陳燕亭，宋 艷，陸立鶴

（中山大學(xué) 1.中山醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，2.附屬第一醫(yī)院病理科，廣東廣州 510080）

血管鈣化（vascular calcification）是心血管事件發(fā)生率和死亡率增加的獨(dú)立危險(xiǎn)因素［1-2］。血管鈣化是一種受基因調(diào)節(jié)的主動(dòng)病變過(guò)程［3-5］，這一觀點(diǎn)已被學(xué)術(shù)界普遍接受，其中血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cells，VSMC）的凋亡被認(rèn)為是促使血管鈣化發(fā)生的重要機(jī)制［6］。血管鈣化是動(dòng)脈粥樣硬化晚期的重要特征。血漿中氧化型低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoprotein，Ox-LDL）濃度升高是動(dòng)脈粥樣硬化及血管鈣化的主要危險(xiǎn)因素之一［7-8］。然而目前臨床上缺乏有效干預(yù)血管鈣化的手段。附子多糖（Fuzi polysac?charide，F(xiàn)PS）是從中藥附子中提取的葡聚糖，具有抗氧化、調(diào)節(jié)血脂和保護(hù)心肌細(xì)胞等作用。既往的研究表明，附子多糖能通過(guò)抗氧化應(yīng)激和抑制細(xì)胞凋亡來(lái)發(fā)揮其對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用［9］。我們以前的研究發(fā)現(xiàn)Ox-LDL可通過(guò)激活神經(jīng)酰胺（ceramide）信號(hào)誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞凋亡和鈣化［10］。然而FPS是否通過(guò)調(diào)節(jié)ceramide抑制血管平滑肌細(xì)胞鈣化尚不清楚。本研究通過(guò)采用Ox-LDL誘導(dǎo)的人體血管平滑肌細(xì)胞鈣化模型，探討FPS抑制血管平滑肌細(xì)胞鈣化的作用及機(jī)制，為血管鈣化的防治提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將人血管平滑肌細(xì)胞接種于含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。細(xì)胞每2 d換培養(yǎng)液1次，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%，加入胰蛋白酶消化傳代。細(xì)胞長(zhǎng)滿后用含有50 μg/mL的Ox-LDL誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞鈣化。加入不同濃度的附子多糖（0.1、0.5和1 mg/mL FPS）處理細(xì)胞，觀察FPS對(duì)細(xì)胞鈣化的影響。

1.2 主要試劑

人血管平滑肌細(xì)胞（ATCC）；細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM、FBS、TRIzol（Life Technology）；GW4869、茜素紅（Sigma）；TUNEL試劑盒（Roche）；Caspase3活性檢測(cè)試劑盒（Beyotime）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR green試劑盒（Takara）；BCA試劑盒和ECL發(fā)光試劑盒（Pierce）；β-actin抗體（Cell Signaling Technol?ogy）；Msx2，BMP2抗體（Abcam）。附子多糖的提取參考本實(shí)驗(yàn)室成熟的方法［11］。

1.3 Ox-LDL的制備

采集健康人血標(biāo)本，EDTA抗凝后離心分離上層血漿。加入適量的1.33 g/mL的高密度溴化鉀溶液將血漿的密度調(diào)節(jié)為1.019 g/mL后，4 ℃，200 000 ×g離心4 h。去除上層低密度脂蛋白（LDL）后，再次加入高密度溴化鉀溶液將血漿密度調(diào)整至1.063 g/mL，再次4 ℃，200 000×g離心4 h。收集上層的native LDL，加入5 μmol/L的CuSO4氧化，將native LDL氧化成Ox-LDL，透析后4 ℃保存。標(biāo)本采集者知情同意。

1.4 細(xì)胞鈣化檢測(cè)

參考我們既往發(fā)表的文獻(xiàn)［3，8］，培養(yǎng)細(xì)胞用PBS液洗3次后，加入40 g/L的甲醛固定10 min，再加入pH4.2的2%茜素紅染色液，于室溫靜置5 min，雙蒸水洗滌細(xì)胞，光學(xué)顯微鏡下觀察，鈣化的部分染成紅色。用10%的甲酸洗滌茜素紅染色的細(xì)胞直至溶液變黃，用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)405 nm處測(cè)定其吸光度OD值，進(jìn)行定量分析。用鄰甲酚酞絡(luò)合劑法檢測(cè)細(xì)胞鈣離子濃度［8］。

1.5 堿性磷酸酶和中性鞘磷脂酶活性及神經(jīng)酰胺含量檢測(cè)

將血管平滑肌細(xì)胞種植于培養(yǎng)皿中，加入處理因素處理7 d，去掉細(xì)胞培養(yǎng)液并用PBS洗2次，加入0.1%Triton X-100裂解細(xì)胞提取蛋白。取20 μL細(xì)胞裂解液，加入180 μL的p-nitro phe?nyl phosphate（p-NPP）反應(yīng)底物，混勻后37 ℃孵育15 min，最后加入3 mol/L的NaOH終止反應(yīng)，于405 nm處測(cè)定其吸光度OD值。參考我們發(fā)表的文獻(xiàn)，檢測(cè)細(xì)胞中性鞘磷脂酶活性和神經(jīng)酰胺含量［10，12］。

1.6 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

采用TUNEL試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡。參考試劑盒說(shuō)明書(shū)，用PBS漂洗多聚甲醛固定的細(xì)胞，每個(gè)樣本加入50 μL的TUNEL反應(yīng)工作液，37 ℃避光孵育60 min，用PBS漂洗3次，封片后熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞，并計(jì)算凋亡細(xì)胞數(shù)。Caspase3的活性檢測(cè)參考試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.7 熒光定量qRT-PCR

采用TRIzol試劑盒提取血管平滑肌細(xì)胞RNA，具體步驟參考試劑說(shuō)明書(shū)，提取細(xì)胞總RNA后，加入適量體積的DEPC水溶解RNA，取1 μL測(cè)RNA的濃度。采用TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，按照試劑說(shuō)明書(shū)操作，將1 μg RNA合成為cDNA，然后用SYBR green試劑，配成20 μL的PCR反應(yīng)體系：2×SYBR Premix Ex Taq 10 μL，模板DNA 2 μL，0.4 μL的上下游引物，補(bǔ)純水至總體積20 μL。qPCR所用的引物如下：β-actin（forward）：CTCT?TCCAGCCTTCCTTCCT，β-actin（reverse）：AGCAC?TGTGTTGGCGTACAG；BMP2（forward）：GCTAGA?CCTGTATCGCAGGC，BMP2（reverse）：AAACTCCT?CCGTGGGGATAG；Msx2（forward）：TGGATGCAG?GAACCCGG，Msx2（reverse）：AGGGCTCATATGTC?TTGGCG；Osterix（forward）：TAATGGGCTCCTTTC?ACCTG，Osterix（reverse）：CACTGGGCAGACAGTC?AGAA；SMA（forward）：CCGGGAGAAAATGACTC?AAA，SMA（reverse）：GAAGGAATAGCCACGCTCA?G。用StepOne Plus real-time PCR儀進(jìn)行熒光定量PCR。以β-actin為內(nèi)參，以△△Ct法計(jì)算目的基因mRNA的擴(kuò)增倍數(shù)。

1.8 Western blot檢測(cè)蛋白的表達(dá)水平

收集各組細(xì)胞，加入100 μL RIPA裂解液，離心，取上清BCA法定量，SDS-PAGE電泳分離，電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉。加入一抗Msx2，BMP2，β-actin抗體4 ℃過(guò)夜孵育，TBST洗膜3次，加入二抗室溫孵育60 min，用TBST洗膜后ECL發(fā)光顯影。使用Image軟件進(jìn)行條帶灰度的定量分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，應(yīng)用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差描述，多組計(jì)量資料比較，各組數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，方差齊時(shí)采用單因素方差分析。方差分析有統(tǒng)計(jì)意義時(shí)，再進(jìn)行Tukey HSD檢驗(yàn)法多重比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 附子多糖抑制氧化型低密度脂蛋白誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞鈣化

用不同濃度的附子多糖（0.1、0.5和1 mg/mL FPS）和50 μg/mL的Ox-LDL共同處理VSMC 7 d。茜素紅染色和定量結(jié)果顯示：50 μg/mL的Ox-LDL能明顯促進(jìn)細(xì)胞鈣化，而不同濃度的FPS均能明顯抑制Ox-LDL誘導(dǎo)的細(xì)胞鈣化（圖1A、B）。另外，F(xiàn)PS還能劑量依賴(lài)性地降低細(xì)胞鈣離子濃度（圖1C）。

圖1 附子多糖對(duì)氧化型低密度脂蛋白誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞鈣化的影響Fig.1 Effect of FPS on Ox-LDL-induced VSMC calcification

2.2 附子多糖抑制氧化型低密度脂蛋白誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞成骨樣分化

血管平滑肌細(xì)胞的成骨樣分化過(guò)程是血管鈣化中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。因此我們采用檢測(cè)了堿性磷酸酶（ALP）的活性以及骨相關(guān)蛋白Msx2、Osterix、BMP2和收縮蛋白SMA表達(dá)水平來(lái)研究FPS對(duì)氧化型低密度脂蛋白血管平滑肌細(xì)胞的成骨樣分化的影響。結(jié)果表明：FPS能降低血管平滑肌細(xì)胞的ALP活性（圖2A），下調(diào)Msx2、Osterix、BMP2 mRNA的表達(dá)水平，上調(diào)SMA mRNA的表達(dá)水平（圖2B）。此外，F(xiàn)PS能明顯下調(diào)血管平滑肌細(xì)胞Msx2和BMP2的蛋白表達(dá)水平（圖2C、D）。這些結(jié)果說(shuō)明FPS能抑制血管平滑肌細(xì)胞成骨樣分化。

圖2 附子多糖對(duì)氧化型低密度脂蛋白誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞成骨樣分化的影響Fig.2 Effect of FPS on osteogenic differentiation of VSMC induced by Ox-LDL

2.3 附子多糖抑制Ox-LDL誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞凋亡

Ox-LDL可促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞凋亡，所以我們觀察了FPS對(duì)Ox-LDL誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果顯示：Ox-LDL可明顯促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞的凋亡，而FPS能明顯抑制血管平滑肌細(xì)胞的凋亡（圖3A、B）；另外，Ox-LDL可明顯提高血管平滑肌細(xì)胞的Caspase3的活性，而FPS可降低細(xì)胞Caspase3的活性（圖3C）。

2.4 ceramide參與Ox-LDL誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞凋亡和鈣化

神經(jīng)酰胺（ceramide，Cer）是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的重要第二信使分子，而細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致血管鈣化的重要機(jī)制。中性鞘磷脂酶（N-SMase）是血管平滑肌細(xì)胞調(diào)控ceramide生成的關(guān)鍵酶。因此，我們使用N-SMase的抑制劑GW4869（20 μmol/L）觀察ceramide是否參與Ox-LDL誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞凋亡和鈣化過(guò)程。結(jié)果表明：Ox-LDL可明顯誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞凋亡，ceramide可增加Ox-LDL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，而抑制N-SMase可明顯抑制細(xì)胞凋亡（圖4A）；同樣，Ox-LDL可誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞鈣化，ceramide可增加Ox-LDL誘導(dǎo)的細(xì)胞鈣化，而抑制N-SMase可明顯抑制細(xì)胞鈣化（圖4B），說(shuō)明ceramide介導(dǎo)了Ox-LDL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和鈣化。

圖3 附子多糖對(duì)Ox-LDL誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞凋亡的影響Fig.3 Effect of FPS on Ox-LDL-induced apoptosis of VSMC

圖4 GW4869對(duì)Ox-LDL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和鈣化的影響Fig.4 Effect of GW4869 on Ox-LDL-induced cell apoptosis and calcification

2.5 附子多糖降低Ox-LDL誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞ceramide水平

由于ceramide參與了Ox-LDL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和鈣化，我們接著觀察了FPS對(duì)ceramide水平的影響。結(jié)果顯示：Ox-LDL可提高ceramide生成酶中性鞘磷脂酶（N-SMase），而FPS可明顯抑制N-SMase的活性（圖5A）；此外，Ox-LDL可增加ceramide的含量，而FPS可明顯降低ceramide的含量（圖5B）。這些結(jié)果提示：FPS可通過(guò)抑制血管平滑肌細(xì)胞N-SMase的活性降低ceramide的含量。

圖5 附子多糖對(duì)血管平滑肌細(xì)胞神經(jīng)酰胺含量的影響Fig.5 Effect of FPS on levels of ceramide in VSMC

3 討論

血管鈣化是由多種因素作用，受基因表達(dá)調(diào)控的生物學(xué)過(guò)程，涉及血管平滑肌細(xì)胞的成骨樣分化，與骨生成過(guò)程相似。Ox-LDL是促進(jìn)血管鈣化的重要因素［13］。本研究發(fā)現(xiàn)FPS能抑制Ox-LDL誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞凋亡和鈣化。ceramide參與調(diào)控Ox-LDL誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞凋亡和鈣化過(guò)程。FPS可降低N-SMase的活性和ceramide的含量。這些結(jié)果說(shuō)明FPS抑制血管平滑肌細(xì)胞成骨樣分化和鈣化與N-SMase/ce?ramide信號(hào)通路有關(guān)。

血管鈣化可加重血管組織氧化性損傷，增加血管平滑肌細(xì)胞凋亡［14-15］。研究表明Ox-LDL是誘導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化和血管鈣化的危險(xiǎn)因素，Ox-LDL能促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞由收縮型表型向成骨樣表型轉(zhuǎn)化，表現(xiàn)為骨蛋白如Runx2、BMP2、Msx2和ALP等表達(dá)水平升高［16-17］。大量研究顯示：Ox-LDL可促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞成骨樣分化和鈣化［18-19］。我們也發(fā)現(xiàn)：Ox-LDL能上調(diào)血管平滑肌細(xì)胞Runx2，BMP2和Osterix mRNA的表達(dá)水平，提高ALP的活性，誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞鈣化。既往研究報(bào)道FPS具有抗細(xì)胞凋亡的作用［9］。我們關(guān)于FPS對(duì)血管平滑肌細(xì)胞凋亡和鈣化的研究結(jié)果也表明：FPS可抑制Ox-LDL誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞凋亡和鈣化。

ceramide是細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使分子，可調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，其水平受到鞘磷脂酶的調(diào)控。我們以前的研究證明：Ox-LDL可提高血管平滑肌細(xì)胞N-SMase活性和ceramide的含量，促進(jìn)細(xì)胞凋亡和鈣化［10］。本研究也發(fā)現(xiàn)Ox-LDL可明顯增加ceramide的含量。另外，我們還發(fā)現(xiàn)FPS可降低N-SMase活性和ceramide的含量。而ceramide可加速血管平滑肌細(xì)胞鈣化。以上結(jié)果提示FPS可通過(guò)調(diào)節(jié)N-SMase/ceramide抑制血管平滑肌細(xì)胞凋亡和鈣化。綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)：Ox-LDL可激活血管平滑肌細(xì)胞N-SMase的活性增加ceramide的含量，從而促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞凋亡和鈣化。而使用FPS可抑制N-SMase/ceramide信號(hào)通路，從而抑制血管平滑肌細(xì)胞凋亡和鈣化。