李 程，陳 阿，許 暢，邱葉貝，曹建國(guó)，楊劍鋒

（湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)系，長(zhǎng)沙 410013）

先前的研究已經(jīng)證實(shí)飲食黃酮白楊素（（5，7-二羥基黃酮，Chrysin，ChR）及其類似物8-溴-7-甲氧基白楊素（8-bromo-7-methoxy chrysin，BrMC）具有抑制肝癌干細(xì)胞樣細(xì)胞功能和特性作用［1，2］，然而，其作用分子機(jī)制尚未完全闡明。新近的研究表明，DNA 甲基化是多種類型人實(shí)體瘤，包括肝細(xì)胞癌的關(guān)鍵表觀遺傳學(xué)調(diào)控機(jī)制［3，4］。有研究發(fā)現(xiàn)兒茶素、金雀異黃素、醉茄素A、姜黃素和白藜蘆醇等天然化合物抑制乳腺癌細(xì)胞系細(xì)胞DNMT1 表達(dá)［5］。但是，BrMC 是否抑制DNMT1活性靶向抑制肝癌干細(xì)胞樣細(xì)胞功能和特性，鮮見(jiàn)報(bào)道。本文的主要目的是確定ChR 及其類似物BrMC 是否對(duì)人肝細(xì)胞癌SMMC-7721 細(xì)胞系球細(xì)胞的DNMT1活性和自我更新能力有抑制作用。

1 材料與方法

1.1 球細(xì)胞的培養(yǎng)和藥物處理 按照先前發(fā)表文獻(xiàn)［6］描述的方法得到人肝細(xì)胞癌SMMC-7721 細(xì)胞（中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫(kù)）系球細(xì)胞；測(cè)定肝癌球形成率（%）；在第1 次球形成培養(yǎng)中分別加入ChR（美國(guó)Sigma 公司，終濃度：40μM）或BrMC（參照文獻(xiàn)［7］合成與結(jié)果確證，終濃度：5 和10μM）孵育6d。而在第2 次球形成培養(yǎng)中測(cè)定肝癌球形成率。

1.2 DNMT1 活性測(cè)定 依據(jù)先前發(fā)表文獻(xiàn)［8］的方法

提取核蛋白、測(cè)定核蛋白DNMT1 濃度，然后，依據(jù)工作標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=0.3005x + 0.1967（R2=0.9923）計(jì)算出各樣本中DNMT1 的濃度。然后，以溶媒處理肝癌球細(xì)胞的DNMT1 濃度為1.0 計(jì)算ChR（40μM）或BrMC（5 和10μM）處理72h 的相對(duì)DNMT 活性。

1.3 qRT-PCR 按照先前發(fā)表文獻(xiàn)［6，8］的方法和步驟用qRT-PCR 測(cè)定CD133 和CD44 mRNA 表達(dá)水平。CD133 擴(kuò)增引物（正向：5′-CAGATGCTCCTAAGGCT TG-3′；反向：5′-GCAAAGCATTTCCTCAGG-3′）、CD44 引物（正向5′-CCGCTATGTCCAGAAAGGA-3′；反向：5′-CTGTCTGTGCTGTCGGTGAT-3′）和β-actin 引物（）正向：5′-ACAAAACCTAACTTGCGCA G-3′；反向：5′-TCCTGTAACAACGCATCTCA-3′由上海生工公司（中國(guó)上海市）合成。用β-actin mRNA 標(biāo)化CD133 和CD44 mRNA 相對(duì)表達(dá)水平。2-ΔΔCt方法計(jì)算mRNA 相對(duì)表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 SPSS 20.0 for windows evaluation 軟件（SPSS Inc，Chicago，IL）用于本文研究的數(shù)據(jù)分析。與溶媒（0.1% DMSO）對(duì)照組均數(shù)比較采用Student’s t檢驗(yàn)。所有配對(duì)組均數(shù)的比較應(yīng)用單向方差分析（One Way ANOVA）的Tukey's 檢驗(yàn)，P<0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ChR 和BrMC 抑制SMMC-7721 細(xì)胞系球細(xì)胞的肝癌球形成能力 在第1 次球形成培養(yǎng)中，ChR（40μM）和BrMC（5 和10μM）持續(xù)作用6d，SMMC-7721細(xì)胞系球細(xì)胞第2 次球形成培養(yǎng)的肝癌球形成率顯著降低（圖1，P<0.05）。

圖1 ChR和BrMC對(duì)SMMC-7721細(xì)胞系球細(xì)胞的肝癌球形成能力的影響

2.2 ChR 和BrMC 抑制SMMC-7721 細(xì)胞系球細(xì)胞DNMT1 活性 ChR（40μM）和BrMC（5 和10μM）處理72h 能有效地降低SMMC-7721 細(xì)胞系球細(xì)胞DNMT1活性（圖2，P<0.05）。

圖2 ChR和BrMC對(duì)SMMC-7721細(xì)胞系球細(xì)胞DNMT1活性的影響ELISA測(cè)定ChR（40μM）和BrMC（5和10μM）處理72h的球細(xì)胞DNMT1活性（mean±SD，n=3）。與0.1%DMSO處理組比較：*P<0.05；與ChR（40μM）處理組比較：# P<0.05。

2.3 ChR 和BrMC 下調(diào)SMMC-7721 細(xì)胞系球細(xì)胞CD133 mRNA 表達(dá) ChR（40μM）和BrMC（5 和10μM）處理24h 顯著降低SMMC-7721 細(xì)胞系球細(xì)胞CD133 mRNA 表達(dá)水平（圖3，P<0.05）。

圖3 ChR和BrMC對(duì)SMMC-7721細(xì)胞系球細(xì)胞CD133 mRNA表達(dá)的影響 qRT-PCR分析ChR（40μM）和BrMC（5和10μM）處理24h的球細(xì)胞CD133 mRNA表達(dá)水平（mean±SD，n=3）。與0.1%DMSO處理組比較：* P<0.05；與ChR（40μM）處理組比較：# P<0.05。

2.4 ChR 和BrMC 下調(diào)SMMC-7721 細(xì)胞系球細(xì)胞CD44 mRNA 表達(dá) ChR（40μM）和BrMC（5 和10μM）處理24h 顯著降低SMMC-7721 細(xì)胞系球細(xì)胞CD44 mRNA 表達(dá)水平（圖3，P<0.05）。

圖4 ChR和BrMC對(duì)SMMC-7721細(xì)胞系球細(xì)胞CD44 mRNA表達(dá)的影響 qRT-PCR分析ChR（40μM）和BrMC（5和10μM）處理24h的球細(xì)胞CD44 mRNA表達(dá)水平（mean±SD，n=3）。與0.1%DMSO處理組比較：*P<0.05；與ChR（40μM）處理組比較：#P<0.05。

3 討論

我們先前的研究顯示建立肝細(xì)胞癌細(xì)胞系球細(xì)胞能有效富集肝癌干細(xì)胞，可作為肝癌干細(xì)胞樣細(xì)胞實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)［9，10］。與先前的研究結(jié)果一致，本文的結(jié)果再一次證明飲食黃酮ChR 及其合成類似物BrMC 顯著降低SMMC-7721 細(xì)胞系球細(xì)胞的二次球形成能力。這些結(jié)果建議ChR 和BrMC 能在體外培養(yǎng)細(xì)胞系統(tǒng)中減少或消除肝癌干細(xì)胞樣細(xì)胞。

DNMT1 是一種主要的、廣泛表達(dá)的基因DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶。DNMT1 優(yōu)先選擇DNA 復(fù)制過(guò)程中形成的以半甲基化狀態(tài)存在的DNA 雙鏈作為催化底物。已有研究證實(shí)，DNMT1 是維持造血干細(xì)胞、間質(zhì)干細(xì)胞、白血病干細(xì)胞和乳腺癌干細(xì)胞特性的關(guān)鍵因子［11］。我們曽經(jīng)報(bào)道DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑地西他濱通過(guò)抑制DNMT1 表達(dá)減弱SMMC-7721 源性LCSLC 自我更新能力［6］。盡管人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)ChR 是一種DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶和組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶的雙重抑制劑［12］，本文的實(shí)驗(yàn)研究首次發(fā)現(xiàn)ChR 的人工合成類似物BrMC 能有效地抑制SMMC-7721 細(xì)胞系球細(xì)胞DNMT1 活性，并且，作用效價(jià)強(qiáng)度高于先導(dǎo)化合物ChR。結(jié)合前述的BrMC 顯著降低SMMC-7721 細(xì)胞系球細(xì)胞的二次球形成能力和下調(diào)腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物CD133 和CD44 mRNA 表達(dá)的結(jié)果，我們有理由推斷BrMC 可能通過(guò)抑制DNMT1活性從而減弱或消除SMMC-7721 細(xì)胞系球細(xì)胞的干性。

總之，本文的研究結(jié)果提示抑制DNMT1 活性可能是BrMC 體外減少或消除肝癌干細(xì)胞樣細(xì)胞的作用機(jī)制之一。我們的研究結(jié)果為開發(fā)和研制以表觀遺傳調(diào)控為靶標(biāo)有效防治人肝細(xì)胞癌輔助治療劑提供實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。