孫克娜綜述，陳英劍審校

1.解放軍聯勤保障部隊第九六〇醫(yī)院 檢驗科，山東 濟南 250031；2.濰坊醫(yī)學院 醫(yī)學檢驗學院，山東 濰坊 261053

惡性腫瘤是人類死亡的主要原因，人口的快速增長和社會經濟的飛速發(fā)展使我國的腫瘤發(fā)生率處于高水平且不斷增長[1-2]。目前大多數惡性腫瘤早期臨床癥狀隱匿，惡性程度高，轉移發(fā)生早，手術根治率低，預后較差。因此，提高腫瘤患者生存率的關鍵是早診斷早治療和探索新的治療途徑?，F階段用于臨床診斷的金標準是病理學檢查，但因檢查費用昂貴，對患者和醫(yī)師要求高，其輔助手段可能會出現穿孔、出血等不良反應，無法用于大規(guī)模初篩[3]。人們在探索治療新方法的道路上逐漸認識到免疫系統(tǒng)對腫瘤的識別、發(fā)生發(fā)展和殺傷起重要作用，腫瘤免疫療法也隨之成為研究熱點。雙陰性T細胞（double negative T cells，DNT）是近年發(fā)現的免疫調節(jié)性T細胞，屬于T淋巴細胞亞群，根據抗原受體組成的不同分為αβT和γδT兩群，其表面既不表達CD4也不表達CD8，但可通過免疫抑制調節(jié)功能殺傷腫瘤細胞，在機體抗腫瘤中發(fā)揮重要作用。我們在此簡要概述DNT細胞在腫瘤免疫調控和臨床應用領域的研究現狀，旨在進一步揭示腫瘤發(fā)生、發(fā)展和遷移的機制，為臨床應用拓寬道路。

1 DNT細胞的來源

T細胞在胸腺發(fā)育過程中經歷了陽性選擇和陰性選擇,只有以適當T細胞受體（T cell recep?tor，TCR）親和力發(fā)生特異性結合才能分化為CD4+或CD8+T細胞，TCR親和力過高可能有助于雙陽性T細胞（double positive T cells，DPT）逃離陰性選擇最終發(fā)育為DNT細胞[4]。但有學者認為DNT細胞在特定條件下可以直接來源于CD4+或CD8+T細胞。Zhao等[5]發(fā)現T細胞凋亡受損時，增殖的CD4+T細胞在共刺激復合物OX40（CD134）/OX40L的輔助下可直接轉化為調節(jié)性DNT細胞以維持外周免疫耐受，轉化得到的DNT細胞表現出高度抗原特異性，可降低免疫系統(tǒng)介導的組織損傷。孫廣永等[6]也發(fā)現OX40/OX40L能夠抑制DNT細胞凋亡，促進其轉化效率，提高其免疫抑制功能。另外，體外活化成熟的鼠CD8+T細胞在高劑量白細胞介素4（IL-4）的刺激下轉變?yōu)镈NT細胞；體內TCR刺激的CD8+T細胞可導致DNT細胞的初始積累[7]。以上結果表明，當體內外免疫條件發(fā)生改變時，不同種類的T細胞可直接或間接通過多種途徑衍生為DNT細胞。隨著對T淋巴細胞亞群研究的不斷深入，現已明確調節(jié)性T細胞具有多種不同的細胞亞型，但DNT細胞的來源及其內在轉化機制尚不完全明晰，主要原因在于不同的DNT細胞可以表達不同的表面標志。

2 DNT細胞在腫瘤治療中可能存在的調控機制

2.1 DNT細胞通過Fas/FasL途徑誘導腫瘤細胞凋亡

表達Fas的靶細胞與FasL結合后，活化并傳遞凋亡信號，誘導靶細胞進入死亡程序，維持著人體細胞凋亡與增殖的平衡，對機體殺傷腫瘤細胞起到了重要的促進作用[8]。胡丕波等[9]采用ELISA方法在DNT細胞上清液中檢測出可溶性FasL（sFasL）高表達。Lu等[10]將DNT細胞與胰腺癌細胞Panc-1共培養(yǎng)后，發(fā)現DNT細胞對Panc-1細胞具有殺傷作用且呈劑量依賴型，進一步采用PCR技術發(fā)現Panc-1細胞表面Fas表達上調，與Chen等[11]關于DNT細胞可抑制胰腺癌生長的研究結果一致。這些結果充分說明了DNT細胞可通過分泌sFasL與胰腺癌細胞表面的Fas特異性結合介導殺傷胰腺癌細胞。

2.2 DNT細胞通過分泌細胞因子作用于腫瘤細胞

陳炯等[12]發(fā)現胰腺癌患者DNT細胞數量與γ干擾素（IFN-γ）含量呈正相關，分泌的IFN-γ隨著DNT細胞數量的減少而減少，IFN-γ的降低影響了機體內細胞因子的抗腫瘤作用，這可能與DNT細胞大量分泌IFN-γ有關。同時，DNT細胞的數量與IL-4含量呈負相關，多數研究已經表明DNT細胞不分泌IL-4，這可能與DNT細胞抑制其他免疫細胞使得分泌IL-4含量下降有關?，F已明確，IL-2可增強DNT細胞對凋亡的抵抗力及其增殖能力[13]；IFN-γ通過促進DNT細胞表達高水平NKG2D和DNAM-1，增強腫瘤細胞對DNT細胞介導細胞毒性的敏感性[14]。

2.3 DNT細胞通過DNAM-1和NKG2D及其配體途徑作用于腫瘤細胞

DNAM-1和NKG2D都是細胞毒性免疫細胞的主要活化受體，在CD8+和CD4+T細胞、NK細胞、DNT細胞上均有表達。Lee等[14]認為IFN-γ可通過誘導NKG2D配體在急性髓細胞白血病（AML）細胞中高表達，使腫瘤細胞對DNT細胞和NK細胞介導的細胞毒性更加敏感，高效發(fā)揮DNT細胞的抗腫瘤活性。Lee等[15]在腫瘤免疫治療中充分證明了通過低劑量硼替佐米來提高NKG2D配體的表達是一種有前途的治療策略。Kearney等[16]發(fā)現，在缺乏DNAM-1配體的情況下，T淋巴細胞亞群對腫瘤的殺傷作用明顯減弱，而CD112和CD155的表達是DNAM-1依賴性殺傷AML細胞所必需的。這與Sanchez-Correa等[17]所證明的DNAM-1是與靶細胞中的CD112和CD155相互作用后參與T淋巴細胞亞群殺傷活性共受體的研究結果相一致。由此可見，T淋巴細胞亞群DNAM-1受體表達降低可能是腫瘤逃逸的另一種機制。

2.4 DNT細胞通過TRAIL通路作用于腫瘤細胞

腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體（TRAIL）通路的抗腫瘤作用受到了國內外學者的重視。趙越[18]等通過檢測DNT細胞培養(yǎng)液發(fā)現了DNT細胞可分泌可溶性TRAIL（sTRAIL），隨后采用免疫組化法觀察到TRAIL-R1在胰腺癌癌旁組織中高表達，在胰腺癌組織中的表達相對較少，在高分化胰腺癌組織中的表達高于低分化組織。這說明受體TRAIL-R表達下調后，同TRAIL結合減少，導致腫瘤細胞凋亡減少，從而促進了腫瘤的發(fā)生發(fā)展。Tawfik等[19]通過胰腺導管腺癌Colo357細胞與γδT細胞共培養(yǎng)發(fā)現腫瘤細胞的裂解不受抗TRAIL抗體或TRAIL-R2-Fc融合蛋白的抑制，但TRAIL-R4會使γδT細胞分泌顆粒酶B減少而環(huán)加氧酶（COX）2的表達水平升高，增強γδT細胞的抗腫瘤細胞毒性。這說明DNT細胞抗腫瘤通路之間相互調節(jié)、相互作用，為調控機制的研究增加了難度。

3 DNT細胞的臨床應用

3.1 DNT細胞在腫瘤診斷中的應用

隨著對DNT細胞作用機制研究的不斷深入，DNT細胞的臨床價值越來越受到重視。在老年晚期結直腸癌患者中發(fā)現，化療前患者T淋巴細胞亞群表達明顯低于健康組，而化療后T淋巴細胞亞群表達明顯升高[20]。這說明患者治療前存在明顯的免疫抑制狀態(tài)，治療前后T淋巴細胞亞群的變化對機體免疫狀態(tài)的反映具有重要的臨床意義和指導作用。B16F10黑色素瘤小鼠體內DNT細胞數量升高且與腫瘤大小呈正相關[21]；肺癌患者和結直腸癌患者外周血中DNT細胞數量均顯著增高[22]。胡小倩等[23]在肺腫瘤、乳腺腫瘤、胃腫瘤、肝腫瘤和腸道腫瘤中，也發(fā)現惡性腫瘤組外周血CD4+/CD8+比值均明顯低于同種良性腫瘤組，DNT細胞比例均明顯高于同種良性腫瘤組。我們可以初步認定DNT細胞比例在惡性腫瘤中呈升高趨勢，提示其是一種潛在的診斷指標。但DNT細胞的具體作用機制尚不明確，因此，我們無法知悉DNT細胞在惡性腫瘤患者體內是抑制免疫功能、殺傷腫瘤細胞還是保護機體免疫功能。同時，對于惡性腫瘤患者DNT細胞的這種變化是否只是一種代償機制或其他原因，有待于進一步探討和證實。

目前多數學者認為，單個腫瘤標志物敏感性和特異性偏低，往往不能滿足臨床需要。因此，將特異性和相關性較好的幾種腫瘤標志物聯合起來檢測，對提高腫瘤的早期診斷有重要價值。有研究發(fā)現[24]，聯合檢測外周血T淋巴細胞亞群、DNT細胞和血清癌胚抗原（CEA）可將肺癌檢出的靈敏度、特異度分別提高至90.8%和98.9%。由此可見，與CEA的聯合診斷具有較大的臨床應用價值。徐志全等[25]通過回顧性分析92例經根治術治療的直腸癌患者，發(fā)現術前T淋巴細胞亞群與CEA雙陽患者的五年生存率最低。通過監(jiān)測惡性腫瘤患者T淋巴細胞亞群及DNT細胞的表達，將進一步評估患者的抗腫瘤免疫功能，進而為診斷腫瘤、判斷患者預后及設計更為切實可行的治療方案提供理論依據，且方法簡便易行，今后有望在基層醫(yī)院得到深入開展。

3.2 DNT細胞在腫瘤治療中的應用

幾十年來，鉑類化療是治療晚期腫瘤惟一有效的全身療法，但化療患者生存率低，僅8～10個月。利用宿主免疫應答來治療癌癥的免疫療法成為國內外學者的研究熱點，抗PD-1免疫檢查點阻斷法（ICB）已獲準用于臨床治療，但并非對所有腫瘤患者都有效。Fang等[26]發(fā)現小鼠體內DNT細胞的過繼轉移顯著抑制晚期肺癌移植瘤的生長，提高了受體小鼠的存活率；在體外離體擴增的DNT細胞對肺癌細胞具有細胞毒性。而在肺組織中DNT細胞可通過分泌高水平IL-10和IFN-γ發(fā)揮對正常肺細胞的保護功能[27]。上述結果充分說明DNT細胞的過繼性細胞治療是很有前途的治療方案。在腫瘤異種移植模型中，抗PD-1可以增加細胞毒性DNT細胞的積累，進一步增強DNT細胞介導的抗腫瘤功能。DNT細胞單獨或聯合抗PD-1過繼細胞治療肺癌具有重要的臨床意義。同時，研究證明DNT細胞的過繼性細胞治療對肝癌患者也具有重要的臨床價值[28]。

化療耐藥是臨床治療晚期腫瘤所面臨的巨大挑戰(zhàn)，目前已發(fā)現有多種形式的細胞療法可用來解決這一難題，但功效低和毒性大阻礙了其在臨床中的廣泛應用。研究發(fā)現，在體外，健康供體來源擴增的DNT細胞可以靶向原代AML細胞，其中包括9例對化療耐藥的患者標本。更重要的是，同種異體DNT細胞不會影響正常造血細胞功能和造血干/祖細胞移植及分化，也不會在受體中引起異種移植物抗宿主病[14,29]。Yao等[30]發(fā)現體外擴增的DNT細胞能夠有效地靶向大量非小細胞肺癌細胞株，并在體內抑制肺癌的生長，而IL-15的加入可以增強DNT細胞的抗腫瘤作用，這是因為IL-15可以上調DNT細胞識別腫瘤的先天性受體，DNT細胞與IL-15聯用可進一步緩解機體化療耐藥。上述研究說明DNT細胞免疫療法對治療靶向化療耐藥和預防腫瘤復發(fā)具有充分的可行性，但DNT細胞在腫瘤中的作用機制尚不完全明確，這也為推動臨床廣泛應用增加了難度。

4 結語

當機體發(fā)生癌變時，免疫系統(tǒng)會及時做出反應。雖然，有研究報道DNT細胞在腫瘤診斷和過繼免疫治療中具有可行性，但下一步需要擴大樣本量，對DNT細胞的臨床價值進行充分驗證。另外，目前的研究大多源于動物模型，相對于復雜的人體系統(tǒng)來說，將DNT細胞的理論研究應用于臨床仍有許多問題亟待解決。DNT細胞免疫調控途徑之間存在相互調節(jié)、相互制約，這為研究免疫治療調控機制帶來挑戰(zhàn)。深入探討DNT細胞與腫瘤免疫之間的關系，有助于進一步揭示腫瘤發(fā)生發(fā)展及遷移機制，從而有利于提高DNT細胞殺傷腫瘤細胞的能力，增強機體的反應性，為DNT細胞臨床免疫治療及預后評估提供新方案。