胡宇辰，尹恬恬，李 倩，葉 珊，吳 景，何 杰，

（1.安徽醫(yī)科大學附屬省立醫(yī)院//中國科學技術大學附屬第一醫(yī)院，安徽 合肥 230001；2.安徽醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院，安徽 合肥 230601；3.中國科學技術大學附屬第一醫(yī)院臨床病理中心，安徽 合肥 230001）

膠質母細胞瘤（glioblastoma，GBM）是最常見的顱內原發(fā)性惡性腫瘤，約占所有腦腫瘤的80%［1］，WHO分級為Ⅳ級［2］。目前手術、放療和化療等常規(guī)治療手段療效不佳，大多數(shù)患者預后差、生存期短，中位生存期僅12～14個月［3］，侵襲性生長是惡性的主要特征。ENCODE項目聯(lián)合會目前估算了有超過28 000種不同的LncRNA［4］，廣泛參與各種惡性腫瘤的生物進程，包括腫瘤細胞增殖、侵襲、遷移、凋亡及EMT等功能的調節(jié)，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用［5］。通過研究GBM與LncRNA之間的關系，有可能為其提供一種新的治療策略。肝癌高表達轉錄本（the highly upregulated in 1iver cancer，HULC）是LncRNA的一種，最早發(fā)現(xiàn)于肝細胞癌［6］，并在肺癌、胃癌、結直腸癌等惡性腫瘤中出現(xiàn)異常的表達上調［7-9］，但其與GBM之間的研究尚少，本實驗通過體外細胞實驗及構建小鼠異種移植模型，初步探究了LncRNAHULC對GBM生長的作用機制，并將為后續(xù)更深入的研究及臨床分子靶向治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞系與細胞培養(yǎng)

人腦膠質母細胞瘤U87細胞系（中國典型培養(yǎng)物保藏中心，中國），用含100 mL/L胎牛血清（FBS，Biological Industries，以色列）的DMEM高糖培養(yǎng)基（Biological Industries，以色列）及10 mL/L青霉素/鏈霉素（碧云天生物科技有限公司，中國）培養(yǎng)，通過載體構建、病毒包裝侵染將HULC模擬物及抑制劑和對應的空白載體分別轉染至U87細胞中，再通過致死濃度檢測和穩(wěn)篩株構建獲得過表達組（HULC-over組）及其對照組（VEC組）和沉默表達組（HULC-siRNA組）及其對照組（NC組）穩(wěn)定轉染細胞。并置于37 ℃、體積分數(shù)5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。構建載體過程中，過表達組HULC基因序列號為：NR_004855.2。針對該基因設計shRNA基因序列為：HULC-homo-140-s：GATCCGAACTCTGATCGTGGACATTTCAA?GAGAATGTCCACGATCAGAGTTCTTTTTTG，HULChomo-140-as：AATTCAAAAAAGAACTCTGATCGT?GGACATTCTCTTGAAATGTCCACGATCAGAGTTC?G；shNC-s：GATCCGTTCTCCGAACGTGTCACGTT?TCAAGAGAACGTGACACGTTCGGAGAACTTTTTT?G，shNC-as：AATTCAAAAAAGTTCTCCGAACGT?GTCACGTTCTCTTGAAACGTGACACGTTCGGAGA?ACG。

1.2 qRT-PCR

消化收集U87 HULC-over組及VEC組和HULC-siRNA組及NC組細胞，使用總RNA提取試劑盒（QIAGEN，德國）提取總RNA。使用cDNA逆轉錄試劑盒（Thermo Fisher Scientific，美國），根據(jù)說明書進行互補DNA（cDNA）合成。使用Power SYBR Green Master Mix（Applied Biosystems，美國）和ABI 7500 Fast Real-Time PCR System（Applied Biosystems，美國）定量HULC信使RNA（mRNA）水平，并用2-△△Ct表示HULC mRNA的相對表達量。GAPDH作為HULC的內參，實驗重復3次。

1.3 增殖實驗

分別收集HULC-over組及VEC組和HULCsiRNA組及NC組細胞，重懸計數(shù)并調整細胞濃度。準備4塊96孔板，每組細胞設3個復孔，向每孔加入100 μL細胞懸液（含2 000個細胞），在細胞周圍一圈每孔加入200 μL PBS溶液，置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞貼壁后，取出一塊96孔板，棄去原培養(yǎng)基，每孔加入100 μL 100 mL/L CCK8混合液，置培養(yǎng)箱中孵育2 h后用酶標儀檢測450nm處的吸光度值（OD值），此為24 h OD值，余下的96孔板每孔補加完全培養(yǎng)基100 μL，并依次在48、72和96 h以同樣的方法檢測相應的OD值。實驗重復3次。

1.4 克隆形成實驗

分別收集HULC-over組及VEC組和HULCsiRNA組及NC組細胞。在6孔板中以低密度（300個細胞/孔）接種，每組設3個復孔。4 d后更換培養(yǎng)基，并于10～12 d后終止培養(yǎng)。用40 g/L多聚甲醛固定細胞，并用結晶紫染色。在顯微鏡下計數(shù)大于50個細胞的克隆細胞數(shù)量，克隆形成率（%）=克隆數(shù)/實際接種細胞數(shù)×100%。實驗重復3次。

1.5 凋亡實驗

用不含EDTA的胰酶消化并收集細胞，用預冷PBS洗滌兩遍，然后按照Annexin V-488/PI Apoptosis試劑盒（Invitrogen，美國）進行實驗。最后，通過流式細胞儀檢測。實驗重復3次。

1.6 體內實驗

1.6.1 建立小鼠原位異種移植模型 動物實驗設計經(jīng)中國科學技術大學動物實驗倫理審查委員會批準，符合動物實驗倫理（倫理號：USTCA?CUC1801033），所有的操作和實驗流程均遵守《實驗動物管理條例》，實驗動物由專人飼養(yǎng)于中國科學技術大學實驗動物中心SPF級動物實驗室。隨機將重約17～20 g的40只健康雌性5～7周無胸腺裸鼠（BALB/c-Foxn1nu/Nju，購自南京大學模式動物研究所，SPF級，許可證號：SCXK（蘇）2018-0008）按照注射U87細胞對應分為HULC-over組（n=10）和VEC組（n=10）及HULC-siRNA組（n=10）和NC組（n=10），麻醉后置于單臂數(shù)顯立體定位儀中，于前囟前1 mm，中線右側2～3 mm處以顱骨鉆鉆孔，將懸浮于5 μL PBS的1×106各組細胞分別注射入顱內。以后每3 d觀察小鼠運動能力及神經(jīng)系統(tǒng)體征，并每周稱重1次。當裸鼠出現(xiàn)明顯消瘦，蜷縮不動，對外界刺激無反應等惡病質或神經(jīng)運動功能明顯下降的體征時，對其處以安樂死，并立即剝離腦組織及腫瘤組織，用PBS沖洗后，肉眼查看鼠腦組織表面情況，分辨腫瘤結構以及與周圍腦組織的浸潤程度，并將其固定于40 g/L多聚甲醛中24 h，待進行后續(xù)實驗。

1.6.2 組織切片及免疫組織化學染色 固定后組織經(jīng)取材、脫水、浸蠟，石蠟包埋、切片（厚4 μm），進行HE染色和免疫組化染色。光學顯微鏡診斷鼠腦移植瘤的組織學形態(tài)，并觀察浸潤、血管生長、壞死等特征。全自動免疫組化儀（Roche Ventana，美國）進行Ki67的免疫組織化學染色?？贵w稀釋為1∶200（購自北京中山生物技術有限公司）。PBS替代抗體作為陰性對照。Ki67蛋白定位于細胞核中。陽性染色為淺黃色，黃色或棕色。在顯微鏡下的每個切片上觀察到10個隨機選擇的視野，進行免疫組織化學方法的半定量分析。計算陽性染色細胞的百分比：0分小于5%；1分為6%～25%；2分為26%～50%；3分為51%～75%；4分為＞75%。染色強度等級為0分為陰性，淺黃色為1分；黃色或深黃色2分，棕色或深棕色3分。兩次得分相乘均為免疫組織化學的最終得分。

1.7 統(tǒng)計學分析

使用SPSS 22.0和GraphPad Prism 7軟件分析該研究中的數(shù)據(jù)。呈正態(tài)分布的測量數(shù)據(jù)用平均值±標準差（mean± SD）。兩組獨立樣本間的比較，符合正態(tài)分布及方差齊性的數(shù)據(jù)采用獨立樣本t檢驗（CCK8增殖曲線采用組內RM one-way ANOVA分析，組間獨立樣本t檢驗）。生存期分析采用log-rank（Mantel-Cox）檢驗。P＜0.05時認為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 HULC表達水平檢測

qRT-PCR檢 測HULC表 達，與VEC組相比，HULC-over組中HULC表達顯著升高（圖1A），差異具有統(tǒng)計學意義（t=31.82，P＜0.0001）；與NC組 相比，HULC-siRNA組的HULC表 達水平顯著減少（圖1B），差異具有統(tǒng)計學意義（t=4.84，P=0.008）。

2.2 HULC促進膠質母細胞瘤U87細胞體外增殖

CCK8增殖實驗和克隆形成實驗結果顯示，HULC-over組細胞增殖率高于VEC組，HULCsiRNA組細胞增殖率低于NC組（圖2A，B）。細胞克隆實驗顯示VEC組和HULC-over組克隆形成率分別為（34.47±1.56）%和（95.4±2.74）%；NC組和HULC-siRNA組克隆形成率分別為（23.83±0.92）%和（10.23±0.61）%，HULC-over組克隆形成率高于VEC組，HULC-siRNA組克隆形成率低于NC組（圖2C，D）。實驗證明HULC促進U87細胞體外增殖。上述實驗差異均具有統(tǒng)計學意義（圖2A：HULC-over：F=276.7，P＜0.0001；VEC：F=276.7，P=0.0001；第2天：t=10.6，P＜0.0001，第3天：t=11.48，P＜0.0001，第4天：t=9.91，P＜0.0001；圖2B：HULC-siRNA：F=38.9，P=0.0004；NC：F=1439，P＜0.0001；第2天：t=8.89，P=0.0001，第3天：t=11.51，P＜0.0001，第4天：t=20.77，P＜0.0001；圖2C：t=21.29，P＜0.0001；圖2D：t=18.64，P＜0.0001）。

2.3 HULC抑制膠質母細胞瘤U87細胞凋亡

流式細胞分析顯示，VEC組和HULC-over組早期凋亡率分別為（3.55±0.56）%，（0.09±0.01）%，HULC-over組細胞凋亡率低于VEC組（圖3A），實驗差異具有統(tǒng)計學意義（t=6.21，P=0.0034）；NC組和HULC-siRNA組早期凋亡率分別為（2.89±0.67）%，（7.13±0.14）%，HULC-siRNA組細胞凋亡率高于NC組（圖3B），實驗差異具有統(tǒng)計學意義（t=6.22，P=0.0034）。說明HULC可以抑制細胞凋亡，從而促進細胞增殖。

圖1 U87穩(wěn)轉細胞株中HULC表達水平驗證Fig.1 Verification of HULC expression levels in U87 stably transfected cell lines

圖2 HULC促進U87細胞體外增殖Fig.2 HULC promotes proliferation of U87 cells in vitro

2.4 HULC促進體內膠質母細胞瘤的生長

HULC-over組比HULC-siRNA組小鼠生存期明顯縮短，對照組生存期則在兩者之間（圖4A），實驗差異具有統(tǒng)計學意義（χ2=20.31，P=0.0001）。鼠腦腫瘤組織中，與VEC組相比，HULC-over組中HULC表達顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義（t=5.57，P＜0.000 1）；與NC組相比，HULC-siRNA組的HULC表達水平顯著減少，差異具有統(tǒng)計學意義（t=10.72，P＜0.000 1）。顯微鏡觀察HE切片，低倍鏡下（×40）可見宿主腦組織中腫瘤組織境界不清，呈浸潤性生長（圖4C）；高倍鏡下（×200）可見GBM細胞異型性、核分裂象，腫瘤組織黏液樣變性，地圖狀壞死及血管形成（圖4D）。說明成功構建GBM原位移植瘤模型，并且GBM在鼠腦中呈惡性生長。觀察免疫組化結果（×200），與VEC組相比，Ki67在HULC-over組中蛋白表達水平更高，實驗差異具有統(tǒng)計學意義（t=3.64，P=0.022）；與NC組相比，Ki67在HULC-siRNA組中蛋白表達水平更低（圖4E），實驗差異具有統(tǒng)計學意義（t=4.03，P=0.016）。說明HULC促進GBM體內生長并縮短小鼠生存期。

圖3 HULC抑制U87細胞凋亡Fig.3 HULC inhibits apoptosis of U87 cells

3 討論

膠質母細胞瘤是腦腫瘤中最常見和最具侵襲性的病理類型，其死亡率居高不下，嚴重危害了人類健康。因此，早期診斷對GBM至關重要，而生物標志物更是診治的重中之重［10］。早期研究認為LncRNA是一段長度超過200nt的沒有蛋白質編碼功能的“垃圾基因”［11］。但近年來，越來越多的報道表明，LncRNA在轉錄、翻譯調控及表觀遺傳修飾的過程中發(fā)揮關鍵作用，它們通過與DNA、RNA、蛋白質等分子結合來發(fā)揮生物學功能，包括增殖、凋亡、侵襲及遷移等，在腫瘤的形成及生長過程中發(fā)揮重要作用［12-13］，這為發(fā)現(xiàn)新的生物標志物起到推動作用。

HULC是位于人類基因組6p24.3，長度為500 bp的LncRNA［6］，它已被證實在多種惡性腫瘤中發(fā)揮促癌基因的作用［14-15］。Li等［14］發(fā)現(xiàn)HULC在骨肉瘤中表達上調并促進骨肉瘤的發(fā)生。Xu［15］等發(fā)現(xiàn)HULC通過調節(jié)PTPRO/NF-κB信號通路促進肺鱗狀細胞癌的發(fā)展。本課題組Yan等［16］前期研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA HULC在患者GBM組織和細胞系中的表達水平較正常腦組織明顯上調，提示其可能在GBM中可能發(fā)揮促癌作用。本研究在此基礎上初步分析了LncRNA HULC在GBM發(fā)病機制中的作用。在細胞水平，LncRNA HULC過表達可顯著增強GBM U87細胞增殖能力，并且抑制細胞早期凋亡；在動物水平，LncRNA HULC過表達可促進腫瘤組織生長并減少小鼠生存期。這些研究結果表明，LncRNA HULC在GBM中起癌基因的作用，并可能作為潛在的預后指標。

圖4 上調HULC促進膠質母細胞瘤體內進程，反之則抑制Fig.4 Up-regulation of HULC promote GBM progression in vivo，suppress Conversely

增殖與凋亡之間的不平衡是癌細胞最重要的特征之一。因此，抑制癌細胞增殖或誘導其凋亡都被認為是癌癥的有效治療手段［17］。Wang［18］等研究認為Bcl-2和Bax之間的相互作用在細胞凋亡中起決定性作用，Bcl-2通過抑制細胞色素C的釋放來抑制細胞凋亡，Bax通過促進細胞色素C的釋放和多種caspase依賴性信號通路來誘導細胞凋亡。本研究表明下調LncRNA HULC表達可導致U87細胞凋亡率明顯升高，增殖能力明顯下降。體內實驗表明，下調LncRNA HULC表達可明顯降低腫瘤侵襲性，減少組織壞死，從而延長小鼠生存期，并且Ki67的表達水平明顯降低說明下調LncRNA HULC會抑制腫瘤細胞增殖。故下調LncRNA HULC表達能夠抑制腫瘤生長，促進腫瘤細胞凋亡。大量文獻報道指出PI3K/AKT信號通路是細胞中重要的信號通路，它廣泛參與細胞增殖、凋亡及侵襲等細胞功能的調節(jié)［19］。PI3K/AKT信號通路的異常激活已在多種癌細胞中被證實，其中包括GBM細胞。Rui等［20］指出LncRNA HULC下調可抑制大鼠垂體腺瘤GH3細胞的增殖、遷移及激素分泌，并促進其凋亡，其機制是HULC與miR-130b相互作用，下調FOXM1的表達，從而抑制了PI3K/AKT信號通路。Miao等［21］研究認為PI3K/AKT信號通路是驅動腫瘤細胞異常增殖，分化和侵襲的關鍵，EMP1可通過激活PI3K/AKT信號通路促進GBM細胞增殖［21］。據(jù)報道AKT的激活可以磷酸化多種下游靶分子，例如Bcl-2家族，糖原合酶激酶3（GSK3）和細胞周期蛋白G1，它們對細胞存活，細胞增殖和凋亡具有重要影響［18］。因此可以推測，LncRNA HULC可能通過PI3K/AKT信號通路調節(jié)Bcl-2/Bax蛋白及細胞周期蛋白G1的表達來影響GBM細胞的增殖及凋亡，相關通路及蛋白水平的研究有待進一步的驗證。

綜上所述，LncRNA HULC在體內、體外均有促進GBM生長的作用，后期我們將進一步探究該LncRNA與靶基因之間的分子機制，這將為發(fā)現(xiàn)新的生物標志物及GBM治療靶點提供理論依據(jù)。