孫瑾 ，石巖剛 ，董銘心 ，王斌

1.青島大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山東 青島 266071；2.航天科工集團(tuán)七三一醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，北京100074

流感病毒是一種包膜病毒，屬于正黏病毒科，其基因組包含8個(gè)片段，包括表面抗原神經(jīng)氨酸酶（neuraminidase，NA）和血凝素（hemagglutinin，HA）、3種聚合酶（polymerase B1，PB1；polymerase B2，PB2；polymerase A，PA）、核蛋白（nucleopro?tein，NP）、基質(zhì)蛋白（matrix protein）及非結(jié)構(gòu)蛋白（non-structure protein），是分節(jié)段的單負(fù)鏈RNA病毒。流感病毒的每個(gè)片段編碼1～2個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白，每個(gè)片段的3'和5'端是病毒的包裝信號(hào)[1]，包括開放讀框（open reading frame，ORF）的最兩端及 3'、5'端的非編碼區(qū)（noncoding region，NCR）。根據(jù)內(nèi)部抗原核蛋白的不同，流感病毒可分為甲、乙、丙共3型，其中表面抗原HA有18個(gè)亞型，NA有11個(gè)亞型[2]，又將甲型流感病毒分為若干亞型。研究表明，流感病毒的RNA聚合酶不具有校正作用[3]，因此RNA復(fù)制過程中易發(fā)生點(diǎn)突變而導(dǎo)致抗原漂移，使得疫苗對(duì)其失效，最終引發(fā)小范圍的流感流行。而當(dāng)2種或2種以上的甲型流感病毒感染同一宿主時(shí)，容易發(fā)生2種病毒的基因組重配，形成一種與之前流行株結(jié)構(gòu)不同的新亞型，人群中缺乏對(duì)該病毒的免疫力，由此而發(fā)生流感大暴發(fā)[4]。

接種疫苗是預(yù)防流感的最經(jīng)濟(jì)有效的醫(yī)學(xué)措施[5]，而研制安全性好、能夠保留病毒所有抗原以激發(fā)機(jī)體全面有效的免疫反應(yīng)的活病毒疫苗是科研人員的研究目標(biāo)。隨著反向遺傳學(xué)技術(shù)的逐漸成熟，其在病毒活疫苗的研發(fā)過程中也發(fā)揮著越來越大的作用，使病毒包裝更加簡便，減毒方法更加新穎多元。在此，我們簡要介紹反向遺傳學(xué)及技術(shù)，并對(duì)其在流感病毒活疫苗研究中的應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 反向遺傳學(xué)在病毒研究中的應(yīng)用

經(jīng)典遺傳學(xué)是從生物的表型、性狀到遺傳物質(zhì)來研究生命的發(fā)展規(guī)律，而反向遺傳學(xué)則是從生物的遺傳物質(zhì)入手，在獲得生物體基因組全部序列的基礎(chǔ)上，通過對(duì)靶基因進(jìn)行必要的加工和修飾（如突變、插入或缺失等），再組成含有生物體所必需元件的基因組，讓其裝配出具有生命活性的個(gè)體，研究生物體基因組的結(jié)構(gòu)與功能，以及這些修飾可能對(duì)生物體的表型、性狀的影響等方面的內(nèi)容，與之相關(guān)的一系列技術(shù)稱為反向遺傳學(xué)技術(shù)。反向遺傳學(xué)技術(shù)通過反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）獲得RNA病毒的全部cDNA序列，克隆于合適的載體上，構(gòu)建出含有病毒全長cDNA序列的質(zhì)粒以轉(zhuǎn)染細(xì)胞，包裝出具有活性的病毒顆粒。此技術(shù)實(shí)現(xiàn)了病毒的包裝以及在體外對(duì)病毒遺傳物質(zhì)的修飾，推進(jìn)了病毒結(jié)構(gòu)蛋白功能、致病機(jī)制的研究及獲取重組病毒疫苗。

由于正鏈RNA病毒基因組也可作為mRNA，因此其具有感染性，直接轉(zhuǎn)染病毒cDNA即可獲得完整的具有感染性的病毒顆粒，因此反向遺傳學(xué)技術(shù)最初成功用于正鏈RNA病毒，如Qβ噬菌體[6]、脊髓灰質(zhì)炎病毒[7]。而負(fù)鏈RNA病毒由于單獨(dú)基因組不具有感染性，其最小感染單位是基因組與核蛋白及RNA聚合酶所組成的核糖核蛋白（ribonucleoprotein，RNP），且基因組與 mRNA 互補(bǔ)，易發(fā)生雜交而干擾基因組RNA與RNP的裝配，從而導(dǎo)致操作更加復(fù)雜。1994年Schnell等使細(xì)胞預(yù)先表達(dá)狂犬病毒核蛋白與聚合酶蛋白后，將含有病毒全長反義基因組（正鏈RNA）的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細(xì)胞，獲得了感染性病毒顆粒，最先利用反向遺傳學(xué)技術(shù)在不分節(jié)段的負(fù)鏈RNA病毒狂犬病毒中實(shí)現(xiàn)了病毒的成功拯救[8]。受此思路啟發(fā)，隨后連續(xù)成功拯救麻疹病毒[9]、仙臺(tái)病毒[10]、水泡口炎病毒[11]。1996年第一個(gè)分節(jié)段負(fù)鏈RNA病毒布尼亞病毒拯救成功[12]，為流感病毒的拯救提供了可能性。

2 流感病毒反向遺傳學(xué)技術(shù)的發(fā)展

Luytjes等[13]于1989年首次借助輔助病毒拯救出了流感病毒。他們將構(gòu)建的含有氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶（chloramphenicol acetyltransferase，CAT）的質(zhì)粒以體外轉(zhuǎn)錄的方式獲得RNA，并將其與純化的流感病毒核蛋白與聚合酶于體外孵育成RNP樣粒子后轉(zhuǎn)染MDCK細(xì)胞，在輔助病毒感染的作用下，成功拯救出含有外源基因CAT的流感病毒，且能順利傳代。

Neumann等[14]在1999年用12/17質(zhì)粒系統(tǒng)以全部克隆的cDNA獲得了流感病毒，這種方法所得病毒滴度高，使得引入任意定向突變成為可能，且不依賴于輔助病毒，但需要一套專門表達(dá)病毒核蛋白與聚合酶的質(zhì)粒系統(tǒng)，所需質(zhì)粒較多。2000年，Hoffmann等[15]建立了一套八質(zhì)粒系統(tǒng)以獲得流感病毒，該系統(tǒng)運(yùn)用了雙向RNA聚合酶Ⅰ/Ⅱ元件，能夠從cDNA中表達(dá)結(jié)構(gòu)蛋白且獲得病毒RNA（vRNA），大大減少了質(zhì)粒數(shù)量，更加方便快捷，且該技術(shù)目前運(yùn)用最為廣泛成熟。此后，Neumann等[16]在2005年對(duì)八質(zhì)粒系統(tǒng)進(jìn)行了改進(jìn)，構(gòu)建了可以合成流感病毒8個(gè)節(jié)段vRNA的單質(zhì)粒，該質(zhì)粒合并表達(dá)病毒核蛋白及聚合酶的質(zhì)粒亦可成功拯救病毒，這個(gè)系統(tǒng)只需3個(gè)質(zhì)粒，但質(zhì)粒構(gòu)建難度較大，目前應(yīng)用并不太廣泛，同時(shí)該系統(tǒng)研究中出現(xiàn)一種特殊情況，該質(zhì)粒單獨(dú)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，在沒有聚合酶及核蛋白表達(dá)質(zhì)粒的情況下，僅有vRNA也包裝出了流感病毒，其機(jī)制尚不清楚，有待研究。

2018年周珊珊等[17]在流感病毒八質(zhì)粒系統(tǒng)的基礎(chǔ)上改進(jìn)得到兩質(zhì)粒系統(tǒng)，成功裝配流感病毒H1N1。他們將流感病毒的PB1、PB2、PA、NP、M、NS等6個(gè)內(nèi)部基因的雙向轉(zhuǎn)錄表達(dá)元件克隆進(jìn)同一載體，獲得pfastbacΔplhHTBP6質(zhì)粒，將表面基因HA、NA雙向轉(zhuǎn)錄表達(dá)元件克隆進(jìn)同一載體獲得pENTR-1AP2質(zhì)粒，2質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染COS-1和MDCK共培養(yǎng)細(xì)胞層包裝出流感病毒。該系統(tǒng)病毒包裝效率較八質(zhì)粒系統(tǒng)更高且更加簡便快捷，為流感疫苗的研發(fā)提供了新思路。

3 反向遺傳學(xué)技術(shù)在流感病毒活疫苗研究中的應(yīng)用

3.1 利用基因重組方法獲得減毒活疫苗

基于流感病毒八質(zhì)粒系統(tǒng)的成熟應(yīng)用及其基因組分節(jié)段的特點(diǎn)，研究人員常選擇對(duì)同亞型或不同亞型病毒株的基因片段進(jìn)行重組或重排，以獲得毒力減弱且多價(jià)的減毒疫苗株。Gao等[18]在2009年利用反向遺傳學(xué)技術(shù)互換了H1N1（PR8毒株）的HA與NS片段的包裝序列，即將HA與NS基因3'與5'端的包裝序列分別放置在NS與HA開放讀框兩側(cè)，成功拯救了帶有嵌合片段的重組病毒。該病毒生長良好，且與野生型病毒感染同一宿主時(shí)仍具有重配能力。為解決多病毒基因重配問題，他們借鑒前人研究在包裝序列中引入沉默突變消除了原始包裝序列，使2個(gè)嵌合片段攜帶特異性包裝序列，由此重組病毒喪失了基因重配能力，增加了該疫苗株的安全性。對(duì)不同亞型之間的基因重組也在不斷探索中，2013年Lindomar等[19]構(gòu)建了一種可針對(duì)H5N1和H9N2的重組流感病毒疫苗株。他們將NEP結(jié)構(gòu)域從H9N2病毒的NS片段中去除，并用H5N1病毒的HA片段取代，H9N2的NS1和H5N1的HA被口蹄疫病毒（FMDV）的2A自切割位點(diǎn)分隔，以允許2種蛋白共線性表達(dá)。然后將NEP克隆到H9N2 PB1片段下游，兩者之間仍由FMDV 2A自切割位點(diǎn)分隔。表達(dá)H5N1 HA的重組H9N2病毒可為小鼠和雪貂提供針對(duì)H5N1和H9N2的完全保護(hù)，同樣可以抵抗?jié)撛诹餍械腍9病毒。

2016年Nogales等基于重組PR8的M、NS片段建立了更加安全而有效的流感減毒活疫苗[20]。流感病毒第7、8節(jié)段的M、NS基因分別編碼2種多肽M1、M2及NS1、NEP，且M1、M2共用N端前9個(gè)氨基酸，NS、NEP共用N端前10個(gè)氨基酸[21]。他們利用這一特點(diǎn)，在M、NS片段中分別加入1型豬腸病毒（PTV-1）的2A自切割多肽位點(diǎn)，將M1/M2、NS/NEP的OFR分開。根據(jù)2A多肽所插入的片段，將3株不同的重組病毒分別命名為Ms、NSs、Ms/NSs，且3株病毒均被成功拯救。經(jīng)過一系列細(xì)胞與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明3株重組病毒的毒力均低于野生型PR8病毒，且Ms、Ms/NSs這2株含有M分離片段的毒株的免疫性與保護(hù)性均優(yōu)于先前所構(gòu)建的PR8溫度敏感型活疫苗[22]。

3.2 通過改造NS基因獲得減毒活疫苗

NS蛋白由NS1與NEP蛋白構(gòu)成，其中NS1是流感病毒拮抗宿主先天性免疫Ⅰ型干擾素應(yīng)答的功能性蛋白[23-24]，NEP是病毒復(fù)制所必需的蛋白[25]，因此NS蛋白成為減毒活疫苗研究中的理想靶點(diǎn)。2007年Baskin等[26]通過反向遺傳學(xué)對(duì)NS蛋白進(jìn)行截短，只保留了其1～126位氨基酸殘基，構(gòu)建了一株重組H1N1減毒活疫苗。這株疫苗能夠引起有效的體液免疫與細(xì)胞免疫，使宿主動(dòng)物對(duì)野生型H1N1獲得有效的免疫力。2014年No?gale等[27]通過全基因合成對(duì)H1N1（PR8毒株）的NS片段進(jìn)行多位點(diǎn)同義突變，實(shí)現(xiàn)了NS蛋白的密碼子去優(yōu)化，產(chǎn)生了一株重組H1N1（PR8毒株）。研究結(jié)果表明，對(duì)NS蛋白進(jìn)行密碼子去優(yōu)化后，病毒毒力有效減弱，且能夠使宿主獲得對(duì)同源及異源流感病毒的保護(hù)性免疫。

3.3 利用遺傳密碼擴(kuò)充獲得減毒活疫苗

研究表明，終止密碼子UGA和UAG在生命進(jìn)化過程中發(fā)生了變義。1986年Chambers等[28]發(fā)現(xiàn)終止密碼子UGA編碼第21種天然氨基酸硒半胱氨酸，這種氨基酸能在古細(xì)菌、哺乳動(dòng)物如小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)[29-30]；2002年發(fā)現(xiàn)終止密碼子UGA編碼第22種天然氨基酸吡咯賴氨酸，這種氨基酸是在甲烷八疊球菌屬巴氏細(xì)菌的特殊環(huán)境中編碼出來的[31]。在RNA翻譯成蛋白質(zhì)過程中，氨酰tRNA合成酶使對(duì)應(yīng)的tRNA氨?；?，攜帶上其對(duì)應(yīng)的氨基酸。隨后氨?；膖RNA對(duì)應(yīng)mRNA上特定密碼子，把氨基酸送入核糖體內(nèi)以添加到正在增長的肽鏈中。遺傳密碼擴(kuò)充技術(shù)就是通過在生命體內(nèi)引入與非天然氨基酸對(duì)應(yīng)的tRNA及tRNA合成酶，并使它們與特殊的密碼子對(duì)應(yīng)，從而將非天然氨基酸通過基因表達(dá)結(jié)合到蛋白質(zhì)中[32]。

Si等[33]通過穩(wěn)定表達(dá)吡咯賴氨酸正交翻譯系統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系，獲得了含有終止密碼子UAG的復(fù)制缺陷型流感病毒，該病毒株可在轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系中穩(wěn)定復(fù)制，但在普通細(xì)胞中無法復(fù)制，使得作為活疫苗的安全性大大提高。結(jié)果表明，遺傳密碼擴(kuò)充技術(shù)可用于流感減毒活疫苗的研發(fā)，該病毒疫苗免疫動(dòng)物可對(duì)不同流感病毒產(chǎn)生有效的體液、黏膜和細(xì)胞免疫應(yīng)答；另外該疫苗還具有治療作用，可與感染的野生毒株重組后導(dǎo)致野生毒株的復(fù)制能力消失。該方法為疫苗研發(fā)提供了新思路，是疫苗研究中的一大突破。

4 結(jié)語

減毒活疫苗具有高度的免疫原性，可誘導(dǎo)安全有效的體液、黏膜和細(xì)胞免疫，具有良好的保護(hù)作用[34]。反向遺傳學(xué)技術(shù)加速了活病毒疫苗的研發(fā)進(jìn)程，它能夠明確靶向改造病毒的某個(gè)蛋白，截短或突變能夠拮抗先天性免疫的NS[27,35]，突變M蛋白以及利用遺傳密碼擴(kuò)充對(duì)病毒的復(fù)制能力進(jìn)行限制[33,36]，以降低病毒的毒力，也能夠通過基因重組構(gòu)建多價(jià)疫苗并解決容易發(fā)生基因重配的問題[18-19]，從而達(dá)到更加安全、有效的目的。此外，反向遺產(chǎn)學(xué)技術(shù)能夠在病毒的入侵、復(fù)制、致病力、調(diào)控機(jī)制等各方面研究中發(fā)揮重大作用，從而幫助緊急應(yīng)對(duì)新型變異病毒的出現(xiàn)，進(jìn)而促進(jìn)疫苗的研發(fā)。

綜上，我們討論了反向遺傳學(xué)技術(shù)在流感減毒活疫苗研究中的應(yīng)用。無論是基因重組還是遺傳密碼擴(kuò)充，人們都是借助這項(xiàng)技術(shù)有目的地對(duì)流感病毒基因組進(jìn)行改造，以獲得有效的減毒活疫苗。反向遺傳學(xué)技術(shù)已經(jīng)越來越成熟，在生命科學(xué)研究中的應(yīng)用也越來越廣泛，尤其在RNA病毒的研究及疫苗研發(fā)中做出了巨大貢獻(xiàn)。我們有理由相信，這項(xiàng)技術(shù)能夠幫助減毒活疫苗研發(fā)取得更大的突破。