何海娟 楊燕青 鄭波 叢海濤 戴勤學(xué)

[摘要] 目的 觀察右美托咪定對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠大腦皮質(zhì)Wnt/β-catenin蛋白表達(dá)的影響。 方法 將48只雄性SD大鼠按隨機(jī)區(qū)組的原則分為三組：對(duì)照組、模型組和右美托咪定組，每組各16只。采用大腦中動(dòng)脈阻塞（Middle cerebral artery occlusion，MCAO）法制造大鼠腦缺血再灌注損傷模型。右美托咪定組于缺血1 h即刻經(jīng)尾靜脈注射1 μg/kg右美托咪定作為負(fù)荷劑量，持續(xù)10 min，隨后以0.5 μg/（kg·h）的速率靜脈輸注至腦缺血2 h。對(duì)照組和模型組大鼠按相同方法給予生理鹽水。再灌注24 h時(shí)進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分后處死大鼠取出腦組織，各組取8只大鼠腦組織行TTC染色法測(cè)定腦梗死體積，另8只大鼠采用Western blot法檢測(cè)大腦皮質(zhì)β-catenin蛋白表達(dá)量。 結(jié)果 與對(duì)照組相比，模型組大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分明顯增加[（3.00±0.82） vs （0±0），P<0.05]、腦梗死體積明顯增加[（64.23±6.72）% vs （0±0）%，P<0.05]，β-catenin蛋白表達(dá)量明顯減少（0.46±0.14 vs 1.12±0.23，P<0.05）。與模型組相比，右美托咪定組大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分（1.69±0.71 vs 3.00±0.82，P<0.05）、腦梗死體積明顯減少[（45.13±8.29）% vs （64.23±6.72）%，P<0.05]，β-catenin蛋白表達(dá)量明顯增加[（0.82±0.23） vs （0.46±0.14），P<0.05]。 結(jié)論 右美托咪定能減輕大鼠腦缺血再灌注損傷，其機(jī)制可能與增加大腦皮質(zhì)中β-catenin蛋白表達(dá)量有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 腦缺血再灌注損傷;右美托咪定;Wnt/β-catenin蛋白;大鼠

[中圖分類號(hào)] R614? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-9701（2020）35-0039-04

[Abstract] Objective To observe the effect of dexmedetomidine on Wnt/β-catenin protein expression in cerebral cortex of rats with cerebral ischemia-reperfusion injury. Methods A total of 48 male SD rats were divided into 3 groups according to the principle of randomized block： control group， model group and dexmedetomidine group， with 16 rats in each group. The middle cerebral artery occlusion（MCAO） method was used to make the model of cerebral ischemia-reperfusion injury in rats. In the dexmedetomidine group， 1 μg/kg dexmedetomidine was injected into caudal vein as a loading dose for 10 min immediately after 1 h of ischemia， and then was injected intravenously to cerebral ischemia for 2 h at a rate of 0.5 μg/（kg·h）. Rats in the control group and the model group were given normal saline in the same way. Neurological function scores were concluded 24 h after reperfusion， and then rats were executed for brain tissues to be taken out. Brain tissues of 8 rats in each group were taken out for TTC staining method to measure cerebral infarction volume， and the expression of β-catenin protein in cerebral cortex of the other 8 rats was detected by Western blot method. Results Compared with the control group， in the model group the neurobehavioral scores of the rats were significantly increased （3.00±0.82 vs 0±0， P<0.05）， the cerebral infarction volume was significantly increased[（64.23±6.72）% vs （0±0）%， P<0.05]， and the expression of β-catenin protein was significantly decreased（0.46±0.14 vs 1.12±0.23， P<0.05）. Compared with the model group， in the dexmedetomidine group， the neurobehavioral scores of the rats （1.69±0.71 vs 3.00±0.82， P<0.05） and the cerebral infarction volume[（45.13±8.29）% vs （64.23±6.72）%， P<0.05] were significantly reduced， and the expression of β-catenin protein[（0.82±0.23） vs （0.46±0.14）， P<0.05] was significantly increased. Conclusion Dexmedetomidine can reduce cerebral ischemia-reperfusion injury in rats， and its mechanism may be related to increasing the expression of β-catenin protein in cerebral cortex.

[Key words] Cerebral ischemia-reperfusion injury; Dexmedetomidine; Wnt/β-catenin protein; Rat

目前右美托咪定（Dexmedetomidine）在臨床上應(yīng)用廣泛，其具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛和抗交感活性[1]等作用。研究表明右美托咪定具有臟器保護(hù)作用[2]。腦缺血再灌注損傷在臨床上是十分常見并且多發(fā)的疾病，其具體機(jī)制十分復(fù)雜并不明確[3]。有研究表明右美托咪定具有神經(jīng)保護(hù)作用[4]，其可能的機(jī)制是增強(qiáng)內(nèi)源性抗氧化酶的活性，減少神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡，降低血清神經(jīng)元特異性烯醇化酶以及S100β蛋白濃度等[5]。Wnt/β-catenin信號(hào)通路作為一條多環(huán)節(jié)、多作用位點(diǎn)的開放通路，在神經(jīng)系統(tǒng)中起著非常重要的作用[6]。已有文獻(xiàn)證實(shí)Wnt/β-catenin信號(hào)通路參與了腦缺血損傷的病理生理過程，并且β-catenin蛋白是該信號(hào)通路的關(guān)鍵蛋白[7]。那么，β-catenin蛋白是否與右美托咪定的腦保護(hù)有關(guān)，值得進(jìn)一步探索。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物選擇與分組

健康雄性SD大鼠48只，體重（230±15）g，動(dòng)物編碼：2010000417632。由溫州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物房提供，飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物房中并自由覓食。手術(shù)前一日禁食但不禁飲。將48只SD大鼠按隨機(jī)區(qū)組的原則分為三組：對(duì)照組、模型組以及右美托咪定組，每組16只。

1.2 給藥方法

右美托咪定組大鼠在腦缺血1 h時(shí)，采用微量輸液泵（MICROINFUSION PUMP WZS-50F6，浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)儀器有限公司）經(jīng)尾靜脈注射右美托咪定（批號(hào)：16091032，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司）1 μg/kg負(fù)荷劑量，持續(xù)10 min，然后再以0.5 μg/（kg·h）的速率輸注至腦缺血再灌注2 h。對(duì)照組和模型組大鼠按相同方法給予等量生理鹽水。

1.3 模型制備

采用大腦中動(dòng)脈阻塞（Middle cerebral artery occlusion，MCAO）法制造大鼠腦缺血再灌注損傷模型[8]。大鼠采用水合氯醛（10%，400mg/kg）麻醉后，頸部皮膚備皮、消毒后切皮，暴露出大鼠右側(cè)頸總動(dòng)脈（CCA）、頸外動(dòng)脈（ECA）、頸內(nèi)動(dòng)脈（CA）。將ECA結(jié)扎離斷，再將CCA用動(dòng)脈夾夾住并在ECA殘端處剪一個(gè)小口，將線栓圓頭端[直徑為（0.32±0.02） mm，購(gòu)自北京沙東生物技術(shù)有限公司]置入。用眼科鑷輕推線栓的尾端經(jīng)CCA沿CA進(jìn)入顱腔，直至大腦中動(dòng)脈（MCA），遇阻力即止。線栓插入深度18～20 mm。對(duì)照組大鼠不阻塞大腦中動(dòng)脈，其余操作同模型組大鼠。腦缺血再灌注2 h時(shí)按照Longa等[8]的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分。評(píng)分在1分以上的動(dòng)物作為觀察對(duì)象，0分則剔除。整個(gè)操作過程中要連續(xù)監(jiān)測(cè)大鼠肛溫，保持在（37.0±0.2）℃。

1.4 行為學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

腦缺血再灌注24 h時(shí)，由另一個(gè)不知分組情況的研究者按照Longa等[8]的方法進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分法：0分，正常、無(wú)神經(jīng)功能障礙表現(xiàn);1分，輕度神經(jīng)功能障礙，不能完全伸展對(duì)側(cè)前肢;2分，中度神經(jīng)功能障礙，爬行時(shí)向左側(cè)轉(zhuǎn)圈;3分，重度神經(jīng)功能障礙，行走時(shí)向左側(cè)傾倒;4分，極重度神經(jīng)功能障礙，不能自發(fā)行走伴有意識(shí)減退。

1.5 TTC染色法

各組取8只大鼠，采用水合氯醛（10%，400 mg/kg）麻醉后斷頭取腦，用腦模具連續(xù)冠狀切5片，間距為2 mm，放入2%TTC溶液（購(gòu)于美國(guó)Sigma公司）中（37℃，孵育30 min），不定期翻動(dòng)腦片使其均勻染色，24 h后數(shù)碼相機(jī)拍照保存在計(jì)算機(jī)內(nèi)，采用Image pro plus 6.0圖像分析處理軟件計(jì)算腦梗死體積（正常腦組織被染成紅色，梗死區(qū)域被染成白色），梗死體積百分比等于梗死側(cè)的梗死體積/對(duì)側(cè)正常體積之比。

1.6 Western-blot技術(shù)

各組剩余8只大鼠處死后取出大腦皮質(zhì)，采用Western blot法檢測(cè)β-catenin表達(dá)。大腦皮質(zhì)細(xì)胞總蛋白的提取采用細(xì)胞蛋白提取試劑盒（Thermo公司，美國(guó)），按照說明書的步驟操作。等量樣品經(jīng)聚偏二氟乙烯膜分離蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜上，轉(zhuǎn)移后的NC膜經(jīng)BSA孵育1 h，再封閉后，分別加入兔抗大鼠β-catenin單克隆抗體（Santa Cruz公司，美國(guó)），4℃孵育并過夜。室溫下?lián)u床沖洗，再孵育二抗，并化學(xué)發(fā)光，顯影、成像。β-actin作為內(nèi)參對(duì)照。應(yīng)用Alphaimager 2200凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目的蛋白，讀出每個(gè)條帶的光密度值。蛋白表達(dá)水平用β-catenin蛋白條帶光密度值與β-actin條帶光密度值的比值來(lái)表示，β-catenin蛋白表達(dá)水平=光密度值（β-catenin蛋白條帶）/光密度值（β-actin條帶）。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較均采用單因素方差分析，若方差不齊采用Tamhane檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較;若方差齊采用LSD方法檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 右美托咪定對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠行為學(xué)的影響

與對(duì)照組比較，模型組大鼠行為學(xué)評(píng)分明顯增加[（3.00±0.82） vs （0±0），P<0.05]，說明腦缺血再灌注損傷能夠造成大鼠的神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能缺陷。與模型組比較，右美托咪定組大鼠行為學(xué)評(píng)分明顯低于模型組[（1.69±0.71） vs （3.00±0.82），P<0.05]，說明右美托咪定這種藥物可以減少腦缺血再灌注損傷大鼠的神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能缺陷。見表1、圖1。

2.2 右美托咪定對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠梗死體積以及大腦皮質(zhì)β-catenin蛋白表達(dá)量的影響

與對(duì)照組比較，模型組大鼠大腦梗死體積明顯增加[（64.23±6.72）% vs （0±0）%，P<0.05]，說明大鼠腦缺血再灌注損傷模型的構(gòu)建成功。與模型組相比，右美托咪定組大鼠大腦梗死體積明顯減少[（45.13±8.29）% vs （64.23±6.72）%，P<0.05]，說明右美托咪定對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠具有腦保護(hù)作用。見表1、圖2。

與對(duì)照組比較，模型組大鼠大腦皮質(zhì)β-catenin蛋白表達(dá)量明顯減少（0.46±0.14 vs 1.12±0.23，P<0.05），說明大鼠腦缺血狀態(tài)下，大腦皮質(zhì)的β-catenin蛋白表達(dá)量是下降的。與模型組相比，右美托咪定組大鼠大腦皮質(zhì)β-catenin蛋白表達(dá)量明顯增加（0.82±0.23 vs 0.46±0.14，P<0.05），說明右美托咪定這種藥物可以增加腦缺血再灌注損傷大鼠大腦皮質(zhì)β-catenin蛋白的表達(dá)量。見表1、圖3、4。

3 討論

臟器缺血性損傷是圍術(shù)期患者死亡的主要原因之一，也是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。其中腦缺血是圍術(shù)期比較常見的并發(fā)癥，也是導(dǎo)致患者遠(yuǎn)期學(xué)習(xí)、記憶以及認(rèn)知功能障礙的重要原因之一[9]。同時(shí)腦缺血性損傷也是引起患者致死率和致殘率最高的疾病之一，具有發(fā)病率高、死亡率高、致殘率高的特點(diǎn)[10]，其機(jī)制相當(dāng)復(fù)雜，鈣超載、氧自由基的反應(yīng)、炎癥反應(yīng)等多種因素參與其中[11]。右美托咪定具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抗焦慮、抑制交感活性、維持血流動(dòng)力學(xué)平穩(wěn)及無(wú)呼吸抑制等特性，廣泛運(yùn)用于圍術(shù)期患者[12]。目前關(guān)于右美托咪定的腦保護(hù)作用非常明確，具體機(jī)制有較多的研究，比如抑制TLR4/NF-κB途徑[13]，激活PI3K/Akt/mTOR信號(hào)傳導(dǎo)途徑[14]，激活ERK1/2信號(hào)通路[15]。但是并未檢索到右美托咪定激活對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路的調(diào)控作用。本實(shí)驗(yàn)采用腦缺血再灌注損傷大鼠為模型，以β-catenin為研究切入點(diǎn)，以神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分和腦梗死體積為觀察指標(biāo)，目的在于觀察Wnt/β-catenin是否與右美托咪定對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠的腦保護(hù)作用有關(guān)。

Wnt/β-catenin蛋白廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育成熟過程中起著非常重要的作用[16]。Wnt信號(hào)通路參與了多種細(xì)胞進(jìn)程，包括細(xì)胞增殖、細(xì)胞極化以及細(xì)胞死亡。Wnt信號(hào)通路激活后，胞質(zhì)內(nèi)的β-catenin積聚增多并且進(jìn)入核內(nèi)，與轉(zhuǎn)錄因子TCF和LEF相結(jié)合，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄[17]。局灶腦缺血后Wnt信號(hào)的激活能夠恢復(fù)神經(jīng)系統(tǒng)功能，誘導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞生發(fā)產(chǎn)生保護(hù)效應(yīng)[18]。因此Wnt信號(hào)通路在腦缺血再灌注損傷中發(fā)揮著重要的作用。在本研究中，發(fā)現(xiàn)右美托咪定組大鼠行為學(xué)評(píng)分明顯較模型組大鼠改善（P<0.05），大鼠腦梗死體積也較模型組大鼠明顯減少（P<0.05），說明右美托咪定對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠有腦保護(hù)作用，這與他人研究結(jié)論相一致[19-21]。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)了右美托咪定組大鼠大腦皮質(zhì)中β-catenin蛋白較模型組大鼠有明顯增加，說明右美托咪定能夠使腦缺血再灌注損傷大鼠大腦皮質(zhì)中β-catenin蛋白表達(dá)增加。結(jié)合已經(jīng)發(fā)表的文獻(xiàn)，推測(cè)右美托咪定可以通過提高大鼠大腦皮質(zhì)中β-catenin蛋白表達(dá)，激活Wnt信號(hào)通路，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄過程，導(dǎo)致腦內(nèi)保護(hù)性物質(zhì)合成增多，達(dá)到腦保護(hù)的作用。

本文發(fā)現(xiàn)右美托咪定能夠提高腦缺血再灌注損傷大鼠的β-catenin的表達(dá)量，而β-catenin是Wnt信號(hào)通路中一個(gè)關(guān)鍵作用位點(diǎn)，因此本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示右美托咪定對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠的腦保護(hù)作用，可能與激活Wnt信號(hào)通路有關(guān)。當(dāng)然本實(shí)驗(yàn)也有不足之處，未能采用Wnt/β-catenin的拮抗劑Dkk-1觀察右美托咪定的腦保護(hù)效應(yīng)能否被Dkk-1所拮抗，進(jìn)一步明確Wnt/β-catenin信號(hào)通路參與右美托咪定對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠的腦保護(hù)作用。

綜上所述，右美托咪定能減輕大鼠腦缺血再灌注損傷，其機(jī)制可能與增加大腦皮質(zhì)中β-catenin蛋白表達(dá)量有關(guān)。

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（收稿日期：2019-12-18）