dǎo)致ADM形成受損，胰腺炎的嚴重程度增加，進一步研究表明ADM有助于組織再生和損傷恢復(fù)。此外，Nicole等[8]使用凋亡蛋白-8和白喉毒素基因敲除斑馬魚腺泡細胞，發(fā)現(xiàn)ptf1a+、ela3l-細胞(一種新型胰腺前體細胞)可以分化為外分泌細胞并通過隨后的Wnt信號依賴性增殖，恢復(fù)外分泌細胞團,這意味著腺泡細胞再生還可能源于胰腺干/祖細胞。

雖然急性胰腺炎患者可以完全恢復(fù)，但目前還不清楚他們的外分泌胰腺是否經(jīng)歷了類似于動物模型的自發(fā)修復(fù)和再生；在慢性胰腺炎中，ADM有助于胰腺炎腺泡細胞的再生，但是也可能導(dǎo)致胰腺纖維化和惡性腫瘤的發(fā)生，其機制尚未完全明確，這也許是慢性胰腺炎容易發(fā)展成為胰腺癌的一個原因。

2 內(nèi)分泌胰腺再生

數(shù)十年的臨床研究已經(jīng)證實，胰島移植對糖尿病部分患者是有益的，他們可在數(shù)年內(nèi)不注射胰島素或口服降糖藥物，而血糖仍然保持在合適的范圍[9]。然而，由于缺乏合適的供體胰島，并且需要長期的免疫抑制來對抗自身和同種異體免疫，臨床胰島移植僅在小范圍內(nèi)使用。為了治療更多的患者，刺激內(nèi)源性胰島再生已成為研究者們感興趣的話題，包括促進β細胞增殖，或非β細胞轉(zhuǎn)分化。

2.1 β細胞增殖 在機體妊娠期間、肥胖時或在胰島素抵抗條件下可以觀察到β細胞增殖增加。例如，小鼠胰島β細胞數(shù)量在妊娠期間增加3～5倍，其中主要受催乳素的刺激作用所致；另外，視網(wǎng)膜母細胞瘤蛋白(Rb)也對β細胞的增殖和功能具有重要調(diào)節(jié)作用[10]。 Zhao等[11]用胰腺特異性Rb基因敲除(RB-KO)小鼠與野生型小鼠對照研究，結(jié)果表明，隨著Rb基因的敲除，催乳素不會導(dǎo)致細胞周期進程的進一步增加，證實催乳素在妊娠期間是通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子5-細胞周期蛋白D/周期蛋白依賴性激酶4途徑使得Rb磷酸化，從而促進β細胞增殖增加。高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠肥胖易引起胰島素抵抗，β細胞發(fā)生代償性增殖，產(chǎn)生更多的胰島素以降低血糖[12]。蛋白激酶Cζ可調(diào)節(jié)下游信號號哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)和細胞周期蛋白D2，這在因飲食誘導(dǎo)的胰島素抵抗中早期，β細胞代償性增殖中至關(guān)重要[13]。然而在生理狀態(tài)下，β細胞增殖能力與年齡有關(guān)，有絲分裂能力在出生時最高，隨著年齡增長增殖能力逐漸降低，到成年時急劇下降，甚至不復(fù)存在。因此，探討成人β細胞增殖的相關(guān)分子機制以提高其增殖能力是糖尿病治療的理想目標。

藥物如Harmine[14]、CC-401[15]或氨基吡嗪[16]等可抑制人體胰島β細胞中雙特異性酪氨酸磷酸化調(diào)節(jié)激酶1A(DYRK1A)，它可使活化T細胞核因子(NFAT)發(fā)生磷酸化，NFAT通常以磷酸化狀態(tài)定位于細胞質(zhì)中，但當(dāng)DYRK1A被抑制時，NFAT磷酸化水平降低并移位到細胞核以促進β細胞有絲分裂，然而完全抑制DYRK1A則不會引起β細胞的明顯增殖[17]。轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)途徑通過激活Smad影響β細胞增殖。Wang等[14]應(yīng)用TGF-β超家族(TGFbSF)受體抑制劑阻止Smad蛋白的活化，通過DYRK1A和TGF-β的聯(lián)合抑制，觀察到人體β細胞增殖進一步增加。Dai等[18]在幼年胰島中用exendin-4，即一種胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)受體激動劑，誘導(dǎo)鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶/NFAT信號成分的表達以及增殖促進因子的靶基因(如NFATC1、FOXM1和CCNA1)，發(fā)現(xiàn)能夠刺激青少年而不是成人胰島β細胞增殖。此外，叉頭盒轉(zhuǎn)錄因子1還參與了雌二醇-17β介導(dǎo)的人胰島的增殖。另有研究表明，中腦星形膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(MANF)可保護人類β細胞免受實驗誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，從而減少β細胞凋亡和促進增殖，當(dāng)TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受到抑制時，MANF可使原代人β細胞的增殖倍增，MANF的保護作用還與抑制核因子-κB信號通路有關(guān)[19]。不同類型胰島細胞之間的相互影響也可調(diào)節(jié)胰島功能，胰島δ細胞分泌的生長抑素可緩解低糖水平所致的細胞應(yīng)激標志物(Hspa1a和Ddit3)的上調(diào)和β細胞凋亡，而細胞周期抑制劑p57已被證明可以誘導(dǎo)人β細胞的細胞凋亡[20-21]。

2.2 非β細胞轉(zhuǎn)分化 轉(zhuǎn)分化一般指通過具有雙表型或去分化步驟的中間體，將一種已分化的細胞類型轉(zhuǎn)化為另一種成熟類型的細胞。轉(zhuǎn)錄因子的異位表達可以通過體細胞轉(zhuǎn)分化，將終末分化的細胞轉(zhuǎn)化為產(chǎn)生胰島素的細胞。研究表明，參與胰島β細胞分化的重要轉(zhuǎn)錄因子包括胰-十二指腸同源盒蛋白1(Pdx1)、神經(jīng)元素3(Ngn3)、 配對盒基因4(Pax4)、V-maf肌肉腱膜纖維肉瘤癌基因同源基因A(Mafa)、NK2轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)蛋白2(Nkx2.2)以及NK6轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)蛋白1(Nkx6.1)等，這些蛋白協(xié)調(diào)表達決定了非β細胞的轉(zhuǎn)分化。

2.2.1 α細胞 作為胰腺內(nèi)分泌細胞，α細胞與β細胞有著相似的表觀遺傳學(xué)特征，均位于胰島內(nèi)且位置相近。基于這些優(yōu)勢，大量研究證實，在α細胞中過表達關(guān)鍵的β細胞轉(zhuǎn)錄因子可以觸發(fā)它們轉(zhuǎn)分化以產(chǎn)生β樣細胞。Furuyama等[22]將已故糖尿病患者α細胞移植到糖尿病小鼠中，用轉(zhuǎn)錄因子Pdx1和Mafa跟蹤并重編碼，發(fā)現(xiàn)移植的人α細胞可產(chǎn)生胰島素長達6個月之久以逆轉(zhuǎn)糖尿病。用表達GLP-1的重組腺病毒(Rad-GLP-1)和exendin-4處理小鼠α細胞，發(fā)現(xiàn)胰島素(+)胰高血糖素(+)雙陽性細胞顯著增加，且exendin-4促進了胰島中成纖維細胞生長因子21(FGF21)的表達和分泌；與野生型小鼠相比，F(xiàn)GF21基因敲除小鼠通過Rad-GLP-1處理產(chǎn)生的胰島素分泌細胞顯著減少，說明GLP-1在α細胞轉(zhuǎn)分化產(chǎn)生新的β細胞中具有重要作用，且可能是通過FGF21介導(dǎo)[23]。在鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病和非肥胖糖尿病小鼠模型中，應(yīng)用胰高血糖素受體單克隆抗體(GCGR mAb)治療可增加活性GLP-1水平，進而誘導(dǎo)α細胞向β細胞的轉(zhuǎn)化，提示GLP-1還受到GCGR mAb的調(diào)節(jié)以誘導(dǎo)α細胞向β細胞轉(zhuǎn)化[24]。γ-氨基丁酸信號可以促進該轉(zhuǎn)分化的過程。但是α細胞轉(zhuǎn)分化導(dǎo)致自身數(shù)量減少，從而使循環(huán)血中的胰高血糖素水平降低，是否會增加低血糖事件發(fā)生的風(fēng)險，這又是一個值得探究的問題。

2.2.2 δ細胞 α細胞轉(zhuǎn)分化往往發(fā)生在從青春期到成年期，甚至可以發(fā)生在老年期，而δ細胞轉(zhuǎn)分化往往發(fā)生在幼年期，Chera等[25]用白喉毒素將99%的β細胞破壞，4個月后β細胞的數(shù)量增加了45倍，與胰島細胞增殖高峰一致的是，幼鼠中δ細胞數(shù)量相應(yīng)減少，從而證明產(chǎn)生生長抑素的δ細胞能夠自發(fā)的集體轉(zhuǎn)分化。幼體表現(xiàn)出生長抑素-胰島素δ細胞轉(zhuǎn)化，涉及去分化、增殖和胰島發(fā)育調(diào)節(jié)因子的重新表達。

因此，非β細胞起源的胰島素產(chǎn)生細胞的恢復(fù)，能夠通過α細胞或δ細胞自發(fā)轉(zhuǎn)分化貫穿整個生命過程。多個胰島內(nèi)細胞相互轉(zhuǎn)換事件的出現(xiàn)，為糖尿病的治療提供了新視角。

2.2.3 腺泡及導(dǎo)管細胞 在關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Ngn3、Pdx1和Mafa的異位表達下，外分泌胰腺也可以產(chǎn)生內(nèi)分泌胰島素分泌細胞。但是，轉(zhuǎn)分化的成功不僅取決于轉(zhuǎn)錄因子的傳遞，還取決于其他環(huán)境，例如Cavelti-Weder等[26]用鏈脲佐菌素誘導(dǎo)β細胞消融后，創(chuàng)建不同血糖水平的小鼠模型，然后通過病毒傳遞編碼轉(zhuǎn)錄因子的基因至外分泌胰腺，觀察到高血糖能顯著減少腺泡細胞轉(zhuǎn)分化為胰島素產(chǎn)生細胞；然而另一成年小鼠研究發(fā)現(xiàn)，高血糖(>300 mg/dl)是誘導(dǎo)胰腺導(dǎo)管細胞分化為分泌胰島素的β細胞所必需的，揭示血糖水平是糖尿病模型中轉(zhuǎn)分化成功的重要條件[27]。除了血糖，溫度對外分泌胰腺細胞轉(zhuǎn)分化也至關(guān)重要。研究表明，腺泡細胞在常溫(37℃)下培養(yǎng)可迅速失去表型并自發(fā)轉(zhuǎn)分化為導(dǎo)管樣表型，而在低溫(4℃)下培養(yǎng)則容易轉(zhuǎn)分化為胰島β樣細胞[28]。此外，成人胰腺腺泡及導(dǎo)管細胞通過暴露于骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7而轉(zhuǎn)化為內(nèi)分泌細胞，體外譜系追蹤證實骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7誘導(dǎo)的胰島素表達細胞主要來源于表達Pdx1的胰島外細胞、表達碳酸酐酶Ⅱ的成熟導(dǎo)管細胞和表達彈性蛋白酶3a的腺泡細胞，這種非遺傳轉(zhuǎn)化方式更新穎、更安全、更簡單[29]。

2.2.4 其他消化腺細胞 胃腸細胞及肝細胞是胰島素分泌細胞的可行內(nèi)源性來源，可能是因為這兩種細胞類型都來自原始的前腸內(nèi)胚層，有著共同的早期發(fā)育階段。傳統(tǒng)方法用攜帶Pdx1、Mafa和beta2/neurod基因的腺病毒載體感染小腸上皮細胞，4周后發(fā)現(xiàn)小腸內(nèi)有胰島素mRNA表達[30]。且另一個獨立研究表明，GLP-1可以促進腸上皮細胞的胰島素表達[31]。將攜帶Pdx1、Neurog3和Mafa基因的質(zhì)粒導(dǎo)入小鼠肝細胞，從蛋白質(zhì)和mRNA水平研究轉(zhuǎn)染細胞中的胰島β細胞標志物，觀察糖尿病小鼠血糖的長期控制情況，可發(fā)現(xiàn)肝細胞能夠直接重新編程為胰島素分泌細胞，并且空腹血糖水平降至正常，并持續(xù)到轉(zhuǎn)染后100 d，有望解決傳統(tǒng)的病毒轉(zhuǎn)染帶來的潛在安全性問題。同時，最近研究提示，將間充質(zhì)干細胞和內(nèi)皮祖細胞構(gòu)建胰腺血管生態(tài)位后，將二者與肝細胞產(chǎn)生的胰島素分泌細胞共同植入體內(nèi)，細胞存活率增加了一倍，胰島素產(chǎn)量增加了3倍,說明血管系統(tǒng)對胰島素分泌細胞的成熟和植入后的存活表現(xiàn)出旁分泌效應(yīng)。體內(nèi)生態(tài)位的重建有望促進肝臟到胰腺的轉(zhuǎn)分化，且這種細胞治療方法具有臨床應(yīng)用價值[32]。

成人胰腺外組織的轉(zhuǎn)化，克服了來自供體的組織可獲得性不足和抗排斥治療的問題，且轉(zhuǎn)化的安全優(yōu)勢在于，這個表觀遺傳過程不涉及外源DNA插入、多能誘導(dǎo)，或不受控制的細胞增殖。

即使這些轉(zhuǎn)分化細胞可以產(chǎn)生胰島素，但是目前研究表明，其不具備β細胞的形態(tài)、分子和功能特性，只能稱之為β樣細胞或胰島素分泌細胞，并且大多數(shù)研究都還只是基于對嚙齒類動物的觀察和在人體細胞中進行的體外概念驗證實驗。在人體內(nèi)誘導(dǎo)非β細胞轉(zhuǎn)分化過程，最終增加β細胞數(shù)量和質(zhì)量，仍是一個重大挑戰(zhàn)。

綜上所述，胰腺再生性治療的進展與挑戰(zhàn)并存。胰腺腺泡細胞擁有自我再生能力，但臨床上重癥急性胰腺炎患者死亡率高，即使幸存的患者也會遺留不同程度的胰腺功能不全，甚至演變成為慢性胰腺炎，這就對腺泡細胞的再生速度與程度有了更高的要求，因此進一步研究其再生機制至關(guān)重要；胰島β細胞可以通過各種途徑使非β細胞轉(zhuǎn)分化實現(xiàn)再生，或者通過不同的生物因子激活或抑制相關(guān)信號通路來增強β細胞的增殖，這些與糖尿病密切相關(guān)。目前對于胰島β細胞再生的研究已經(jīng)取得的這些成就，尚不足以應(yīng)對糖尿病發(fā)病的速度，且現(xiàn)階段這些研究對象僅僅限于嚙齒類動物、斑馬魚或體外細胞，與人體內(nèi)再生方式是否相同？再生的β樣細胞是否能夠產(chǎn)生足夠的胰島素？這些胰島素對血糖的反應(yīng)是否正常？在此過程中是否會帶來其他嚴重的不良反應(yīng)？以及體外移植如何克服免疫排斥與致瘤問題？相信隨著研究的深入，胰腺細胞再生性治療將會為胰腺疾病患者帶來新希望。