魏 麗，連紅梅，劉 鵬，劉興華，吳書一，劉萌萌

（1.鄭州市第三人民醫(yī)院病理科，2.鄭州大學第三附屬醫(yī)院麻醉科室，3.鄭州市第三人民醫(yī)院中心實驗室，河南 鄭州 450000）

葡萄膜黑色素瘤（uveal melanoma，UM）是在眼睛的葡萄膜中產(chǎn)生的黑色素瘤，是成人中最常見的原發(fā)性眼內(nèi)癌。多達50%的葡萄膜黑色素瘤通過血液流動擴散到內(nèi)臟器官并導致患者死亡［1］。葡萄膜黑色素瘤經(jīng)手術切除后，仍然有50%的患者在15年內(nèi)死亡，預后較差［2］。進一步探討葡萄膜黑色素瘤新的預后因素和臨床治療目標，有助于該病的診治。葡萄膜黑色素瘤生長和轉(zhuǎn)移受特異性調(diào)節(jié)劑miRNA的動態(tài)相互作用調(diào)控，其異常表達與葡萄膜黑色素瘤發(fā)生和抑制有關［3］。如，miR-155通過調(diào)節(jié)NDFIP1表達促進葡萄膜黑色素瘤細胞增殖和侵襲［4］，miR-224-5p通過靶向PIK3R3/AKT3抑制葡萄膜黑色素瘤細胞增殖、遷移和侵襲［5］。越來越多的證據(jù)表明，miRNA的表達可以潛在地用作診斷和預后不同腫瘤的生物標志物。已有研究報道m(xù)iR-127在人葡萄膜黑色素瘤細胞中低表達，可通過抑制細胞周期而抑制人葡萄膜黑色素瘤細胞的增殖［6-7］，但是尚未確定miR-127對人葡萄膜黑色素瘤細胞的遷移和侵襲的作用。本文主要探討miR-127-3p對葡萄膜黑色素瘤細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響，以期為葡萄膜黑色素瘤的診斷治療提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

DMEM培養(yǎng)基（上海善然生物科技有限公司，貨號：SH3002.01B），胎牛血清、青霉素和鏈霉素雙抗溶液（上海素爾生物科技有限公司，貨號：16000-044、15140122），SYBR-Green PCR試劑盒（賽默飛世爾科技公司，貨號：4309155），cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（上海捷瑞生物工程有限公司，貨號：GK8030-20），Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑（上海恪敏生物科技有限公司，貨號：11668-027），NCmimic、miR-127-3p mimic、pc-MAPK4質(zhì)粒及各種引物由上海生工生物工程股份有限公司設計并合成，雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（北京原平皓生物技術有限公司，貨號：GN201-01），CCK-8試劑盒（上海炎熙生物科技有限公司，貨號：CT-K-5），Transwell小室（北京明陽科華科技有限公司，貨號：3413），RIPA裂解緩沖液（南京海克爾生物科技有限公司，貨號：SBJ-0999），BCA試劑盒（上海易色醫(yī)療科技有限公司，貨號：BC201），GAPDH抗體、辣根過氧化物酶標記的二抗（上海艾博抗生物科技有限公司，貨號：ab18602、ab6728），p-AKT抗體、AKT抗體、p-mTOR抗體、mTOR抗體（萬類生物科技有限公司，貨號：WLP001a、WLP003b、WL02476、WL02477）。

1.2 組織樣品

從我院行葡萄膜黑色素瘤切除術的患者中獲取組織。所有志愿者均簽署了有關臨床數(shù)據(jù)的書面知情同意書。該研究得到我院研究倫理委員會和臨床醫(yī)學學院的批準，并根據(jù)《赫爾辛基宣言》的道德準則進行。

1.3 細胞及培養(yǎng)

人葡萄膜黑色素瘤細胞系SP6.5、M23、OM431、MUM-2B、C918和OCM-1A和正常葡萄膜上皮細胞系ARPE-19均購自ATCC，于含100 ml/L胎牛血清、100 U/mL的青霉素和100 μg/mL的鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，在37 ℃，體積分數(shù)5%CO2下培養(yǎng)。

1.4 RT-qPCR檢 測miR-127-3p與MAPK4 mRNA的表達

將所有組織樣品剪碎并研磨，采用QIAzol裂解試劑提取總RNA，采用cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。對于細胞培養(yǎng)，將葡萄膜黑色素瘤細胞系SP6.5、M23、OM431、MUM-2B、C918和OCM-1A和正常葡萄膜上皮細胞系ARPE-19接種在6孔板中，當細胞達到近90%融合時，采用QIAzol裂解試劑提取總RNA，采用cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。RT-qPCR采用SYBR-Green PCR試劑盒說明書操作進行。miR-127-3p的循環(huán)條件為：94 ℃20 s和60 ℃34 s的40個循環(huán)，用U6標準化。MAPK4的循環(huán)條件：95 ℃15 s和60 ℃1 min的40個循環(huán)，用GAPDH標準化。每個樣品進行3次重復分析。使用2-ΔΔct方法計算。引物序列如下：miR-127-3p的上游引物序列：5′-TCCGTCT?GAG?CTTGGCTAAA-3′：miR-127-3p的下游引物序 列：5′-TCGGATCCGTCTGAGCTTGGCT-3′ ；MAPK4的上游引物序列：5′-CCGCTCGAGGA?CAACAAGCCGCACCACTACTC-3′，MAPK4的 下游引物序 列：5′-GGGTTTAAACGGTGCTGTGAT?GTGAGGGTGA?C-3′；GAPDH的上游引物序列：5′-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3′，GAPDH的下游引物序列：5′TTGATTTTGGAGG GATCTCG-3′。

1.5 細胞轉(zhuǎn)染

取對數(shù)期細胞，接種于6孔板（1×106/孔）。當達到80% 融合，根據(jù)Lipofectamine 2000說明書將100 nmol/L的mimic-NC、miR-127-3p mimic、pc-MAPK4質(zhì)粒分別或聯(lián)合轉(zhuǎn)染進入SP6.5或OM431細胞。

1.6 雙熒光素酶報告檢測靶向關系

收集生長至對數(shù)期的SP6.5或OM431細胞接種在24孔板中，并孵育24 h。將1 μg螢火蟲熒光素酶報告基因構建體PGL3-MAPK4-WT（MAPK4野生型）或PGL3-MAPK4-MUT（MAPK4突變型）以及miR-127-3p mimic或mimic-NC和PRL-CMV海藻熒光素酶報告質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞，轉(zhuǎn)染48 h后，SP6.5或OM431細胞裂解15 min，雙熒光素酶檢測系統(tǒng)測量熒光素酶的相對活性，用螢火蟲熒光素酶活性和腎熒光素酶活性比值表示熒光素酶的相對活性。

1.7 CCK-8法檢測細胞增殖

將各組細胞消化成單細胞懸液，每孔200 μL接種96孔板（2000/孔）。經(jīng)培養(yǎng)0、24、48、72、96 h后，每孔加入20 μL CCK-8溶液，用酶標儀檢測隔空在450 nm處的吸光值（OD450），繪制細胞增殖曲線。

1.8 流式細胞術檢測細胞凋亡

培養(yǎng)48 h后，胰酶消化轉(zhuǎn)染細胞，離心，按1×106個細胞/mL的濃度重懸。細胞懸液中加入5 μL Annexin-V-FITC和5 μLPI，在黑暗的房間里孵化15 min，然后用流式細胞儀分析細胞凋亡情況。

1.9 劃痕實驗檢測細胞遷移能力

轉(zhuǎn)染后，將SP6.5或OM431細胞以1×106細胞/孔的密度接種在6孔板中，鋪滿單層后，用小號槍頭垂直在孔中間劃痕。在體積分數(shù)5%CO2、37 ℃恒溫的培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后。在劃痕0 h和24 h拍攝的圖像，使用ImageJ評估細胞遷移能力。劃痕閉合率（%）=（0 h時的劃痕面積-24 h時的劃痕面積）/0 h的劃痕面積×100%。

1.10 Transwell法檢測細胞侵襲能力

轉(zhuǎn)染后，將200 μL無血清DMEM中的SP6.5或OM431細胞接種到Matrigel包被的Transwell小室上室中。在Transwell小室下室加入含血清和絲裂霉素C的培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h后，取出Transwell小室下室。用40 g/L多聚甲醛固定，并用結(jié)晶紫染色，在顯微鏡下觀察分析，并在5個隨機視野中對細胞進行計數(shù)，侵入細胞數(shù)表示為每視野的平均細胞數(shù)。

1.11 蛋白印跡法檢測AKT/mTOR通路蛋白相對表達水平

收集各組SP6.5或OM431細胞，用RIPA裂解液提取總蛋白，并用BCA試劑盒檢測蛋白濃度，然后經(jīng)SDS-PAGE分離蛋白后，用半干轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)至PVDF膜，并用脫脂牛奶室溫封閉蛋白2 h，再加入兔來源的單克隆一抗（p-AKT 1∶1 000、AKT 1∶1 000、p-mTOR 1∶500、Mtor 1∶500、GAP?DH 1∶1 000）在4 ℃封閉過夜，接著加入對應山羊抗兔二抗（1∶2 000）室溫封閉1 h，最后滴ECL曝光，以GAPDH為內(nèi)參，使用Quantity One軟件進行分析目標蛋白質(zhì)的相對表達水平。

1.12 統(tǒng)計學分析

所有統(tǒng)計數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0處理，圖形使用GraphPad Prism 6.0構建的。呈正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差表示，各組數(shù)據(jù)均呈正態(tài)分布，方差齊性時，多組計量資料均數(shù)的比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），方差分析有統(tǒng)計學意義時，采用LSD-t法進行兩兩比較。檢驗水準α=0.05（雙側(cè)），P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 MiR-127-3p在葡萄膜黑色素瘤組織和細胞系中下調(diào)，而MAPK4上調(diào)

通過RT-qPCR評估m(xù)iR-127-3p和MAPK4在人葡萄膜黑色素瘤組織及細胞系SP6.5、M23、OM431、MUM-2B、C918和OCM-1A和正常葡萄膜上皮組織及細胞系ARPE-19中的表達表明：與鄰近的正常組織相比，miR-127-3p在人葡萄膜黑色素瘤組織中明顯下調(diào)（P＜0.01；圖1A），而MAPK4明顯上調(diào)（P＜0.01；圖1B）；miR-127-3p的表達與MAPK4的表達在人葡萄膜黑色素瘤組織中呈負相關（圖1C）；與正常葡萄膜上皮細胞系ARPE-19相比，在人葡萄膜黑色素瘤組織及細胞系SP6.5、M23、OM431、MUM-2B、C918和OCM-1A中miR-127-3p明顯下調(diào)（P＜0.01；圖1D），而MAPK4明顯上調(diào)（P＜0.01；圖1E）；并選擇下調(diào)效果比較明顯的SP6.5和OM431細胞系進行后續(xù)實驗。

圖1 葡萄膜黑色素瘤中miR-127-3p和MAPK4 mRNA表達情況Fig.1 The expression of miR-127-3p and MAPK4 mRNA in uveal melanoma

2.2 MiR-127-3p靶向下調(diào)MAPK4

通過TargetScan數(shù)據(jù)庫的預測，miR-127-3p與MAPK4 3′UTR區(qū)存在結(jié)合位點（圖2A）。并通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞C靶向關系，結(jié)果表明：miR-127-3p高表達明顯抑制了含有野生型MAPK4質(zhì)粒的熒光素酶活性（P＜0.01；圖2B），但對突變型MAPK4質(zhì)粒的熒光素酶活性無影響。通過蛋白印跡法檢測各組SP6.5細胞和OM431細胞中MAPK4蛋白的表達：與Control組相比，miR-127-3p mimic組SP6.5細胞和OM431細胞中MAPK4蛋白表達均明顯下調(diào)（P＜0.01；圖2C，D），pc-MAPK4組SP6.5細胞和OM431細胞中MAPK4蛋白表達均明顯上調(diào)（P＜0.01；圖2C，D）；與miR-127-3p mimic組相比，miR-127-3p +pc-MAPK4組SP6.5細 胞和OM431細胞中MAPK4蛋白的表達均明顯上調(diào)（P＜0.01；圖2C，D），表明轉(zhuǎn)染成功，且miR-127-3p靶向下調(diào)MAPK4。

圖2 MiR-127-3p靶向下調(diào)MAPK4Fig.2 MiR-127-3p targeted down-regulation of MAPK4

2.3 MiR-127-3p靶向MAPK4抑制葡萄膜黑色素瘤細胞增殖、誘導凋亡

通 過CCK-8檢測各組SP6.5細胞和OM431細胞增殖情況表明：隨著時間的增長，各組之間的差異逐漸增大；與Control組相比，miR-127-3p mimic組SP6.5細胞和OM431細胞增殖均明顯下降（P＜0.01；圖3A，B），pc-MAPK4組SP6.5細胞和OM431細胞增殖均明顯升高（P＜0.01；圖3A，B）；與miR-127-3p mimic組相比，miR-127-3p+pc-MAPK4組SP6.5細胞和OM431細胞增殖均明顯升高（P＜0.01；圖3A，B），表明miR-127-3p靶向MAPK4抑制葡萄膜黑色素瘤細胞增殖。通過流式檢測各組SP6.5細胞和OM431細胞凋亡情況顯示：與Control組相比，miR-127-3p mimic組SP6.5細胞和OM431細胞凋亡率均明顯增加（P＜0.01；圖3C，D），pc-MAPK4組SP6.5細胞和OM431細胞凋亡率均明顯減少（P＜0.01；圖3C，D）；與miR-127-3p mimic組相比，miR-127-3p+pc-MAPK4組SP6.5細胞和OM431細胞凋亡率均明顯減少（P＜0.01；圖3C，D），表明miR-127-3p靶向MAPK4誘導葡萄膜黑色素瘤細胞凋亡。

圖3 miR-127-3p靶向MAPK4抑制葡萄膜黑色素瘤細胞增殖、誘導凋亡Fig.3 miR-127-3p inhibits proliferation and induces apoptosis of uveal melanoma cells by targeting MAPK4

2.4 MiR-127-3p靶向MAPK4抑制葡萄膜黑色素瘤細胞遷移和侵襲

通過劃痕實驗檢測各組SP6.5細胞和OM431細胞遷移能力發(fā)現(xiàn)：與Control組相比，miR-127-3p mimic組SP6.5細胞和OM431細胞劃痕閉合率均明顯降低（P＜0.01；圖4A，B），pc-MAPK4組SP6.5細胞和OM431細胞劃痕閉合率均明顯升高（P＜0.01；圖4A，B）；與miR-127-3p mimic組相比，miR-127-3p+pc-MAPK4組SP6.5細胞和OM431細胞劃痕閉合率均明顯升高（P＜0.01；圖4A，B），表明miR-127-3p靶向MAPK4抑制葡萄膜黑色素瘤細胞遷移。通過Transwell法檢測各組SP6.5細胞和OM431細胞侵襲能力顯示：與Control組相比，miR-127-3p mimic組SP6.5細胞和OM431細胞每視野侵襲細胞數(shù)目均明顯減少（P＜0.01；圖4C，D），pc-MAPK4組SP6.5細胞和OM431細胞每視野侵襲細胞數(shù)目均明顯增加（P＜0.01；圖4C，D）；與miR-127-3p mimic組相比，miR-127-3p +pc-MAPK4組SP6.5細胞和OM431細胞每視野侵襲細胞數(shù)目均明顯增加（P＜0.01；圖4C，D），表明miR-127-3p靶向MAPK4抑制葡萄膜黑色素瘤細胞侵襲。

圖4 miR-127-3p靶向MAPK4抑制葡萄膜黑色素瘤細胞遷移和侵襲Fig.4 miR-127-3p inhibits migration and invasion of uveal melanoma cells by targeting MAPK4

2.5 MiR-127-3p靶向MAPK4可能抑制葡萄膜黑色素瘤細胞AKT/mTOR通路激活

已知MAPK4過表達通過AKT/mTOR信號的激活促進腫瘤進展［8］，本文對AKT/mTOR信號通路進行研究。通過蛋白印跡法檢測各組SP6.5細胞和OM431細胞中AKT/mTOR通路蛋白的表達發(fā)現(xiàn)：與Control組相比，miR-127-3p mimic組SP6.5細胞和OM431細胞中p-AKT（T308）/AKT、p-mTORr（S473）/mTOR蛋白表達均明顯下調(diào)（P＜0.01；圖5A，B），pc-MAPK4組SP6.5細胞和OM431細胞中p-AKT（T308）/AKT、p-mTOR（S473）/mTOR蛋白表達均明顯上調(diào)（P＜0.01；圖5A，B）；與miR-127-3p mimic組相比，miR-127-3p+pc-MAPK4組SP6.5細胞和OM431細胞中p-AKT（T308）/AKT、p-mTOR（S473）/mTOR蛋白的表達均明顯上調(diào)（P＜0.01；圖5A，B），表明miR-127-3p靶向MAPK4可能抑制葡萄膜黑色素瘤細胞AKT/mTOR通路激活。

圖5 通過蛋白印跡法檢測各組SP6.5細胞和OM431細胞中AKT/mTOR通路蛋白的表達水平Fig.5 The expression levels of AKT/mTOR pathway proteins in SP6.5 cells and OM431 cells were detected by Western blotting

3 討論

葡萄膜黑色素瘤是成年人眼內(nèi)最常見的惡性腫瘤，多發(fā)生于40～50歲中年人，一般為單眼發(fā)病，腫瘤呈單灶性，無遺傳性［9］。一般起源于葡萄膜基質(zhì)內(nèi)的黑色素細胞，瘤體呈深黑色，可向表面輕度隆起［10］。瘤細胞體積較大，呈梭形或多邊形，其內(nèi)含有大量粗大的黑色素顆粒，核為圓形、較小，有些瘤體周邊部可見少量小梭形黑色素性瘤細胞［11］。葡萄膜黑色素瘤主要經(jīng)血行轉(zhuǎn)移至眼外器官或組織，再轉(zhuǎn)移至肝臟最常見，其次為肺、胃腸道、皮膚及中樞神經(jīng)系統(tǒng)或骨骼等部位，發(fā)生全身轉(zhuǎn)移的患者平均存活時間小于7個月［12］。因此，急需探討新的葡萄膜黑色素瘤治療方法。

MiRNA通過調(diào)節(jié)參與細胞增殖，遷移和侵襲的基因，在癌癥的發(fā)病機制中起著至關重要的作用［13-14］。MiRNA的失調(diào)在癌癥中很常見，其中miRNA可能充當癌基因或腫瘤抑制基因。已有研究報道m(xù)iR-127在人葡萄膜黑色素瘤細胞表達下調(diào)，其過表達可抑制人葡萄膜黑色素瘤細胞的增殖［6-7］，但是尚未確定miR-127對人葡萄膜黑色素瘤細胞的遷移和侵襲的作用。但遷移和侵襲是葡萄膜黑色素瘤致死的主要原因。即使在診斷時98%的葡萄膜黑色素瘤患者并沒有轉(zhuǎn)移擴散的跡象，但仍有大約50%的患者會發(fā)展成轉(zhuǎn)移性疾病，且這是迄今為止無法治愈的。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-127-3p抑制葡萄膜黑色素瘤細胞增殖、遷移和侵襲，并誘導細胞凋亡，miR-127-3p在抑制葡萄膜黑色素瘤的發(fā)生和發(fā)展中具有重要作用。

同顏洋等［15］的研究miR-127-3p通過下調(diào)靶基因MAPK4抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤增殖的機制研究相類似，本文研究還發(fā)現(xiàn)miR-127-3p對葡萄膜黑色素瘤細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的作用是通過靶向調(diào)控MAPK4來實現(xiàn)的。絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）是一組可被細胞因子、神經(jīng)遞質(zhì)、激素、細胞應激及細胞黏附等激活的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，對細胞的生長、發(fā)育和分化等生物學功能發(fā)揮重要調(diào)控作用［16］。MAPK4作為MAPK家族成員之一，在包括低度神經(jīng)膠質(zhì)瘤、膠質(zhì)母細胞瘤、皮膚黑色素瘤、腎上腺皮質(zhì)癌、肺腺癌、肺鱗狀細胞癌、乳腺浸潤癌、甲狀腺癌、和膀胱尿路上皮癌等不同類型的癌癥中均觀察到MAPK4的過度表達，表明MAPK4是一種致癌基因，能夠促進腫瘤的生長［17］。本文發(fā)現(xiàn)，miR-127-3p過表達可靶向下調(diào)MAPK4，從而抑制葡萄膜黑色素瘤細胞增殖、遷移和侵襲，并誘導細胞凋亡。

AKT/mTOR信號通路對于調(diào)節(jié)細胞存活、增殖和代謝至關重要，其在癌癥的發(fā)展過程中也起著非常重要的作用。如，腫瘤微環(huán)境通過Akt/mTOR通路促進前列腺癌細胞擴散［18］，五味子乙素通過抑制PI3K/Akt/mTOR通路誘導鼻咽癌細胞凋亡［19］。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-127-3p靶向MAPK4可能抑制葡萄膜黑色素瘤細胞AKT/mTOR通路激活。在AKT激活的經(jīng)典途徑中，磷脂酰肌醇-3-羥激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxykinase，PI3K）催化磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸的產(chǎn)生，該蛋白與AKT的同源性結(jié)構域結(jié)合，從而將AKT募集到質(zhì)膜上并激活［20］。AKT的完全激活需要在重組人丙酮酸脫氫酶激酶同工酶激活環(huán)的Thr308（T308）處進行AKT的磷酸化和在疏水環(huán)中進行Ser473（S473）的磷酸化［21］。mTOR有2個不同的復合物（mTORC1和mTORC2）中，它們與AKT協(xié)同作用［22］。AKT激活mTORC1，這是整合細胞外刺激和營養(yǎng)信號調(diào)節(jié)細胞生長和代謝的重要樞紐，而mTORC2是主要的AKT S473激酶［23］。但MAPK4通過不依賴于PI3K/PDK1的替代途徑直接特異性激活AKT/mTOR。由于MAPK4上含有D254的片段和AKT1上含有K386的片段提供了配對的靜電相互作用，所以MAPK4在T308處直接結(jié)合并磷酸化AKT，并在S473處激活mTORC2磷酸化AKT來進行完全激活［17］。因次，miR-127-3p靶向MAPK4可能通過不依賴于PI3K/PDK1的替代途徑直接特異性抑制AKT/mTOR通路激活。

綜上所述，miR-127-3p在人葡萄膜黑色素瘤中低表達，并可通過靶向下調(diào)MAPK4來抑制葡萄膜黑色素瘤細胞增殖、遷移和侵襲，誘導細胞凋亡，這可能與抑制AKT/mTOR通路激活有關。miR-127-3p和MAPK4均有望成為葡萄膜黑色素瘤診斷的潛在生物靶標。本文僅進行了細胞實驗，動物體內(nèi)實驗還有待進一步研究。