趙 亞 師長(zhǎng)宏

(空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，西安 710032)

2020年一月底，一場(chǎng)不明原因的肺炎疫情席卷全世界，2月28日已經(jīng)被世界衛(wèi)生組宣布為全球風(fēng)險(xiǎn)非常高級(jí)別。目前，已造成全球4 000多萬(wàn)人感染，100多萬(wàn)人死亡，此數(shù)據(jù)仍在不斷增長(zhǎng)，嚴(yán)重危害到人類(lèi)的健康和社會(huì)穩(wěn)定。大量研究表明，此次肺炎為病毒性肺炎，是由新型冠狀病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SRAS-CoV-2)感染所致。相關(guān)研究表明，血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(angiotensin-converting enzyme 2，ACE2)是新型冠狀病毒及SARS冠狀病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus，SRAS-CoV)的受體[1-3]，與SRAS-CoV-2親和力高于SRAS-CoV[4]， 是本次新型冠狀病毒的藥物治療及疫苗研發(fā)靶點(diǎn)。

ACE2是一種鋅金屬蛋白酶，結(jié)構(gòu)包括一個(gè)信號(hào)肽、一個(gè)金屬蛋白酶活性位點(diǎn)和一個(gè)跨膜區(qū)，可降解血管緊張素Ⅰ(angiotensin Ⅰ，Ang Ⅰ)生成九肽(angiotensin 1-9， Ang1-9)，降解血管緊張素(angiotensin，angi)生成七肽(angiotensin 1-7，Ang1-7)[5-6]。ACE2位于X染色體上，是血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(renin-angiotensin system，RAS)中的一員，在肺、消化道及大腦等組織器官中廣泛表達(dá)[7]。ACE2在肺組織中主要分布于Ⅱ型肺泡細(xì)胞(type Ⅱ alveolar cells，AT2 cells)，也有少量分布于Ⅰ型肺泡細(xì)胞(AT1 cells)及氣道上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等[8-9]，冠狀病毒進(jìn)入并在這些靶細(xì)胞中復(fù)制，然后，成熟的病毒粒子從感染細(xì)胞中釋放出來(lái)，再去感染新的靶細(xì)胞[10]。

我國(guó)學(xué)者最新研究發(fā)現(xiàn)了ACE2識(shí)別新型冠狀病毒的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，西湖大學(xué)周強(qiáng)教授課題組在《bioRxiv》連發(fā)兩篇文章清楚解析了新型冠狀病毒如何侵襲人體宿主細(xì)胞，相關(guān)結(jié)果為后期研究人員改進(jìn)并開(kāi)發(fā)新型治療藥物提供了非常重要的線索和信息[11-12]?！禨cience》發(fā)表了美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院(NIH)和德州大學(xué)奧斯汀分校(UT Austin)的合作研究成果，通過(guò)冷凍電鏡技術(shù)解析了新冠病毒S蛋白三聚體結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)新冠病毒S蛋白與受體ACE2結(jié)合能力為SARS病毒的10～20倍[4]，揭示了新冠病毒傳播能力如此強(qiáng)悍的原因。

近期《Cell》發(fā)表了來(lái)自德國(guó)研究者的結(jié)果也證實(shí)，新冠病毒利用ACE2進(jìn)入細(xì)胞，利用絲氨酸蛋白酶TMPRSS2激活S蛋白，TMPRSS2抑制劑可阻止病毒進(jìn)入細(xì)胞，且來(lái)自恢復(fù)期SARS患者的血清可中和SRAS-CoV-2 S蛋白驅(qū)動(dòng)的病毒進(jìn)入細(xì)胞，揭示SRAS-CoV-2和SARS病毒感染之間的重要共性[13]，為疫情提供新的治療思路。

病毒相關(guān)藥物和疫苗研究均需要在特異性動(dòng)物模型上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)后，才能進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)階段。小鼠是目前各類(lèi)疾病研究中應(yīng)用最廣泛的動(dòng)物模型，也是本次研究的首選。hACE2轉(zhuǎn)基因小鼠作為SARS-CoV易感動(dòng)物模型，與野生型小鼠相比，經(jīng)鼻腔接種PUMC01株SARS-CoV后，動(dòng)物出現(xiàn)典型的間質(zhì)性肺炎，并伴有腦組織、肝臟、腎臟和胃腸道等肺外組織的損傷，在研究SARS發(fā)病機(jī)制和抗病毒藥物的評(píng)價(jià)具有重要作用。國(guó)內(nèi)外均有成功報(bào)道的hACE2轉(zhuǎn)基因小鼠模型，但這幾種轉(zhuǎn)基因小鼠由于應(yīng)用技術(shù)、整合方式及小鼠品系等方面的差異，造成遺傳背景及表型不同。本文將對(duì)現(xiàn)有的各種hACE2轉(zhuǎn)基因小鼠從品系、構(gòu)建方式及應(yīng)用領(lǐng)域等方面進(jìn)行系統(tǒng)的介紹，利于研究者選擇使用。

1 C57BL/6 J × SJL/J背景K18-hACE2轉(zhuǎn)基因小鼠

2007年，愛(ài)荷華大學(xué)的McCray等[14]成功構(gòu)建K18-hACE2轉(zhuǎn)基因小鼠，由人類(lèi)細(xì)胞角蛋白18(cytokeratin 18，K18)啟動(dòng)子調(diào)控的hACE2轉(zhuǎn)基因小鼠。將攜帶有人ACE2編碼基因的載體引入到野生型(c57BL/6 J 與SJL/J雜交品系的F2)小鼠中構(gòu)建。ACE2的表達(dá)由人細(xì)胞角蛋白18(K18)啟動(dòng)子調(diào)控在上皮細(xì)胞中表達(dá)，K18啟動(dòng)子可在氣道上皮細(xì)胞(但不在肺泡上皮細(xì)胞)以及其他內(nèi)臟(包括肝、腎和胃腸道)的上皮細(xì)胞中高效表達(dá)外源轉(zhuǎn)基因[15]。

McCray等研究發(fā)現(xiàn)，在最初感染的氣道上皮細(xì)胞中便觀察到hACE2表達(dá)。該K18-hACE2轉(zhuǎn)基因小鼠鼻內(nèi)接種人源SARS-CoV毒株后會(huì)迅速感染并死亡，但野生型小鼠感染SARS-CoV病毒后，其肺泡中并未檢測(cè)到病毒抗原。該研究中，病毒感染開(kāi)始于氣道上皮，隨后擴(kuò)散到肺泡，最終蔓延至大腦。感染導(dǎo)致肺部巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，并引起肺部和腦部的促炎細(xì)胞因子和趨化因子上調(diào)。感染3～5 d后，K18-hACE2小鼠出現(xiàn)體質(zhì)量減輕，并伴有呼吸困難和精神萎靡，7 d內(nèi)全部死亡。雖然，SARS-CoV可以感染K18-hACE2轉(zhuǎn)基因小鼠的氣道和肺泡，引起的肺部病理變化卻有限，且最后受感染的K18-hACE2轉(zhuǎn)基因小鼠死亡的主要原因是中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染后導(dǎo)致神經(jīng)元死亡[14-16]，而新冠病毒感染患者死亡主要原因是感染后的肺臟炎癥[17]。

2 C3H × C57BL/6 背景HFH4-hACE2轉(zhuǎn)基因小鼠

美國(guó)病毒學(xué)家北卡羅納大學(xué)的Sheahan等[18]構(gòu)建的(C3H×C57BL/6)F1 背景hACE2轉(zhuǎn)基因小鼠，命名為HFH4-hACE2轉(zhuǎn)基因小鼠。該小鼠使用肺纖毛上皮細(xì)胞啟動(dòng)子HFH4啟動(dòng)人源ACE2基因在小鼠肺中的轉(zhuǎn)基因小鼠表達(dá)，該HFH4-hACE2轉(zhuǎn)基因小鼠肺中雖觀察到人ACE2的有效表達(dá)，但沒(méi)有表現(xiàn)出預(yù)期的肺部特異表達(dá)，在腦、肝、腎和胃腸道中也檢測(cè)到不同程度的人ACE2表達(dá)。同時(shí)，在HFH4-hACE2轉(zhuǎn)基因雜合子小鼠中偶爾檢測(cè)不到人類(lèi)ACE2基因的表達(dá)。在HFH4-hACE2轉(zhuǎn)基因小鼠10～20周齡時(shí)，感染SARS-CoV Urbani株并觀察7 d后發(fā)現(xiàn)，感染小鼠體質(zhì)量平均下降了20%以上，并且病毒在肺和腦保持了強(qiáng)勁復(fù)制，研究者預(yù)測(cè)hACE2轉(zhuǎn)基因小鼠死亡的主要原因?yàn)橹旅阅X炎。

3 C57BL/6 J×C3H/HeJ背景的hACE2轉(zhuǎn)基因小鼠

美國(guó)德克薩斯大學(xué)加爾維斯敦社區(qū)學(xué)院構(gòu)建了5個(gè)轉(zhuǎn)基因譜系的(C57BL/6 J×C3H/HeJ)F1背景的hACE2轉(zhuǎn)基因小鼠，分別命名為AC-12、AC-22、AC-50、AC-63和AC-70，主要應(yīng)用其中的AC-22、AC-63及AC-70轉(zhuǎn)基因譜系進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。該hACE2轉(zhuǎn)基因小鼠使用外源性的復(fù)合啟動(dòng)子CAG(帶有CMV-IE增強(qiáng)子的雞β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子)啟動(dòng)人ACE2基因表達(dá)[19]。該團(tuán)隊(duì)研究顯示，此類(lèi)hACE2轉(zhuǎn)基因小鼠在肺、腦、心及肌肉等組織中均有hACE2mRNA表達(dá)，對(duì)SARS-CoV感染高度易感，可導(dǎo)致不同嚴(yán)重程度的疾病發(fā)生，部分家系甚至死亡；在5個(gè)轉(zhuǎn)基因譜系中，AC-70轉(zhuǎn)基因譜系小鼠病毒感染能力最強(qiáng)，免疫抵制最劇烈，但在研究中未發(fā)現(xiàn)彌散性肺泡損傷，Yoshikawa等[20]推測(cè)該譜系轉(zhuǎn)基小鼠最終死亡可能是因感染導(dǎo)致的致命性腦炎。

4 ICR背景hACE2轉(zhuǎn)基因小鼠

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所秦川教授團(tuán)隊(duì)制作的hACE2轉(zhuǎn)基因小鼠為ICR背景hACE2轉(zhuǎn)基因小鼠。該團(tuán)隊(duì)考慮到外源性hACE2導(dǎo)入可能會(huì)造成小鼠心血管系統(tǒng)功能失常，采用內(nèi)源性啟動(dòng)子，使導(dǎo)入的hACE2基因更接近于自然表達(dá)，導(dǎo)入的hACE2基因?yàn)閱慰截?，臨床觀察該轉(zhuǎn)基因小鼠無(wú)心血管系統(tǒng)副作用，ICR背景的hACE2轉(zhuǎn)基因小鼠SARS-CoV易感性明顯高于野生型小鼠。研究表明，經(jīng)鼻腔接種PUMC01株SARS-CoV后，該轉(zhuǎn)基因小鼠在接種后第3天及第7天的肺組織上清的病毒載量和病毒滴度均顯著高于野生型小鼠，出現(xiàn)典型的間質(zhì)性肺炎，并伴有腎臟、心臟、肝臟、腦組織和胃腸道等肺外組織的損傷；在感染1周內(nèi)，該轉(zhuǎn)基因小鼠雖活動(dòng)減少、嗜睡，未出現(xiàn)死亡，推測(cè)這可能是由于感染的病毒滴度較低或者轉(zhuǎn)基因的表達(dá)較低[21-24]。

在疫情發(fā)生期間，科技部啟動(dòng)了新型冠狀病毒科技攻關(guān)的第1批應(yīng)急項(xiàng)目，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所主持動(dòng)物模型構(gòu)建課題，同時(shí)與中國(guó)疾控中心病毒病預(yù)防控制所等院內(nèi)外單位密切合作，根據(jù)前期的工作基礎(chǔ)和經(jīng)驗(yàn)，結(jié)合生物信息學(xué)分析，從病原易感動(dòng)物資源庫(kù)中篩選了潛在的易感動(dòng)物，分別是SARS入侵人細(xì)胞的受體—hACE2轉(zhuǎn)基因小鼠，以及曾成功用于SARS動(dòng)物模型研制的恒河猴。并率先建立了轉(zhuǎn)基因小鼠模型和恒河猴新冠肺炎(SRAS-CoV-2)的疾病模型，豐富了對(duì)COVID-19病因?qū)W和病理學(xué)的認(rèn)識(shí)，為進(jìn)一步研究感染與發(fā)病機(jī)制、傳播途徑、藥物和疫苗評(píng)價(jià)等提供了不可缺少的關(guān)鍵支撐。上述hACE2轉(zhuǎn)基因小鼠模型已經(jīng)應(yīng)用于致病機(jī)制和傳播途徑研究、應(yīng)急藥物篩選和疫苗評(píng)價(jià)，在科技部和中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院的安排下，完成了5種成藥的評(píng)價(jià)，正在進(jìn)行6種疫苗和4種成藥的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)。值得一提的是， SARS和MERS疫情期間，該研究所均率先建立了動(dòng)物模型，應(yīng)用于致病機(jī)制研究、疫苗研發(fā)和藥物篩選[25-26]。

5 KM背景hACE2轉(zhuǎn)基因小鼠

中國(guó)人民解放軍軍事科學(xué)院在KM小鼠上采用同源重組的方式進(jìn)行轉(zhuǎn)基因小鼠制備，利用PCAGGS表達(dá)載體，采用外源性啟動(dòng)子。該啟動(dòng)子為包含CMV增強(qiáng)子和雞的β-actin啟動(dòng)子組成的CAG雜合啟動(dòng)子，載體還包括雞β-actin的外顯子及兔β球蛋白的部分外顯子3，雞β-actin的部分內(nèi)含子1和兔β球蛋白的部分內(nèi)含子2，以及兔β球蛋白的轉(zhuǎn)錄終止子。其中，在雞的β-actin外顯子3中存在轉(zhuǎn)錄拼接位點(diǎn)，在雞的β-actin內(nèi)含子中存在轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子序列，有利于增強(qiáng)下游基因的表達(dá)；該團(tuán)隊(duì)在目的基因hACE2的起始密碼子前加入了CCACC的Kozak序列，有文獻(xiàn)表明在該啟動(dòng)子前加入該序列能夠增強(qiáng)目的基因表達(dá)[27]。該團(tuán)隊(duì)通過(guò)Western blot 及組織免疫熒光檢測(cè)了轉(zhuǎn)基因小鼠肺組織中的hACE2蛋白表達(dá)和分布，并通過(guò)體外蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)證明小鼠肺組織中穩(wěn)定表達(dá)的hACE2蛋白能很好的與SARS病毒的S蛋白結(jié)合[28]。該轉(zhuǎn)基因小鼠也存在感染后小鼠腦組織中病毒含量過(guò)高，最終導(dǎo)致小鼠因病毒在腦中廣泛傳播繼而因出現(xiàn)致命性腦炎死亡[29]。

6 展望

早期在CRISPR/Cas9技術(shù)還未成熟時(shí)，轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建主要通過(guò)受精卵DNA顯微注射技術(shù)制作，因重組效率及啟動(dòng)子的不同，其表達(dá)效果間存在差異，使得這些轉(zhuǎn)基因小鼠不能完全模擬生理狀況下的ACE2表達(dá)水平。在感染SARS-CoV后外源性與內(nèi)源性的啟動(dòng)子啟動(dòng)的hACE2轉(zhuǎn)基因小鼠模型均出現(xiàn)氣道上皮感染癥狀，但這些轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)都有高水平的hACE2表達(dá)，相應(yīng)的在感染后小鼠腦組織中病毒含量過(guò)高，最終可能導(dǎo)致小鼠因病毒在腦中廣泛傳播繼而出現(xiàn)致命性腦炎[16, 18, 20, 23]。無(wú)論現(xiàn)已報(bào)道的SARS-CoV hACE2轉(zhuǎn)基因小鼠模型在研究發(fā)病機(jī)制和治療干預(yù)方面多有效，但其小鼠適應(yīng)性的改變?nèi)祟?lèi)冠狀病毒易感性及致病機(jī)制這些缺點(diǎn)依然存在[30]。

國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)3月3日最新修訂的《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第七版)》中對(duì)病理改變進(jìn)行了總結(jié)，新型冠狀病毒肺炎導(dǎo)致的病理改變以肺臟及免疫系統(tǒng)損傷為主，其他臟器因基礎(chǔ)病不同而不同，多為繼發(fā)性損害；肺臟呈不同程度的實(shí)變，各類(lèi)上皮細(xì)胞發(fā)生病理性變化，支氣管黏膜上皮和Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)冠狀病毒顆粒，部分肺泡上皮和巨噬細(xì)胞呈新型冠狀病毒抗原陽(yáng)性、核酸陽(yáng)性；其他器官的病理改變，包括腦組織充血、水腫及部分神經(jīng)元變性，腎上腺見(jiàn)灶性壞死，食管、胃和腸管黏膜上皮不同程度變性、壞死、脫落[31]。相應(yīng)的動(dòng)物模型感染新冠病毒后其病理學(xué)變化應(yīng)盡可能接近人的臨床特征。但目前所有的SARS-CoV-2感染的動(dòng)物模型均只能重現(xiàn)人類(lèi)疾病的部分方面，也不能完全模擬病毒攻擊時(shí)人體生理狀況下的反應(yīng)。因此，應(yīng)積極開(kāi)發(fā)不同類(lèi)型的SARS-CoV-2感染動(dòng)物模型，加速研究SARS-CoV-2發(fā)病機(jī)理，加快開(kāi)發(fā)COVID-19對(duì)應(yīng)策略。

因此，各國(guó)研究者均積極的開(kāi)發(fā)新的SARS-CoV-2感染小鼠模型。CRISPR/Cas9技術(shù)是理想的轉(zhuǎn)基因小鼠模型構(gòu)建手段，能夠?qū)ACE2序列定點(diǎn)插入小鼠內(nèi)源ACE2基因ATG位置，使人源ACE2能夠在內(nèi)源ACE2調(diào)控信號(hào)的調(diào)控下進(jìn)行表達(dá)，其表達(dá)將更貼近于小鼠生理狀態(tài)下的表達(dá)情況，可以更好地為藥物治療及疫苗研發(fā)提供夯實(shí)的動(dòng)物基礎(chǔ)。已有研究者利用CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因工程技術(shù)在小鼠上實(shí)現(xiàn)人ACE2替換鼠ACE2。

耶魯大學(xué)醫(yī)學(xué)院的Iwasaki教授課題組開(kāi)發(fā)了一種新的SARS-CoV-2感染小鼠模型，首先使用攜帶hACE2基因的無(wú)害病毒感染小鼠，感染后小鼠產(chǎn)生人ACE2蛋白，進(jìn)而該小鼠感染SARS-CoV-2發(fā)現(xiàn)，SARS-CoV-2可以在這些小鼠中復(fù)制并誘導(dǎo)類(lèi)似于在COVID-19患者中觀察到的炎癥反應(yīng)，在該模型中，多種免疫細(xì)胞被激活并募集到肺中[32]。

各類(lèi)hACE2轉(zhuǎn)基因小鼠對(duì)新型冠狀病毒機(jī)理研究、藥物治療及疫苗研發(fā)均有至關(guān)重要的作用，通過(guò)hACE2轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行不同藥物的篩選，不僅可以提高臨床前藥物驗(yàn)證的有效性，也提高可以臨床實(shí)驗(yàn)的成功率。目前，我國(guó)多家企業(yè)及單位已經(jīng)著手開(kāi)發(fā)利用CRISPR/Cas9技術(shù)開(kāi)發(fā)新的hACE2轉(zhuǎn)基因小鼠模型，相信不久之后就會(huì)有大量不同敲入位點(diǎn)及修飾方法的hACE2轉(zhuǎn)基因小鼠模型用于后續(xù)的藥物研發(fā)及疫苗制備工作中。研究者可根據(jù)自身需求選用不同種類(lèi)的hACE2轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。