丁萌楠，宋倫

軍事醫(yī)學(xué)研究院 軍事認(rèn)知與腦科學(xué)研究所，北京 100850

間隙連接（gap junction，GJ）是細(xì)胞間通道，由被稱為連接蛋白（connexin，Cx）的跨膜蛋白的6個亞基形成，介導(dǎo)相鄰細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)之間的直接通訊。細(xì)胞間的這些通道允許細(xì)胞之間交換小分子（<1000 Da），包括離子、氨基酸、核苷酸、代謝物和第二信使物質(zhì)（如鈣、葡萄糖、cAMP、cGMP、IP3）等。間隙連接介導(dǎo)的間隙連接通訊（gap junctional intracellular communication，GJIC）在組織穩(wěn)態(tài)、細(xì)胞生長和分化等生物過程中起主要作用。GJIC可在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后、翻譯后等多個水平被調(diào)控，并且細(xì)胞間隙連接可以在各種刺激下被精細(xì)調(diào)節(jié)，包括膜電位、細(xì)胞鈣濃度和pH值的變化以及連接蛋白的磷酸化狀態(tài)。

1 Cx43的結(jié)構(gòu)與功能

Cx基因是一個多基因家族，在人類基因譜中有21位成員，擁有一個長內(nèi)含子（6～8 kb）及2個外顯子，外顯子1主要包含5'非編碼區(qū)，而所有的蛋白編碼序列及3'非編碼區(qū)均集中在外顯子2中。編碼間隙連接蛋白43（Cx43）的基因位于染色體6q22.3，其mRNA全長約3.1 kb。Cx43蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中合成，并通過高爾基體轉(zhuǎn)運(yùn)至質(zhì)膜。連接蛋白是具有細(xì)胞內(nèi)N端和C端的四跨膜（TM）結(jié)構(gòu)域蛋白。2個細(xì)胞外環(huán)（E1和E2）分別連接TM1-TM2和TM3-TM4，而TM2和TM3之間的區(qū)域位于細(xì)胞內(nèi)，并形成胞內(nèi)環(huán)（CL）[1]。Cx43蛋白的N端較短且保守；C端較長（約150個氨基酸殘基），含有眾多絲/蘇氨酸、酪氨酸殘基，是多種蛋白激酶/磷酸酶、信號通路的作用位點(diǎn)。未成熟的Cx43蛋白最初被翻譯為40 kD的蛋白鏈，其在合成后不久被磷酸化。蛋白質(zhì)的磷酸化狀態(tài)在通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體運(yùn)輸?shù)劫|(zhì)膜時發(fā)生變化，最終形成間隙連接通道。Cx43在SDS-PAGE中遷移為多條帶，通常標(biāo)記為P0、P1和P2，代表不同的磷酸化狀態(tài)[2]。

間隙連接通道具有相似的整體結(jié)構(gòu)，但其通透性和門控特性取決于連接蛋白同工型及其翻譯后修飾。Cx在大多數(shù)組織和器官中表達(dá)，其中Cx43的表達(dá)最為廣泛且研究最多。Cx43在廣泛的生理過程中起關(guān)鍵作用。Cx43調(diào)節(jié)各種器官包括骨骼[3]、大腦[4]、骨髓[5]和心臟[6]的發(fā)育過程，也在心肌細(xì)胞和平滑肌增殖分化[7-8]、神經(jīng)元信號傳導(dǎo)[9]中發(fā)揮重要作用，還參與內(nèi)分泌腺和外分泌腺的激素分泌和功能、聽覺功能[10]、傷口愈合[11]、精子發(fā)生、類固醇生成、卵泡發(fā)育、排卵和黃體形成等生殖功能[12-13]，以及組織炎癥和組織修復(fù)等免疫調(diào)節(jié)功能[14]。此外，Cx43的表達(dá)與癌癥復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移擴(kuò)散及不良預(yù)后相關(guān)[15]。同時，Cx43還具有膜通道功能非相關(guān)的細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)能力[16]。

2 Cx43的表達(dá)調(diào)控

2.1 Cx43基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)調(diào)控

Cx43基因啟動子區(qū)域存在AP1、SP1及Smad等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。生物鐘基因Rev-erbα可以與Cx43基因啟動子區(qū)的SP1結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，影響Cx43的活性和周期震蕩變化，參與膀胱容量的晝夜變化[17]。蛋白酶激活受體1（PAR-1）作為介導(dǎo)黑色素瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素，可通過介導(dǎo)AP1和SP1轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合與Cx43基因啟動子進(jìn)而調(diào)節(jié)Cx43表達(dá)并影響黑色素瘤的轉(zhuǎn)移[18]。轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）和骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）可以激活Smad而影響卵巢部位顆粒細(xì)胞中Cx43的表達(dá)及細(xì)胞間通訊[19]。Cx43的轉(zhuǎn)錄表達(dá)也受Wnt信號途徑調(diào)控，在心肌或骨骼肌細(xì)胞，Wnt信號通路的激活可通過調(diào)節(jié)β鈣黏蛋白的轉(zhuǎn)錄活性進(jìn)而誘導(dǎo)Cx43表達(dá)和間隙連接通道形成[20]。此外，激素也可以調(diào)節(jié)Cx43的表達(dá)，在Cx43基因啟動子區(qū)域有雄激素受體（AR）和糖皮質(zhì)激素受體（GR）等多種激素受體反應(yīng)元件，因而雌激素可以直接通過ER-α上調(diào)Cx43[21]，也可以通過上調(diào)c-fos和cjun mRNA的表達(dá)而間接上調(diào)Cx43。高水平的雄激素可通過雄激素受體途徑降低Cx43表達(dá)并削弱人顆粒細(xì)胞之間的間隙連接細(xì)胞間通訊，最終導(dǎo)致卵泡生成受損[22]。

2.2 Cx43蛋白的磷酸化修飾反應(yīng)調(diào)控

縫隙連接蛋白的翻譯后修飾反應(yīng)以磷酸化為典型特征，且磷酸化與間隙連接通訊的調(diào)控有關(guān)，包括細(xì)胞內(nèi)連接蛋白運(yùn)輸、連接子組裝和拆卸、連接蛋白降解以及間隙連接通道的門控等。

Cx43磷酸化具有復(fù)雜性和多樣性。Cx43的C端區(qū)域有19個絲氨酸和2個酪氨酸殘基為磷酸化位點(diǎn)，它們能夠在蛋白激酶催化作用下實(shí)現(xiàn)磷酸化修飾反應(yīng)并調(diào)節(jié)間隙連接的穩(wěn)定性和功能。參與Cx43磷酸化修飾反應(yīng)的信號分子包括蛋白激酶C（PKC）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）、Src蛋白以及連接蛋白伴侶（例如ZO-1和 tublin）等[2]。Ser262、Ser368、Ser279和 Ser282的磷酸化修飾反應(yīng)已被確定與PKC、MAPK和PKA途徑活化相關(guān)；并且一種激酶可以催化一個以上的位點(diǎn)發(fā)生磷酸化反應(yīng)，而一個位點(diǎn)也可以同時被多種激酶和信號傳導(dǎo)途徑催化而實(shí)現(xiàn)磷酸化反應(yīng)。AKT可介導(dǎo)Ser373位點(diǎn)的磷酸化修飾反應(yīng)，這一反應(yīng)具有分子“開關(guān)”功能，可促使Cx43失去與ZO-1之間的相互作用，進(jìn)而增加間隙連接通訊。Cx43在Ser373位點(diǎn)的磷酸化修飾反應(yīng)在正常心臟組織中低水平維持，在缺氧應(yīng)激后急劇增加，Ser373位點(diǎn)的磷酸化在缺氧時增加了心肌細(xì)胞對損傷的反應(yīng)并維持了細(xì)胞間通訊[23]。PKCε的表達(dá)與Ser262位點(diǎn)的磷酸化有關(guān)，研究表明Ser262位點(diǎn)的磷酸化反應(yīng)可表現(xiàn)出心臟對缺血的適應(yīng)反應(yīng)，并起到保護(hù)作用[24]。當(dāng)皮膚受到損傷后，AKT介導(dǎo)Ser373位點(diǎn)的磷酸化反應(yīng)水平增加可能影響角質(zhì)形成細(xì)胞的激活和遷移，從而促進(jìn)傷口愈合[23]。12-0-十四烷（酰）-13-乙酯（TPA）和表皮生長因子（EGF）可激活ERK1/2介導(dǎo)Ser279/Ser282位點(diǎn)的磷酸化修飾反應(yīng)[2]，肌醇1，4，5-三磷酸受體（IP3R）可通過影響心室肌細(xì)胞Ser279/Ser282位點(diǎn)的磷酸化修飾反應(yīng)進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞間的通訊[25]。Cx43的另一個特殊磷酸化位點(diǎn)是Ser368，可通過PKC活化實(shí)現(xiàn)磷酸化修飾反應(yīng)，高劑量胰島素可通過活化PKC并磷酸化Cx43從而抑制血管平滑肌細(xì)胞的間隙連接通訊[26]。生長因子（如VEGF）可以激活PKC和MAPK并分別介導(dǎo) Ser255、Ser262、Ser279/Ser282和 Ser368位點(diǎn)的磷酸化修飾反應(yīng)，進(jìn)而誘導(dǎo)GJs內(nèi)在化[27]。酪蛋白激酶1（CK1）誘導(dǎo)的Ser325、Ser328或Ser330位點(diǎn)的磷酸化修飾反應(yīng)可調(diào)節(jié)正常大鼠腎細(xì)胞中Cx43間隙連接組裝[1]。Src激酶可激活Tyr247和Tyr265位點(diǎn)的磷酸化修飾反應(yīng)，并導(dǎo)致間隙連接通訊的下調(diào)和Cx43蛋白表達(dá)水平的降低[28]。Src還可以激活其他激酶（包括ERK1/2、PKC和MAPK），從而影響通道門控和間隙連接穩(wěn)定性。Src激活PKC介導(dǎo)Cx43的磷酸化修飾反應(yīng)可導(dǎo)致GJs的減少和Cx43半衰期的縮短。針對睪丸癌的藥物吉非替尼通過抑制Src和PKC表達(dá)而誘導(dǎo)GJIC表達(dá)水平增強(qiáng)[29]。Na/K-ATPase（ATP1A1）通過Src-EGFR-ERK1/2-CREB途徑調(diào)節(jié)睪丸支持細(xì)胞緊密連接和間隙連接[30]。ZO-1與GJ相互作用，并與GJ斑塊的外圍結(jié)合而產(chǎn)生新合成通道。ZO-1與Cx43的C端區(qū)域相互作用會改變間隙連接大小。機(jī)體受到損傷或缺氧會誘導(dǎo)AKT活化并介導(dǎo)Ser373位點(diǎn)的磷酸化修飾反應(yīng)，這可導(dǎo)致ZO-1從Cx43 GJs分離，因此Ser373位點(diǎn)的磷酸化/去磷酸化修飾反應(yīng)平衡可調(diào)節(jié)Cx43/ZO-1相互作用[23]。

2.3 Cx43蛋白的泛素化與降解

Cx43是不穩(wěn)定蛋白，可通過溶酶體-自噬途徑與泛素化-蛋白酶途徑實(shí)現(xiàn)降解。其中，溶酶體主要在破壞內(nèi)化的間隙連接及降解從早期分泌泡中傳遞來的Cx43[31]，其中肝細(xì)胞生長因子調(diào)節(jié)的酪氨酸激酶底物（Hrs）和腫瘤易感基因101（Tsg101）是Cx43向溶酶體運(yùn)輸?shù)年P(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，它們還是轉(zhuǎn)運(yùn)所需的內(nèi)體分選復(fù)合物（ESCRT）的組成部分，二者可協(xié)同結(jié)合泛素化修飾的Cx43進(jìn)而調(diào)節(jié)其經(jīng)溶酶體途徑的降解[32]。泛素化-蛋白酶體降解途徑主要介導(dǎo)降解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中新合成的Cx43。CIP75是介導(dǎo)Cx43進(jìn)入蛋白酶體降解途徑的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，它可與Cx43相互作用并促進(jìn)Cx43與蛋白酶體結(jié)合而實(shí)現(xiàn)降解反應(yīng)[33]。此外，在缺血性心肌細(xì)胞中，Cx43的降解是通過自噬途徑介導(dǎo)發(fā)生，這一過程需要Cx43的泛素化以及p62和表皮生長因子受體底物15（Eps15）的協(xié)同參與[34]。研究發(fā)現(xiàn)，泛素化在間隙連接斑（gap junction plaque，GJP）的內(nèi)化反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。E3泛素連接酶Nedd4是第一個被發(fā)現(xiàn)與Cx-43泛素化修飾反應(yīng)相關(guān)的酶，其與Cx43 C端上富含脯氨酸（PY）的基序結(jié)合并介導(dǎo)靜息狀態(tài)下Cx43的泛素化和降解反應(yīng)[35]。在缺血狀態(tài)下，Nedd4基因敲除未對Cx43水平產(chǎn)生任何顯著影響，這表明還存在除Nedd4外的其他E3泛素化連接酶介導(dǎo)Cx-43的泛素化修飾反應(yīng)。Smad泛素化調(diào)節(jié)因子2（Smurf2）是調(diào)節(jié)Cx43泛素化修飾反應(yīng)的另一個E3泛素化連接酶，可介導(dǎo)TPA刺激作用下Cx43的磷酸化和泛素化降解反應(yīng)，阻斷Smurf2表達(dá)可顯著降低CX-43降解并可導(dǎo)致間隙連接斑的增加及間隙連接細(xì)胞間的通訊增加[36]。E3泛素連接酶TRIM21與Cx43的相互作用可調(diào)節(jié)質(zhì)膜和GJIC上Cx43的水平，研究發(fā)現(xiàn)這種相互作用需要Cx43磷酸化的誘導(dǎo)，從而促進(jìn)泛素化和蛋白水解降解GJV。

3 Cx43在溫度變化中的反應(yīng)

研究表明，Cx43是溫度響應(yīng)性信號蛋白。寒冷應(yīng)激條件下，Cx43在米色脂肪和棕色脂肪細(xì)胞中的表達(dá)水平顯著上調(diào)，細(xì)胞間通訊增加，這是通過交感神經(jīng)元活化以及脂肪組織中β3腎上腺素能受體激活而介導(dǎo)實(shí)現(xiàn)，并且敲除Cx43的小鼠不耐寒[38-39]。此外，冷暴露的大鼠，腎上腺嗜鉻細(xì)胞間隙連接通訊增強(qiáng)且與Cx43的增加相一致，間隙連接偶聯(lián)的這種上調(diào)導(dǎo)致嗜鉻細(xì)胞之間出現(xiàn)牢固的電偶合，從而允許在偶聯(lián)細(xì)胞之間傳遞動作電位。冷應(yīng)激暴露會刺激腎上腺髓質(zhì)和藍(lán)斑的兒茶酚胺能系統(tǒng)，而嗜鉻細(xì)胞之間間隙連接通訊的上調(diào)可能是一種使腎上腺髓質(zhì)系統(tǒng)敏感的內(nèi)源性機(jī)制[40]。冬眠過程中倉鼠心肌細(xì)胞中的Cx43間隙連接蛋白增加可能是一種代償性反應(yīng)，以便在生理?xiàng)l件下保持足夠的縫隙連接通訊[41]。Cx43的過表達(dá)可以防止心肌細(xì)胞冷保存誘導(dǎo)的損傷，冷應(yīng)激誘導(dǎo)Cx43在Ser262位點(diǎn)的磷酸化修飾反應(yīng)可能在供體心臟的保存中起重要作用[42]。

高溫應(yīng)激條件下，Cx43表達(dá)水平下調(diào)。早先研究表明，熱應(yīng)激可增加心肌細(xì)胞間隙連接蛋白的水解[43]。大鼠牙髓細(xì)胞的熱暴露反應(yīng)中也發(fā)現(xiàn)了間隙連接蛋白Cx43的迅速降解反應(yīng)，并在后續(xù)6 h內(nèi)可恢復(fù)到正常水平，表明牙髓細(xì)胞具有包括熱激蛋白（HSP）在內(nèi)的保護(hù)因子，并且在熱暴露后可恢復(fù)細(xì)胞間通訊能力[44]。肌腱細(xì)胞的熱應(yīng)激反應(yīng)研究表明GJIC參與了熱應(yīng)激誘導(dǎo)的分解代謝和促炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)[45]。此外，熱應(yīng)激可增強(qiáng)Cx43的磷酸化修飾反應(yīng)，從而導(dǎo)致GJIC功能喪失，并且在致癌過程中加劇了高溫致死性。在牛卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合物（COC）的熱應(yīng)激反應(yīng)研究中，發(fā)現(xiàn)COC中間隙連接的通透性主要受ERK1/2依賴性磷酸化修飾反應(yīng)調(diào)節(jié)，同時伴隨Cx43磷酸化修飾水平的上調(diào)。所以，熱應(yīng)激可能通過COC中各種激酶影響連接蛋白多個磷酸化位點(diǎn)上的修飾反應(yīng)，進(jìn)而調(diào)節(jié)間隙連接通訊[46]。

4 結(jié)語

我們已經(jīng)對Cx43連接蛋白的各種表達(dá)調(diào)控以及它的降解途徑有了較為清晰的認(rèn)識，但目前對于Cx43不同內(nèi)在化機(jī)制的調(diào)控仍未全面了解。間隙連接結(jié)構(gòu)響應(yīng)各種特定信號的快速轉(zhuǎn)換，細(xì)胞可以迅速改變與相鄰細(xì)胞間信號傳導(dǎo)和通訊，冷熱刺激通過間隙連接組成蛋白Cx43的表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)，從而參與GJIC的調(diào)控。冷刺激通過增加Cx43的表達(dá)，以便在特殊條件下保持足夠的縫隙連接通訊間隙。熱應(yīng)激會引起Cx的下調(diào)，導(dǎo)致GJIC功能喪失進(jìn)而影響細(xì)胞功能。機(jī)體對于冷熱刺激會出現(xiàn)適應(yīng)性反應(yīng)，冷熱刺激后Cx43的表達(dá)改變可能是機(jī)體面對外來刺激的生理或病理反應(yīng)。但是冷熱刺激對于不同組織器官的具體調(diào)控機(jī)制還未完全明確，通過連接蛋白的特異性敲除或修飾，我們能夠在未來闡明它在不同組織器官中的特定作用，這可能會成為Cx43與溫度相關(guān)研究的新方向以及疾病相關(guān)的藥理學(xué)靶標(biāo)。