鐘武 劉傳淵 張磊 劉紅權(quán) 易建中 方傳發(fā) 張磊昌

[摘要] 目的 檢測胃癌患者外周血中LAP+CD4+T細(xì)胞和CD4+CD25+ Treg細(xì)胞的分布比例，初步研究LAP+CD4+ T細(xì)胞與病理因素的相關(guān)性及在胃癌發(fā)生、進(jìn)展中的作用。 方法 收集2018年1月～2019年6月我院胃腸疝外科收治的50例胃癌患者術(shù)前及術(shù)后臨床病理資料，收集術(shù)前患者的外周血標(biāo)本，收集同期50例健康志愿者外周血作為對照組。流式細(xì)胞技術(shù)檢測LAP+CD4+T細(xì)胞和CD4+CD25+ Treg的分布比例，比較外周血中胃癌患者和健康志愿者LAP+CD4+T細(xì)胞的分布比例差異;Pearson法分析LAP+CD4+T細(xì)胞與臨床病理因素及CD4+CD25+ Treg細(xì)胞的相關(guān)性。 結(jié)果 外周血LAP+CD4+T細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例，胃癌患者為[7.58（6.23，8.22）%]高于健康志愿者的[1.76（0.79，2.35）%]（P<0.001）;Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，外周血中LAP+CD4+T細(xì)胞與CD4+CD25+Treg細(xì)胞分布比例呈正相關(guān)（r=0.629，P<0.001）;腫瘤TNM分期越晚，LAP+CD4+ T細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞比例越高（P<0.001）;有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者LAP+CD4+ T細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞比例高于無轉(zhuǎn)移者（P<0.001）。結(jié)論 LAP+CD4+T細(xì)胞在胃癌患者外周血中比例升高，可能參與了胃癌的發(fā)生、進(jìn)展，起到促進(jìn)腫瘤生長、轉(zhuǎn)移的作用。

[關(guān)鍵詞] LAP+CD4+T細(xì)胞;調(diào)節(jié)性T細(xì)胞;胃癌;腫瘤微環(huán)境

[中圖分類號] R735.2? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2020）35-0016-04

[Abstract] Objective To detect the distribution ratio of LAP+CD4+ T cells and CD4+CD25+ Treg cells in peripheral blood of patients with gastric cancer and preliminarily investigate the correlation between LAP+CD4+ T cells and clinicopathological factors as well as their roles in the occurrence and development of gastric cancer. Methods Preoperative and postoperative clinicopathological data of 50 patients with gastric cancer admitted to the Department of Gastrointestinal Surgery in our hospital from January 2018 to June 2019 were collected. Peripheral blood samples of preoperative patients were collected， and peripheral blood samples of 50 healthy volunteers with matching clinical features were collected as the control group. Flow cytometry was used to detect the distribution ratio of LAP+CD4+T cells and CD4+CD25+ Treg. The difference in the distribution ratio of LAP+ CD4+T cells in peripheral blood between gastric cancer patients and healthy volunteers was compared. Pearson assay was used to analyze the correlation between LAP+CD4+ T cells and clinicopathological factors as well as CD4+CD25+ Treg cells. Results The proportion of peripheral blood LAP+ CD4+T cells in CD4+T cells of patients with gastric cancer accounted for（7.58[6.23， 8.22]%）， which was higher than that of healthy volunteers（1.76[0.79， 2.35]%） （P<0.001）. Pearson correlation analysis showed that the LAP+CD4+T cells in the peripheral blood were positively related to CD4+ CD25+ Treg cells（r=0.629， P<0.001）. The later TNM staging， the higher the proportion of LAP+CD4+ T cells in CD4+T cells（P<0.001）， The percentage of CD4+T cells in patients with distant metastasis was higher than that in patients without metastasis（P<0.001）. Conclusion The increased proportion of LAP+CD4+ T cells in peripheral blood of patients with gastric cancer may be involved in the occurrence and development of gastric cancer and play a role in promoting tumor growth and metastasis.

[Key words] LAP+CD4+ T cells; Regulatory T cells; Gastric cancer; Tumor microenvironment

CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Regulatory T，Treg）在維持機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)和抑制免疫反應(yīng)中具有重要作用，可以抑制效應(yīng)T細(xì)胞的活化和分化，從而抑制機(jī)體對自體抗原和腫瘤相關(guān)抗原產(chǎn)生反應(yīng)，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。已有實驗結(jié)果顯示，腫瘤組織中Treg細(xì)胞數(shù)量越多，則意味著腫瘤患者的預(yù)后越差[1]。

潛態(tài)相關(guān)多肽（Latency-associated peptide，LAP）是一種前肽，能與TGF-氨基末端非共價結(jié)合，從而形成潛態(tài)的 TGF-β復(fù)合物?，F(xiàn)有研究認(rèn)為，LAP+CD4+T細(xì)胞是一種新型的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，其免疫抑制作用要強(qiáng)于以往發(fā)現(xiàn)的傳統(tǒng)CD4+CD25+Treg[2]，可抑制自身免疫性疾病、心血管疾病的進(jìn)展和器官移植排斥反應(yīng)[3-4]。現(xiàn)有研究結(jié)果顯示，在肝癌、胃癌和結(jié)直腸癌組織中LAP+CD4+T細(xì)胞的數(shù)量增多，可能使腫瘤細(xì)胞逃脫了機(jī)體的免疫系統(tǒng)監(jiān)視，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展[5-7]。胃癌患者LAP+CD4+T細(xì)胞與CD4+CD25+Treg細(xì)胞及臨床病理因素的相關(guān)性，尚未見報道。因此，本研究將從這兩方面初步研究LAP+CD4+T細(xì)胞在胃癌患者腫瘤微環(huán)境中的臨床意義，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

采集2018年1月～2019年6月在我院胃腸疝外科住院治療的胃癌患者臨床資料。所有患者均行手術(shù)治療（D3術(shù)式），術(shù)后病理診斷明確為腺癌，術(shù)后標(biāo)本送檢淋巴結(jié)數(shù)≥12枚，并進(jìn)行TNM分期。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）胃癌術(shù)后復(fù)發(fā)，家族性息肉病惡變者;（2）腫瘤穿孔或出血行急診手術(shù)者;（3）合并急慢性感染、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等自身免疫系統(tǒng)性疾病者;（4）術(shù)前行放化療、免疫治療、靶向治療或口服激素治療者。共50例患者納入研究作為試驗組，年齡26～77歲，平均（58.4±10.8）歲，其中男33例，女17例，直腸癌31例，結(jié)腸癌19例，Ⅰ+Ⅱ期15例，Ⅲ+Ⅳ期35例。抽取50例胃癌患者術(shù)前外周血標(biāo)本，另抽取50例健康志愿者（Healthy donor，HD）外周血標(biāo)本為對照組，健康志愿者均行胃鏡檢查，排除胃惡性腫瘤。兩組患者性別、年齡等一般資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），具有可比性，見表1。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑? PE Anti-Human LAP、FITC Anti-Human CD4、APC Anti-Human CD25及同型抗體購自美國eBioscience公司，10%濃度的淋巴細(xì)胞分離液（Ficoll-hypaque）、1%多聚甲醛、兩性霉素B、L-谷胺酰氨、DNA酶、RPMI1640購自上海索萊寶生物科技有限公司;胎牛血清（FBS）購自美國Gibico公司。

1.2.2 流式細(xì)胞檢測步驟? 吸取3 mL 10%淋巴細(xì)胞分離液于15 mL離心管中，抽取胃癌患者外周血3 mL，沿管壁緩慢加入，淋巴細(xì)胞液位于下層，2500 rpm離心20 min，中間云霧狀層則為淋巴細(xì)胞，吸取加入10 mL離心管中，PBS液洗滌，1500 rpm離心10 min，洗滌2次，沉淀則為淋巴細(xì)胞，棄上水清，RPMI1640重懸細(xì)胞，調(diào)整濃度為2×106/mL。每份標(biāo)本分出試驗管和同型對照管，各400 μL，試驗管加入PE Anti-Human LAP、FITC Anti-Human CD4、APC Anti-Human CD25抗體各5 μL，對照管加入相應(yīng)的同型抗體各5 μL，室溫下，避光、孵育15 min，PBS液洗滌，2100 rpm離心5 min，棄上清，加1%多聚甲醛，400 μL重懸，上流式儀檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行分析，流式細(xì)胞檢測結(jié)果采用Flowjo7.6.1軟件進(jìn)行分析，符合正態(tài)分布的計量資料以（x±s）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，如不符合正態(tài)分布則以[M（P25，P75）]表示，組間比較采用秩和檢驗，相關(guān)性檢驗采用Pearson相關(guān)分析，檢驗水準(zhǔn)為α=0.05，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LAP+CD4+T細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的百分比差異

健康志愿者外周血中LAP+CD4+T細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例為1.76（0.79，2.35）%，見圖1A;胃癌患者外周血中LAP+CD4+T細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例為7.58（6.23，8.22）%，組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Z=6.923，P<0.001）。見圖2B。

2.2 LAP+CD4+ T細(xì)胞與CD4+CD25+ Treg細(xì)胞表達(dá)相關(guān)性

外周血中CD4+CD25+ Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例為13.33（9.78，17.82）%，相關(guān)性分析結(jié)果顯示，胃癌患者外周血中LAP+CD4+ T細(xì)胞與CD4+CD25+ Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞比例呈正相關(guān)（r=0.629，P<0.001）。見圖2。

2.3 LAP+CD4+ T細(xì)胞分布情況與胃癌患者臨床病理因素的關(guān)系

腫瘤TNM分期越晚，LAP+CD4+ T細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞比例越高（P<0.001）;有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者LAP+CD4+ T細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞比例高于無轉(zhuǎn)移者（P<0.001）。見表2。

3 討論

機(jī)體的免疫系統(tǒng)可以識別腫瘤并產(chǎn)生相應(yīng)的免疫應(yīng)答，清除突變的腫瘤細(xì)胞。免疫系統(tǒng)功能的發(fā)揮由精確而復(fù)雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)所控制，任何環(huán)節(jié)發(fā)生改變均會影響免疫功能的正常發(fā)揮，使免疫調(diào)節(jié)失去平衡。人體內(nèi)Treg細(xì)胞在腫瘤免疫逃逸機(jī)制中發(fā)揮了關(guān)鍵的作用。已有研究結(jié)果顯示，乳腺癌、卵巢癌、肺癌、肝癌等多種惡性腫瘤患者外周血及腫瘤組織中的Treg比例升高，并與腫瘤的進(jìn)展程度、預(yù)后呈負(fù)相關(guān)，這些升高的Treg細(xì)胞能抑制機(jī)體的抗腫瘤免疫，降低腫瘤免疫治療的效果[8-9]。LAP+CD4+T細(xì)胞是一種新發(fā)現(xiàn)的Treg細(xì)胞，目前研究多見于風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、急性冠狀動脈綜合征、器官移植排斥反應(yīng)、炎癥性腸病等自身免疫系統(tǒng)疾病[4，10-12]，LAP+CD4+T細(xì)胞能夠抑制免疫反應(yīng)，從而緩解了自身免疫性疾病的進(jìn)展。而關(guān)于LAP+CD4+T細(xì)胞與惡性腫瘤間的關(guān)系，現(xiàn)仍較少見報道。

本研究結(jié)果顯示，胃癌患者外周血LAP+CD4+T細(xì)胞的分布比例要高于與健康志愿者，且與腫瘤的TNM分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，腫瘤分期越晚，LAP+CD4+T細(xì)胞比例越高，特別是有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)的患者外周血LAP+CD4+ T細(xì)胞比例要明顯高于無轉(zhuǎn)移者（P<0.001），這進(jìn)一步證明了LAP+CD4+T細(xì)胞在胃癌患者體內(nèi)起著抑制免疫功能、促進(jìn)腫瘤生長的作用。Lee等[2]的研究顯示，LAP+CD4+T細(xì)胞高表達(dá)TGF-β1和IL-10均為免疫負(fù)性調(diào)控因子，可以抑制免疫細(xì)胞的活化和增殖，降低機(jī)體免疫細(xì)胞的抗腫瘤免疫反應(yīng)[13]，從而使腫瘤細(xì)胞發(fā)生、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移。因此，外周血LAP+CD4+T細(xì)胞分布情況可能成為判斷胃癌患者腫瘤分期及預(yù)后的標(biāo)志物之一。

相關(guān)性分析結(jié)果顯示，胃癌患者外周血中LAP+CD4+T細(xì)胞與CD4+CD25+Treg細(xì)胞的表達(dá)比例呈正相關(guān)。CD4+CD25+Treg細(xì)胞是傳統(tǒng)的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，在以往的研究中胃癌患者外周血及腫瘤組織中CD4+CD25+Treg細(xì)胞比例升高，與預(yù)后密切相關(guān)，起著促進(jìn)腫瘤生長的作用[14]。Zhang等[15]的研究顯示，LAP+CD4+T細(xì)胞可以分泌大量的TGF-β1，而LAP+CD4+T細(xì)胞膜表面結(jié)合的LAP也可與無活性的TGF-β1前體作用，轉(zhuǎn)化成具有活力的 TGF-β1。TGF-β1是誘導(dǎo)CD4+CD25+Treg分化的一種關(guān)鍵細(xì)胞因子，Marie等[16]的研究發(fā)現(xiàn)MFC胃癌細(xì)胞可以通過分泌 TGF-β1誘導(dǎo)CD4+CD25+Treg的分化，進(jìn)而抑制淋巴細(xì)胞的免疫活性，逃脫免疫監(jiān)視。Liu等[17]發(fā)現(xiàn)在胃癌患者體內(nèi)的TGF-β1和Treg的表達(dá)呈正相關(guān)，胃癌細(xì)胞培養(yǎng)上清中的TGF-β1能夠刺激誘導(dǎo) CD4+CD25+初始T細(xì)胞轉(zhuǎn)化為有免疫抑制功能的CD4+Foxp3+Treg。因此，LAP+CD4+T細(xì)胞可能與CD4+CD25+Treg相互聯(lián)系，相互影響，共同促進(jìn)胃癌的進(jìn)展、轉(zhuǎn)移。

綜上所述，胃癌患者外周血中LAP+CD4+T細(xì)胞比例的增加可能抑制了機(jī)體對腫瘤的免疫應(yīng)答反應(yīng)，使腫瘤細(xì)胞發(fā)生“免疫逃逸”，從而促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移。因此，在今后的免疫治療策略中，可以考慮通過抑制LAP+CD4+T細(xì)胞的活性或封閉其部分功能，以提高機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)，為腫瘤的免疫治療提供一種新的策略，但LAP+CD4+T細(xì)胞在胃癌患者機(jī)體內(nèi)如何發(fā)揮其免疫抑制功能尚不明確，還需要更加深入的研究。

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（收稿日期：2020-05-25）