張弛 ，金虹 ，彭雙清 ，2，郭家彬 ，2

1.解放軍疾病預(yù)防控制中心，北京 100071；2.軍事科學(xué)院 軍事醫(yī)學(xué)研究院，北京 100850；3.解放軍73集團(tuán)軍醫(yī)院，福建 廈門(mén) 361000

肝臟是外源性化合物代謝的主要場(chǎng)所，也是化學(xué)物及其代謝產(chǎn)物毒作用的重要靶器官。據(jù)估計(jì)，超過(guò)1100種常用化學(xué)物可誘導(dǎo)肝損傷，其中包括一些常用的化學(xué)藥物、中草藥和膳食補(bǔ)充劑等[1]。化學(xué)性肝損傷造成的肝臟疾病范圍廣，其中藥物性肝損傷是引起急性肝功能衰竭死亡的主要原因，給患者家庭以及制藥和化工等企業(yè)帶來(lái)巨大的風(fēng)險(xiǎn)和經(jīng)濟(jì)損失[2-3]。傳統(tǒng)的肝毒性評(píng)估主要依賴于不同的動(dòng)物試驗(yàn)，雖然動(dòng)物試驗(yàn)?zāi)茉谝欢ǔ潭壬戏从郴瘜W(xué)物在人體中的肝毒性，但也存在實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)、費(fèi)用高、通量低等諸多局限。此外，在臨床前測(cè)試中38%～51%具有肝毒性作用的化合物未能檢測(cè)出[4]。隨著“3R”原則的廣泛實(shí)施，以及人們對(duì)動(dòng)物保護(hù)和動(dòng)物福利的重視，越來(lái)越多的國(guó)家和地區(qū)通過(guò)立法或制定相關(guān)指導(dǎo)原則要求采用非動(dòng)物測(cè)試。因此，研究高通量、能夠模擬人肝細(xì)胞功能的體外系統(tǒng)成為當(dāng)前學(xué)術(shù)研究和相關(guān)商業(yè)開(kāi)發(fā)的熱點(diǎn)問(wèn)題。

近十年來(lái)，人們研究發(fā)展了多種人肝細(xì)胞來(lái)源的體外系統(tǒng)并應(yīng)用于化學(xué)性肝損傷的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。傳統(tǒng)的體外培養(yǎng)主要以二維（2D）細(xì)胞培養(yǎng)為主，因其簡(jiǎn)單性和低成本等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用。但肝臟具有復(fù)雜的立體結(jié)構(gòu)，2D培養(yǎng)方式很難重現(xiàn)肝臟組織的許多基本生理學(xué)功能，且很多肝細(xì)胞在體外培養(yǎng)系統(tǒng)中與人體生理狀況存在較大差異[5]。因此，應(yīng)用2D培養(yǎng)模型開(kāi)展毒性檢測(cè)的靈敏性和準(zhǔn)確性均受到很大限制。為了使體外肝細(xì)胞模型更好地模擬人體真實(shí)情況，近年來(lái)肝細(xì)胞3D培養(yǎng)模型越來(lái)越受關(guān)注和青睞[6-8]。3D培養(yǎng)方法為肝細(xì)胞提供了一個(gè)正常表達(dá)肝臟特異性功能的微環(huán)境，能有力地彌補(bǔ)傳統(tǒng)2D細(xì)胞培養(yǎng)的缺陷和不足。從2D到3D，維數(shù)的增加可顯著影響細(xì)胞增殖、分化和存活率[9]。雖然目前尚不存在通用的人源肝細(xì)胞3D模型，但隨著3D技術(shù)的迅速發(fā)展，3D肝細(xì)胞模型不斷完善，并在化學(xué)性肝損傷評(píng)價(jià)中得到越來(lái)越廣泛的應(yīng)用。

1 常用的人源肝細(xì)胞

常用的人源肝細(xì)胞主要包括原代培養(yǎng)的人正常肝細(xì)胞（PHH）、肝癌細(xì)胞、肝細(xì)胞系以及干細(xì)胞分化的肝細(xì)胞等模型。PHH是一種較為理想的體外肝細(xì)胞模型，通?？梢栽隗w外系統(tǒng)中維持24～72 h的肝功能活性，主要用于酶誘導(dǎo)和抑制研究、中等通量的化合物篩選等，被認(rèn)為是體外肝細(xì)胞試驗(yàn)的“金標(biāo)準(zhǔn)”。但PHH來(lái)源有限，且傳統(tǒng)方法難以進(jìn)行長(zhǎng)期穩(wěn)定培養(yǎng)。多種人肝癌細(xì)胞系由于具備廉價(jià)、易于體外穩(wěn)定長(zhǎng)期培養(yǎng)等優(yōu)勢(shì)而被廣泛使用，但大多數(shù)肝癌細(xì)胞系缺乏代謝活性，或與人正常肝細(xì)胞存在很大差異。如HepG2、LO2細(xì)胞等永生化的癌細(xì)胞系，雖可廣泛用于藥物性肝損的篩選評(píng)估，但這些細(xì)胞模型也存在酶代謝活力低等問(wèn)題，如HepG2細(xì)胞缺乏大多數(shù)Ⅰ和Ⅱ相代謝酶和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。HepaRG細(xì)胞是一種有干性潛能的細(xì)胞株，可以分化為肝細(xì)胞樣細(xì)胞和膽管樣細(xì)胞，可高表達(dá)代謝酶活性，近年越來(lái)越多地用于肝臟疾病探究和肝毒性評(píng)估。此外，肝細(xì)胞樣細(xì)胞還可以通過(guò)人誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞（hiPS-Hep）分化獲得。雖然肝細(xì)胞樣細(xì)胞的總體分化狀態(tài)已得到改善，但目前仍未獲得與成熟PHH分子表型高度相似的細(xì)胞[10]。

2 3D肝細(xì)胞模型

近年來(lái)研究開(kāi)發(fā)了多種3D新型細(xì)胞模型，可通過(guò)不同培養(yǎng)方式維持立體形態(tài)，形成較為復(fù)雜的組織結(jié)構(gòu)，建立細(xì)胞與細(xì)胞間的相互作用。這些3D細(xì)胞模型可以較好地重現(xiàn)肝臟的功能，并能維持藥物代謝酶和藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)水平，從而能更準(zhǔn)確地對(duì)化學(xué)性肝損傷進(jìn)行評(píng)估。此外，3D肝細(xì)胞可以在體外長(zhǎng)期培養(yǎng)，為長(zhǎng)期毒性探究提供了可能。下面重點(diǎn)介紹幾種技術(shù)相對(duì)成熟且較為常用的3D肝細(xì)胞模型。

2.1 不含支架的球狀體

無(wú)支架球體是在沒(méi)有促進(jìn)細(xì)胞附著底物的情況下，通過(guò)懸浮細(xì)胞的自聚集形成的3D細(xì)胞聚集體，可利用具有超低附著（ULA）表面的多孔板、灌注攪拌槽生物反應(yīng)器或懸滴培養(yǎng)技術(shù)等進(jìn)行。HepG2是應(yīng)用最廣泛的肝癌細(xì)胞系，與HepG2單層培養(yǎng)相比，球體培養(yǎng)的HepG2使MRP2和MDR1轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)、白蛋白的分泌提高持續(xù)數(shù)周，并且對(duì)對(duì)乙酰氨基酚誘導(dǎo)的毒性敏感性增加[11]。3D HepaRG與2D培養(yǎng)相比，其CYP1A2、CYP2B6、CYP2C9、CYP3A4和UGT酶的活性保持穩(wěn)定并顯著提高[12]，對(duì)對(duì)乙酰氨基酚和黃曲霉毒素B1等代謝致毒藥物更為敏感[13-15]。PHH是評(píng)價(jià)人類(lèi)肝毒性藥物的“金標(biāo)準(zhǔn)”細(xì)胞模型。與2D培養(yǎng)的PHH相比，3D PHH可保持存活并具有穩(wěn)定的白蛋白分泌至少5周，且蛋白質(zhì)組學(xué)特征與體內(nèi)的人類(lèi)肝臟極為相似，在數(shù)周內(nèi)仍保留其轉(zhuǎn)錄組和代謝組學(xué)譜，而來(lái)自相同供體的PHH在2D單層或三明治培養(yǎng)中則迅速下降。PHH球體相比于HepG2、HepaRG細(xì)胞和2D PHH可以顯著提高CYP1A2、CYP3A4等重要代謝酶的活性[16]。因此，PHH的3D培養(yǎng)比肝癌細(xì)胞系更具預(yù)測(cè)性。

2.2 基于支架的3D球體

在過(guò)去的十年中，使用生化和生物物理成分的組織工程支架在3D技術(shù)中取得了重大進(jìn)展。目前使用較多的是源自動(dòng)物組織的生物聚合物，其包含細(xì)胞在天然組織中相似的生化成分，并可能促進(jìn)組織再生。最常用的天然聚合物是透明質(zhì)酸、明膠、膠原蛋白、硫酸軟骨素[17]。以脫細(xì)胞的大鼠肝臟為支架的3D HepaRG球體細(xì)胞培養(yǎng)模型，可將Ⅰ、Ⅱ相酶，藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和核受體的表達(dá)延長(zhǎng)至28 d，使3D模型在肝毒性測(cè)試中有更高的敏感性[18]。來(lái)自非哺乳動(dòng)物的組織也被用于制造3D支架，如藻酸鹽和脫乙酰殼多糖生物聚合物等。藻酸鹽微囊化可改善HepG2和Hepa?RG球體的活力和代謝能力[19]。其他培養(yǎng)支架，例如半乳糖基化的纖維素海綿或聚乙二醇二丙烯酸二乙酯，可以維持人肝細(xì)胞系或干細(xì)胞衍生的肝細(xì)胞球體模型的長(zhǎng)期肝功能[20]。

盡管研究資料表明支架材料對(duì)肝球體表型有益，但基于支架材料的肝培養(yǎng)物與完整肝臟之間的差異還有待進(jìn)一步闡明，如這兩者之間在轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組和代謝組水平上的差異還不清楚。此外，支架材料批次間的差異會(huì)降低細(xì)胞模型的可重復(fù)性和可比性，從而使這些模型在化學(xué)性肝損傷的評(píng)價(jià)中的應(yīng)用變得復(fù)雜。基于支架的模型在應(yīng)用于藥理和毒理學(xué)分析之前，還應(yīng)充分考慮支架對(duì)藥物擴(kuò)散的影響。

2.3 中空纖維管型生物反應(yīng)器

新鮮分離或凍存的肝細(xì)胞系接種至生物反應(yīng)器中，其中空纖維的外腔管狀毛細(xì)血管網(wǎng)滲透每個(gè)腔室，半透性中空纖維將細(xì)胞與灌注室分開(kāi)，可以為肝細(xì)胞包埋提供基本的支架。肝細(xì)胞和膠原凝膠混合物可以裝載在纖維管內(nèi)間隙的內(nèi)部或外部[21]，培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧氣可以通過(guò)中空纖維管膜供應(yīng)給細(xì)胞，同時(shí)肝細(xì)胞產(chǎn)生的代謝物質(zhì)和二氧化碳亦可通過(guò)跨膜交換進(jìn)入培養(yǎng)基，提供了一種偽血管化組織模型。與用胎牛血清維持的培養(yǎng)相比，生物反應(yīng)器中無(wú)血清的PHH培養(yǎng)使各種CYPⅡ相酶和藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)增加[22]。HepaRG生物反應(yīng)器培養(yǎng)物中有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)多肽1B1（OATP1B1）的表達(dá)比PHH生物反應(yīng)器中低95%，但表現(xiàn)出相似的CYP3A4活性[23]。由于細(xì)胞需求大，中空纖維生物反應(yīng)器很少用于肝毒性評(píng)估，且昂貴，難以建立。此外，利用中空纖維生物反應(yīng)器進(jìn)行毒理學(xué)和藥理學(xué)研究可能由于材料會(huì)吸收疏水性藥物以及對(duì)基于成像的功能參數(shù)檢測(cè)的可行性有限而變得復(fù)雜。

2.4 3D打印細(xì)胞生物支架

現(xiàn)有的3D肝細(xì)胞打印技術(shù)主要采用基于噴墨的生物打印、材料擠出成型、激光輔助打印技術(shù)和光固化成型法。基于噴墨的生物打印可以使液滴中的細(xì)胞精確沉積，高通量打印出厘米大小的組織結(jié)構(gòu)[24]?；诓牧蠑D出成型的打印方式，細(xì)胞主要通過(guò)噴頭擠出絲構(gòu)建成二維平面，再由二維平面組成三維實(shí)體[25]。作為惟一一種可以與無(wú)支架細(xì)胞系統(tǒng)兼容的培養(yǎng)方式，材料擠出成型的打印方式具有一定優(yōu)勢(shì)，但打印速度很慢，并且打印過(guò)程中會(huì)導(dǎo)致相當(dāng)大的剪切應(yīng)力，可能對(duì)細(xì)胞造成損害。激光輔助生物打印技術(shù)主要使用激光聚焦脈沖產(chǎn)生的高壓液泡將含有細(xì)胞的生物材料沉積在接收基板上。由于其成本高、處理困難以及缺乏可商購(gòu)的解決方案，目前應(yīng)用較少。光固化成型法主要利用紫外線、紅外線等將光敏材料暴露在光源下使其固化，但打印過(guò)程中的高溫照射可能會(huì)損傷細(xì)胞。已有細(xì)胞打印技術(shù)開(kāi)發(fā)了一種具有多種細(xì)胞類(lèi)型的3D肝芯片，使用細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）生物墨水和血管、膽道流體通道進(jìn)行3D微環(huán)境的共培養(yǎng)，與不具有膽道系統(tǒng)的芯片相比，有膽道流體通道的芯片具有肝特異性基因并表達(dá)其功能[26]。但是3D打印支架通常涉及對(duì)于細(xì)胞而言難以生存的苛刻條件，例如極壓、非生理鹽濃度和使用有機(jī)溶劑，需要克服這些條件以滿足細(xì)胞的生存。

2.5 肝臟器官芯片

為了更真實(shí)地模擬肝臟的生理功能和立體結(jié)構(gòu)，肝器官芯片成為近年來(lái)3D肝細(xì)胞模型研究的熱點(diǎn)[27]。肝器官芯片一般包含肝細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，它們通過(guò)圖案化方式排列[28]或以聚集形式培養(yǎng)[25]。有的微流體芯片將PHH和非實(shí)質(zhì)肝細(xì)胞（NPC）以仿生理比例共培養(yǎng)在一個(gè)分層的3D組織中，該組織由類(lèi)似于肝腺泡的多孔膜與肝室隔開(kāi)的血管通道組成，可以模擬肝氧梯度分區(qū)，并可模擬肝竇內(nèi)的部分免疫功能，包括肝竇內(nèi)皮細(xì)胞（LSEC）的激活，促進(jìn)多形核白細(xì)胞（PMN）的結(jié)合[29]。雖然已開(kāi)發(fā)出許多肝器官芯片，但這些模型尚處于起步階段，目前還沒(méi)有關(guān)于分子表型或化學(xué)性肝損傷預(yù)測(cè)能力的全面表征數(shù)據(jù)。

3 3D肝細(xì)胞模型在化學(xué)性肝損傷評(píng)估中的應(yīng)用

3.1 肝毒性篩選

臨床研究發(fā)現(xiàn)，許多化學(xué)性肝損傷通常在幾周甚至幾個(gè)月后出現(xiàn)，而且經(jīng)常僅在人群中的少數(shù)幾個(gè)人中出現(xiàn)。由于3D模型可以在體外長(zhǎng)期培養(yǎng)，因此，在化學(xué)性肝損傷中，3D細(xì)胞培養(yǎng)模型比2D培養(yǎng)的細(xì)胞可以更好地模擬延遲的肝毒性事件。高通量兼容性強(qiáng)的球形培養(yǎng)系統(tǒng)在此方面更有優(yōu)勢(shì)。Khetani[30]等使用PHH構(gòu)建3D模型，以評(píng)估35種藥物性肝損傷（DILI）陽(yáng)性化合物和10種DILI陰性化合物的肝毒性，并在9 d內(nèi)多次重復(fù)給藥，準(zhǔn)確預(yù)測(cè)了其中66%藥物的毒性，特異性為90%。Bell等[31]使用PHH的肝球體和二維肝細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行5種不同肝毒素的重復(fù)劑量毒性研究，發(fā)現(xiàn)PHH球體在第14 d對(duì)APAP、波生坦、雙氯芬酸、氟尿嘧啶和曲格列酮高度敏感，而2D PHH培養(yǎng)物則較不敏感，表明3D細(xì)胞在長(zhǎng)期重復(fù)給藥方案下的可預(yù)測(cè)性。雖然3D肝細(xì)胞模型已明顯改善了肝毒性預(yù)測(cè)，但不能解決患者特定的易感性因素，例如環(huán)境暴露或遺傳易感性。而且對(duì)于特異性藥物肝毒性，如氟氯西林、阿莫西林-克拉維酸和噻氯匹定等，由于與罕見(jiàn)的人類(lèi)白細(xì)胞抗原（HLA）等位基因有關(guān)，由免疫系統(tǒng)所介導(dǎo)，難以進(jìn)行評(píng)估[32]。

3.2 代謝產(chǎn)物鑒定

化學(xué)物可通過(guò)肝臟的生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)生與母體分子不同的代謝產(chǎn)物，化學(xué)物的毒性也與新陳代謝和反應(yīng)性代謝產(chǎn)物的形成有關(guān)，因而代謝物的鑒定和安全性評(píng)估構(gòu)成了臨床前毒理學(xué)的重要方面。相比于傳統(tǒng)的代謝系統(tǒng)，例如肝微粒體、肝S9組分、肝細(xì)胞懸浮培養(yǎng)和肝切片等，3D PHH能維持藥物代謝酶的生理水平達(dá)數(shù)天乃至數(shù)周，并且可以高通量進(jìn)行試驗(yàn)，利于藥物篩選[33]。已有研究發(fā)現(xiàn)，3D PHH模型在孵育7 d后識(shí)別出27種（77%）藥物的人類(lèi)相關(guān)代謝物，而肝細(xì)胞懸浮培養(yǎng)（55%）、S9（46%）和肝微粒體（39%）的檢測(cè)率低于3D PHH細(xì)胞模型[34]。不含支架的球體已鑒定出雙氯芬酸、咪達(dá)唑侖、對(duì)乙酰氨基酚和普萘洛爾的Ⅰ、Ⅱ相代謝產(chǎn)物，并且檢測(cè)到傳統(tǒng)模型未能檢測(cè)到的人體特有代謝產(chǎn)物[35]。利用3D模型鑒定雙氯芬酸代謝產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)在不同的模型中可能存在不同代謝途徑，使用中空纖維生物反應(yīng)器模擬AZD6610的代謝，其在PHH生物反應(yīng)器主要通過(guò)羥基化進(jìn)行代謝，而在相同生物反應(yīng)器中HepaRG細(xì)胞的主要代謝途徑是葡萄糖醛酸化[36]。肝臟芯片也檢測(cè)出Ⅰ、Ⅱ相雙氯芬酸代謝物，并已用于氫化可的松的代謝分析[37-38]。

3.3 毒性機(jī)制發(fā)現(xiàn)

化學(xué)物可通過(guò)多種機(jī)制引起肝損傷，如抑制膽汁鹽排泄、氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙、炎癥以及適應(yīng)性和先天性介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。盡管2D體外模型可以探究一種或幾種致毒途徑，但其難以模擬肝器官的復(fù)雜性[39]。研究表明，在3D PHH球體培養(yǎng)時(shí)可重建膽管網(wǎng)絡(luò)，為膽汁鹽排泄方面的毒性研究提供了可能[40]。應(yīng)用“組學(xué)”技術(shù)進(jìn)行全面的分子圖譜分析，可揭示導(dǎo)致特定藥物或候選藥物的肝毒性分子事件。已有研究表明，以多種細(xì)胞不同模型比較所選化合物的肝毒性，在3周的實(shí)驗(yàn)過(guò)程發(fā)現(xiàn)只有肝臟球體模型表達(dá)藥物代謝酶、藥物和膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、配體激活的核受體以及其他指示肝功能正常的基因[33]。在2D培養(yǎng)物中的研究往往局限于高暴露水平下的急性毒性事件，長(zhǎng)期穩(wěn)定的3D肝細(xì)胞培養(yǎng)模型為亞毒性劑量長(zhǎng)期暴露下全面描述分子變化提供了有力工具[41]。以3D PHH作為細(xì)胞模型，評(píng)估肝毒素曲格列酮、奈法唑酮、布芬酸和托爾卡酮及其無(wú)毒結(jié)構(gòu)類(lèi)似物羅格列酮、丁螺酮、布洛芬和恩他卡朋暴露后的轉(zhuǎn)錄變化，發(fā)現(xiàn)用肝毒素處理的細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄變化始終高于無(wú)毒類(lèi)似物，并且鑒定出肝臟有毒化合物特有的多個(gè)轉(zhuǎn)錄本，發(fā)現(xiàn)膽汁酸的生物合成、脂肪酸代謝和PPAR信號(hào)通路是曲格列酮調(diào)節(jié)的通路[42]。將PHH球體暴露于氯丙嗪、胺碘酮、環(huán)孢霉素A和黃曲霉毒素B1等不同致毒機(jī)制的肝毒性化合物，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，PHH球體模型能夠準(zhǔn)確地重現(xiàn)化合物的主要毒作用機(jī)制所介導(dǎo)的毒效應(yīng)[33-43]。這些研究表明3D肝細(xì)胞模型為闡明化學(xué)性肝損傷的作用機(jī)制提供了有力工具。

4 結(jié)語(yǔ)

盡管3D細(xì)胞模型在化學(xué)性肝損傷評(píng)估中具有巨大的應(yīng)用價(jià)值和前景，但也面臨許多挑戰(zhàn)。第一，3D模型受多種因素影響和條件制約，需要對(duì)這些因素實(shí)現(xiàn)更加準(zhǔn)確、穩(wěn)定的控制。構(gòu)建3D模型除了需要滿足傳統(tǒng)2D模型中的細(xì)胞模型和培養(yǎng)規(guī)范之外，還應(yīng)注意氧氣濃度、基質(zhì)材料和支架對(duì)培養(yǎng)體系及受試化合物生物利用度的影響。第二，雖然現(xiàn)有技術(shù)已可將細(xì)胞穩(wěn)定維持?jǐn)?shù)周，使體外肝毒性測(cè)試范圍不再局限于急性毒性，但維持長(zhǎng)期的穩(wěn)定性和功能性是一個(gè)重要問(wèn)題。某些關(guān)鍵參數(shù)，如細(xì)胞活力可能在較長(zhǎng)的培養(yǎng)期內(nèi)保持不變，但不能排除其他參數(shù)的變化。第三，肝臟組織含多種不同類(lèi)型的肝細(xì)胞，同時(shí)培養(yǎng)各種類(lèi)型的細(xì)胞可能存在更大的可變性，因此需要更多的實(shí)驗(yàn)重復(fù)和技術(shù)重復(fù)，以獲得可重復(fù)性的結(jié)果。第四，3D培養(yǎng)的肝細(xì)胞模型仍無(wú)法生成不同類(lèi)型的血管結(jié)構(gòu)和膽道細(xì)胞，但這些細(xì)胞對(duì)于人類(lèi)肝臟的復(fù)雜肝臟形態(tài)和生理有很大影響。雖然多種細(xì)胞共培養(yǎng)可能可以改善這個(gè)問(wèn)題，但同時(shí)也帶來(lái)更大的技術(shù)難點(diǎn)：在滿足多種細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)基開(kāi)發(fā)上存在困難，不同類(lèi)型的細(xì)胞需要不同的生長(zhǎng)條件和細(xì)胞之間的不同比例，并且不同的細(xì)胞類(lèi)型需要不同的質(zhì)量檢查和來(lái)源，亟待建立統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。第五，不同類(lèi)型的3D肝細(xì)胞模型都有其自身局限性，單純的3D球體模型沒(méi)有血管結(jié)構(gòu)，可能導(dǎo)致無(wú)法模擬人體血液與組織細(xì)胞周?chē)慕M織液不斷交換，從而造成內(nèi)部細(xì)胞和外部細(xì)胞接觸滲透率低的藥物濃度不均，并且無(wú)法提供持續(xù)的氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)并及時(shí)清除代謝產(chǎn)物廢物。中空纖維生物反應(yīng)器或肝芯片又可能存在材料對(duì)藥物的吸附或吸收，產(chǎn)生新的技術(shù)難點(diǎn)。

綜上所述，3D培養(yǎng)的肝細(xì)胞模型雖然具有許多優(yōu)勢(shì)，但仍須進(jìn)一步研究并全面評(píng)估3D培養(yǎng)方式在肝毒性評(píng)價(jià)中的敏感性和特異性。此外，3D肝細(xì)胞模型作為一種體外替代方法，目前所開(kāi)展的替代方法驗(yàn)證試驗(yàn)及應(yīng)用十分有限，而且由于相關(guān)技術(shù)規(guī)范缺失和監(jiān)管滯后等原因，其應(yīng)用難以得到推廣。但隨著下一代風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的提出、體外毒理學(xué)的發(fā)展和化學(xué)性肝損傷評(píng)價(jià)需求的不斷增加，可以預(yù)見(jiàn)3D肝細(xì)胞模型將得到更多的關(guān)注和重視。