唐玉玲 王 進 邱業(yè)峰 袁 征

(軍事醫(yī)學研究院實驗動物中心，北京 100071)

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis,OA)是一類包括關(guān)節(jié)軟骨、軟骨下骨、韌帶、關(guān)節(jié)囊、滑膜以及關(guān)節(jié)周圍肌肉等結(jié)構(gòu)發(fā)生病變所致的關(guān)節(jié)退行性疾病[1-2]。臨床表現(xiàn)為關(guān)節(jié)疼痛及壓痛、關(guān)節(jié)僵硬及腫脹、關(guān)節(jié)活動摩擦、關(guān)節(jié)畸形以及肌肉萎縮等，常導(dǎo)致患者活動障礙甚至發(fā)生殘疾[3]。世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示：到2020年OA可能成為人類第四大致殘疾病[4]。隨著全球人口老齡化和肥胖的加劇，OA的發(fā)生更為普遍，不僅嚴重影響患者個人身心健康、對全球公共衛(wèi)生事業(yè)及現(xiàn)代社會經(jīng)濟也造成了嚴重負擔[5-6]。OA動物模型的研制對研究OA發(fā)生發(fā)展中的遺傳機制、預(yù)防以及治療都有著重要意義。目前OA動物模型主要包括三類：自發(fā)性O(shè)A動物模型、誘發(fā)性O(shè)A動物模型以及轉(zhuǎn)基因OA動物模型[7]。

1 自發(fā)性O(shè)A動物模型

自發(fā)性O(shè)A動物模型指不經(jīng)過人為干預(yù)，在自然條件下發(fā)生OA的動物。已有的自發(fā)性O(shè)A動物模型中，Hartley豚鼠模型[8]在18～22月齡間發(fā)生中至重度的骨關(guān)節(jié)炎；C57小鼠模型中2月齡小鼠OA發(fā)生率為25%，16月齡時達80%，但缺乏人類OA的關(guān)節(jié)軟骨纖維化的表型[9]。然而，人為喂養(yǎng)高脂飼料或是增加運動負荷后能增加C57小鼠的OA自發(fā)率[10-11]。其次，STR/ort小鼠也是公認的自發(fā)性O(shè)A動物模型[12-14]，其膝關(guān)節(jié)、踝關(guān)節(jié)、肘關(guān)節(jié)和顳下頜關(guān)節(jié)等均是OA的好發(fā)部位。此外，來源于B6C3F1小鼠的BCBC/Y小鼠[15]也能夠自發(fā)發(fā)生OA。這一小鼠踝關(guān)節(jié)發(fā)生典型的OA損傷表型，關(guān)節(jié)腫脹畸形，關(guān)節(jié)軟骨變薄并產(chǎn)生裂隙及侵蝕，關(guān)節(jié)邊緣形成骨贅，并且隨著鼠齡增長小鼠常發(fā)生癱瘓。

2 誘發(fā)性O(shè)A動物模型

誘發(fā)性O(shè)A動物模型指通過人為操作對動物骨關(guān)節(jié)及周圍組織進行手術(shù)或非手術(shù)的干預(yù)從而誘導(dǎo)OA發(fā)生的動物。誘發(fā)性O(shè)A動物模型在大鼠、小鼠、兔、犬、豬、綿陽、馬等多個不同物種中都有報道[16]。按造模方法不同，誘發(fā)性O(shè)A動物模型可分為經(jīng)典的Hulth模型[17-18]、前交叉韌帶橫斷模型[19]、半月板切除模型[20]、關(guān)節(jié)刻痕法模型[21]、切斷臀肌法模型[22]、骨內(nèi)高壓模型[23]、卵巢切除術(shù)模型[24]等手術(shù)法造模模型及關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射模型[25]、關(guān)節(jié)制動法模型[26]等非手術(shù)法造模模型。

2.1 手術(shù)法造模模型

經(jīng)典的Hulth模型、前交叉韌帶橫斷模型、半月板切除模型等是對半月板、韌帶等關(guān)節(jié)內(nèi)單個部位或多個部位進行手術(shù)切除從而誘導(dǎo)OA發(fā)生。此類模型造模成功率高，可重復(fù)性高，適用于創(chuàng)傷后骨關(guān)節(jié)炎的研究；但手術(shù)創(chuàng)傷對關(guān)節(jié)損害大，且易引發(fā)術(shù)后感染導(dǎo)致炎癥等。關(guān)節(jié)刻痕法模型則只是在關(guān)節(jié)股骨上刻痕，創(chuàng)傷較小且關(guān)節(jié)炎癥輕微，適用于早期OA的研究，但此類模型造模周期稍長。切斷臀肌法模型、骨內(nèi)高壓模型、卵巢切除術(shù)模型等的共同點是手術(shù)部位選擇非關(guān)節(jié)組織、避免了關(guān)節(jié)的損傷。切斷臀肌法模型是通過肌肉損傷造模，骨內(nèi)高壓模型通過結(jié)扎或切斷某些靜脈干擾關(guān)節(jié)的血液循壞進而造模，而卵巢切除術(shù)模型則是通過切除卵巢來模擬絕經(jīng)后的骨關(guān)節(jié)炎。這三種模型分別適用于研究肌肉損傷、血液供應(yīng)以及雌激素等因素對OA發(fā)生的影響，應(yīng)用面窄，不適合廣泛的OA相關(guān)研究。

2.2 非手術(shù)法造模模型

非手術(shù)法造模模型主要包括關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射模型、關(guān)節(jié)制動法模型兩類。關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射模型是通過向關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射能夠損害關(guān)節(jié)的藥物，如木瓜蛋白酶、膠原酶、透明質(zhì)酸酶、菲律賓菌素、碘醋酸鹽、碘乙酸鹽等進而誘發(fā)OA的發(fā)生。關(guān)節(jié)腔注射造模具有微創(chuàng)、易于操作的優(yōu)點，但藥物的劑量難以掌控易造成誤差。關(guān)節(jié)制動法模型是采用固定或牽引的方式對動物的關(guān)節(jié)進行機械性制動從而造成關(guān)節(jié)損傷。這種造模方式同樣避免了手術(shù)創(chuàng)傷，且模型與人類缺乏運動所致OA有一定相似性；但目前缺乏完美的固定設(shè)施及材料且制動操作復(fù)雜，難以控制。此外，寒冷刺激、飲食誘導(dǎo)、運動性損傷等方式也可以誘發(fā)OA模型，此類模型也屬于非手術(shù)法造模模型，但模型成因較為特殊、造模耗時長且應(yīng)用不廣泛[16]。

3 轉(zhuǎn)基因OA動物模型

轉(zhuǎn)基因OA動物模型指利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)結(jié)合基因編輯技術(shù)等將外源基因插入動物基因組或?qū)游镒陨砘蜻M行突變、敲除等改變而導(dǎo)致OA發(fā)生的動物。已報道的轉(zhuǎn)基因OA動物模型幾乎全是利用小鼠造模[27]。根據(jù)不同的基因改造策略及改造結(jié)果，可將轉(zhuǎn)基因OA小鼠模型分為三類：基因突變小鼠模型、全身性敲除小鼠模型以及條件性敲除小鼠模型。下面對不同轉(zhuǎn)基因OA小鼠模型逐一進行介紹。

3.1 基因突變小鼠模型

Col2a1點突變轉(zhuǎn)基因小鼠：Arita等[28]向FVB/N小鼠外源導(dǎo)入了突變(第519位精氨酸更替為半胱氨酸)的人類Col2a1基因從而構(gòu)建了Col2a1基因點突變的轉(zhuǎn)基因小鼠。這一突變策略模擬了臨床家族性O(shè)A病人中Col2a1基因第519位精氨酸更替為半胱氨酸的這一突變[29]。Col2a1基因點突變轉(zhuǎn)基因小鼠呈現(xiàn)骨骼發(fā)育延遲、II型膠原纖維密度減少，軟骨發(fā)育異常等OA樣表型[28]。

3.2 全身性基因敲除小鼠模型

3.2.1Blotchy轉(zhuǎn)基因小鼠模型：早在1977年，Silberberg等[30]報道了Blotchy轉(zhuǎn)基因小鼠模型，其X染色體上“Mottled”基因位點攜帶了導(dǎo)致膠原蛋白和彈性蛋白交聯(lián)缺陷的基因[31-32]。他們發(fā)現(xiàn)Blotchy轉(zhuǎn)基因半合子雄性小鼠除了發(fā)生肺氣腫和主動脈瘤，還有典型的骨關(guān)節(jié)炎表征。1996年，Glasson等[33]利用同一小鼠模型的雜合子雌性小鼠展開研究，發(fā)現(xiàn)Blotchy雌鼠也呈現(xiàn)軟骨損傷、蛋白聚糖嚴重缺失等OA表型。

3.2.2Col2a1相關(guān)的轉(zhuǎn)基因小鼠：1992年，Metsaranta等[34]在B6D2F1小鼠中敲除Ⅱ型膠原基因的第7外顯子，小鼠出生即死亡，關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)及膠原纖維減少，生長板結(jié)構(gòu)紊亂、四肢、胸腔、顱骨等畸形。

1993年，Helminen等[35]發(fā)現(xiàn)Col2a1缺陷基因轉(zhuǎn)基因小鼠也具有OA特征，Vandenberg等[36]向FVB/N小鼠外源導(dǎo)入了一段刪除12個外顯子的人COL2A1基因，這一缺陷基因編碼一條缺失291個氨基酸的短肽鏈，它與小鼠內(nèi)源性表達的全長肽鏈同時存在導(dǎo)致前膠原纖維無法形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)進而被降解，從而導(dǎo)致Col2a1的全身刪除。Col2a1缺陷基因轉(zhuǎn)基因小鼠的表型呈現(xiàn)多樣化：15%的小鼠發(fā)生腭裂后死亡；存活的小鼠在1 d到3月齡間發(fā)生不同程度的軟骨基質(zhì)膠原纖維變少、軟骨細胞粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張等軟骨發(fā)育異?，F(xiàn)象，小鼠的質(zhì)量及骨密度都減少；15月齡小鼠則發(fā)生典型的OA樣軟骨退行性病變[35]。

1995年，Li等[37]通過破壞Col2a1基因的第35外顯子構(gòu)建了Col2a1基因敲除的轉(zhuǎn)基因小鼠模型。純合小鼠出生前后致死，關(guān)節(jié)軟骨細胞缺乏細胞外基質(zhì)及膠原纖維，長骨缺失軟骨內(nèi)骨及骨骺生長板，但顱骨及肋骨正常。利用這一模型，Lapvetelainen等[38]進一步發(fā)現(xiàn)雜合小鼠更易發(fā)生膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎。

3.2.3Col9al敲除小鼠:1994年，F(xiàn)assler等[39]構(gòu)建了Col9al基因敲除小鼠。IX型膠原是由α1、α2及α3三條肽鏈組成的三聚體，研究者們通過破環(huán)α1鏈的第8外顯子得到Col9al基因敲除小鼠，小鼠發(fā)生人OA樣退行性關(guān)節(jié)疾病[39]。隨后，Kimura等[40]發(fā)現(xiàn)這一突變小鼠的脊椎也發(fā)生類似的退行性病變。Hu等[41]進一步發(fā)現(xiàn)Col9al基因敲除小鼠的膝關(guān)節(jié)及顳下頜關(guān)節(jié)也發(fā)生年齡依賴性的OA樣病變。Col9al基因敲除小鼠3月齡時開始出現(xiàn)表型，6月齡小鼠關(guān)節(jié)軟骨蛋白聚糖及IX型膠原降解嚴重，基質(zhì)金屬蛋白酶及盤狀蛋白域受體2表達增加，此外股骨和脛骨的關(guān)節(jié)軟骨力學結(jié)構(gòu)特性及滲透性也發(fā)生改變。

3.2.4Del1敲除小鼠:2000年，Saamanen等[42]報道了Del1位點插入6個拷貝的突變Col2轉(zhuǎn)基因的小鼠模型，Del1雜合小鼠發(fā)生軟骨關(guān)節(jié)退化及侵蝕、半月板退化、關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)礦化、囊腫、軟骨下骨暴露等OA樣病變。

2016年，王振等[43]發(fā)現(xiàn)Del1基因敲除小鼠更易引發(fā)嚴重的OA。利用的小鼠模型是Hidai等[44]于1998年構(gòu)建的Del1-LacZ敲入小鼠，其構(gòu)建策略是在小鼠的Del1位點插入LacZ基因，導(dǎo)致Del1遭到破壞而發(fā)生敲除以及LacZ的表達。這一小鼠的骨骼密度和形態(tài)正常，耳朵和膝關(guān)節(jié)的軟骨變薄，在損傷壓力下更易導(dǎo)致OA的發(fā)生[43]。

3.2.5雙鏈蛋白多糖/纖調(diào)蛋白聚糖敲除小鼠:2003年，Young等[45]發(fā)現(xiàn)雙鏈蛋白多糖基因敲除小鼠、纖調(diào)蛋白聚糖基因敲除小鼠以及雙糖鏈蛋白多糖/纖調(diào)蛋白聚糖的雙基因敲除小鼠都會發(fā)生早發(fā)性O(shè)A，雙基因敲除小鼠的OA表型發(fā)生更早且更嚴重。

3.3 條件性基因敲除小鼠模型

3.3.1β-catenin條件性敲除小鼠：2009年，朱梅等[46]特異性敲除關(guān)節(jié)軟骨細胞β-catenin的第3外顯子的一個拷貝，導(dǎo)致小鼠發(fā)生人OA樣表型。研究者們將Col2a1-CreERT2轉(zhuǎn)基因小鼠[47-48]與β-cateninfx(Ex3)/fx(Ex3)基因打靶小鼠[49]交配得到Col2a1-CreERT2;β-cateninfx(Ex3)/wt小鼠，經(jīng)tamoxifen誘導(dǎo)后β-catenin第3外顯子被敲除。小鼠5月齡時關(guān)節(jié)軟骨減少，8月齡時觀察到關(guān)節(jié)表面纖維性顫動、裂陷、軟骨骨贅形成等現(xiàn)象。同時，小鼠關(guān)節(jié)軟骨中Aggrecan、Mmp-9、Mmp-13、Alp、Oc、ColX等多種軟骨細胞標志物以及Bmp2的表達都顯著上升[46]。

3.3.2EFNB2條件性敲除小鼠：2016年，Valverde-Franco等[50]將Col2a1-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠與EFNB2fx/fx基因打靶小鼠交配得到軟骨特異性EFNB2純合敲除小鼠(Col2a1-Cre;EFNB2fx/fx)，小鼠軟骨細胞EFNB2的第1外顯子被敲除。研究者們分析EFNB2敲除小鼠發(fā)現(xiàn)：剛出生時小鼠生長板X型膠原蛋白表達增加、肥大區(qū)紊亂、礦化減少；15日齡小鼠軟骨-骨連接處VEGF和TRAP的表達顯著下降、骨體積和骨小梁厚度減少導(dǎo)致第二骨化中心形成延遲；21日齡及8周齡小鼠骨密度下降；12月齡小鼠膝關(guān)節(jié)和髖關(guān)節(jié)均表現(xiàn)出OA的表型。

3.3.3DOT1L條件性敲除小鼠：2017年，Monteagudo等[51]發(fā)現(xiàn)DOT1L具有維持軟骨組織穩(wěn)態(tài)及預(yù)防OA發(fā)生的作用。研究者們抑制DOT1L活性后野生小鼠發(fā)生骨關(guān)節(jié)炎，利用軟骨細胞表達的Col2a1-Cre敲除DOT1L第2外顯子后，小鼠關(guān)節(jié)軟骨X型膠原和MMP13表達增加，關(guān)節(jié)軟骨穩(wěn)態(tài)受到影響。同時，小鼠還出現(xiàn)骨骼生長停滯，生長板前肥大區(qū)發(fā)生紊亂等表型。

3.3.4Pten條件性敲除小鼠：2019年，謝婧等[52]發(fā)現(xiàn)關(guān)節(jié)軟骨中持續(xù)激活A(yù)kt信號導(dǎo)致小鼠發(fā)生骨關(guān)節(jié)炎。研究中同時使用組成型Col2a1-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠及誘導(dǎo)型Col2a1-CreERT2轉(zhuǎn)基因小鼠分別與第4、5外顯子被錨定的Ptenfl/fl小鼠交配得到軟骨細胞特異性Pten敲除小鼠。Col2a1-Cre；Ptenfl/fl小鼠5月齡時蛋白聚糖減少，關(guān)節(jié)軟骨厚度減少、關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)破損；8月齡時關(guān)節(jié)表面變粗糙并發(fā)生侵蝕；10月齡時小鼠軟骨嚴重缺損；隨著鼠齡增加，關(guān)節(jié)軟骨缺損嚴重，軟骨下骨和滑膜皆發(fā)生病變并形成骨贅。為排除Col2a1-Cre；Ptenfl/fl小鼠中生長板缺損造成的影響，研究者們進一步在Col2a1-CreERT2；Ptenfl/fl小鼠中進行分析，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)性Ptenfl/fl敲除小鼠8月齡也出現(xiàn)了明顯的OA的表型。

目前轉(zhuǎn)基因OA動物模型多為全身性的突變或敲除小鼠，條件性基因敲除小鼠模型仍然缺乏。全身性的突變或敲除的OA小鼠模型除了有部分類似OA的病理表型外，多數(shù)還同時發(fā)生其他器官或組織的缺陷，這對研究OA的治病機制或是治療方法等具有一定的影響。條件性基因敲除小鼠模型在軟骨細胞中特異性敲除特定基因進而研究其功能，這對探索OA發(fā)生發(fā)展的過程及機制有很好的促進作用，但目前這類模型的數(shù)量有限，OA的致病機理及治療機制等相關(guān)研究仍有很大的空白，研制新的條件性轉(zhuǎn)基因OA小鼠模型具有重要意義。

4 小結(jié)

人類OA的發(fā)病原因復(fù)雜，與年齡、肥胖、炎癥、創(chuàng)傷及遺傳因素等都有重要聯(lián)系[53-54]。OA動物模型的應(yīng)用及研究對探究人類OA的致病機理、預(yù)防及治療等具有不可替代的作用。任何動物模型的研制都需要符合相似性、重復(fù)性、可靠性、適用性和可控性、易行性和經(jīng)濟性、符合動物實驗倫理和3Rs理論等多項原則。理想的OA模型最重要的標準是能夠最大程度模擬人類OA的發(fā)生發(fā)展過程，即組織病理、細胞狀態(tài)、相關(guān)信號通路及分子標志物等多方面的變化都與人類OA相一致。此外，還需要符合周期短、費用低、操作便利、表型穩(wěn)定可重復(fù)、動物福利倫理等多種要求。然而，目前大部分OA動物模型只能模擬臨床OA的部分癥狀，不同的OA動物模型都有自己獨特的優(yōu)勢，也存在局限性。自發(fā)性O(shè)A動物模型避免了人為損傷，但造模周期長、費用高。誘發(fā)性O(shè)A動物模型中，手術(shù)法會對動物造成創(chuàng)傷，穩(wěn)定性難以維持；非手術(shù)法藥物種類及劑量、操作方式及時間都難以控制；多數(shù)誘發(fā)性O(shè)A動物模型適用領(lǐng)域都比較窄[55]。相對自發(fā)性誘發(fā)性造模來說，轉(zhuǎn)基因造模不僅能夠避免手術(shù)創(chuàng)傷，減輕模型動物的痛苦，還能彌補其他方法造模的不穩(wěn)定性，具有其他造模方法無法比擬的特點和優(yōu)勢。目前多種轉(zhuǎn)基因OA模型被成功研制并在OA的致病機理、藥物篩選、預(yù)防及治療等相關(guān)研究發(fā)揮作用，也是未來OA模型研制的主要方向。

除了運用單一的造模方法，很多OA的相關(guān)研究中結(jié)合使用了多種造模方法，如多部位手術(shù)誘發(fā)造模[56]、轉(zhuǎn)基因模型結(jié)合誘發(fā)性干預(yù)[43]、多基因敲除造模等[45]。鑒于目前的OA動物模型無法模擬人類OA的所有特征，研究者需要根據(jù)自己的研究領(lǐng)域及研究目的選擇合適的造模策略，轉(zhuǎn)基因OA模型因其獨特的優(yōu)越性而具備很重要的發(fā)展?jié)摿?。此外，為最大程度模擬人類臨床OA病理特征，OA動物模型的研制必然走向以轉(zhuǎn)基因造模為主、同時結(jié)合其他造模方法綜合運用的趨勢。