段亞妮，木拉提·阿比來(lái)列提，朱雁秋，唐鐳蕾，朱俊穎，覃 杰

（1.中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院放射科，廣東廣州 510630；2.喀什地區(qū)第一人民醫(yī)院心內(nèi)科，新疆喀什 844000）

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）是臨床上常見(jiàn)的危急重癥之一，我國(guó)AMI的發(fā)病率逐年升高［1］。傳統(tǒng)的藥物、介入及外科手術(shù)治療只能延緩心梗后心衰的發(fā)展［2］。近年來(lái)興起的干細(xì)胞治療心肌梗死表現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cell，BMSC）由于其易得性，被大量應(yīng)用于心肌梗死的研究之中［3-5］。BMSC有多種發(fā)揮作用的方式，包括旁分泌作用、免疫調(diào)節(jié)、分化為心肌和血管等，其中旁分泌作用及免疫調(diào)節(jié)均要求BM?SC遷移至缺血心肌附近。因此提高BMSC的遷移率是改善干細(xì)胞治療心肌梗死療效的重要途徑。LncRNA是一種長(zhǎng)度＞200 nt的非編碼RNA［6-7］。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，許多l(xiāng)ncRNA在間充質(zhì)干細(xì)胞的調(diào)控中發(fā)揮重要作用［8］。XIST是一種定位于X染色體失活中心（XCI）的非編碼RNA，參與雌性X染色體的失活［9］。XIST在多數(shù)腫瘤中上調(diào)，并促進(jìn)腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移［10］。但其是否參與BMSC的遷移及其機(jī)制尚不清楚。趨化因子受體4（chemokine re?ceptor 4，CXCR4）是一種趨化因子受體，其配體是基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1（stromal cell-derived factor，SDF-1），SDF-1/CXCR4是已知參與細(xì)胞遷移的最重要的信號(hào)通路［11］。因此，本研究通過(guò)siRNA干擾BMSC中l(wèi)ncRNA Xist的表達(dá)，從而探討lncRNA Xist在BMSC增殖、遷移中的作用，同時(shí)研究其與SDF-1/CXCR4軸的關(guān)系，為提高間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療心肌梗死時(shí)移植細(xì)胞遷移率提供方向。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞與動(dòng)物 Sprague-Dawley（SD）大鼠，雌性SPF級(jí)，3周齡，動(dòng)物質(zhì)量合格編號(hào)為No.44002100021160，用于大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的提取，購(gòu)自中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)條件遵照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境及設(shè)施國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（GB14925-2001）》規(guī)定，對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的處理根據(jù)中山大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物操作標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。

1.1.2 試劑 胰酶（Gibco，美國(guó)）；胎牛血清（Gib?co，美國(guó)）；L-DMEM培養(yǎng)基（Gibco，美國(guó)）；Lipo?fectamine 2000（Invitrogen，美國(guó)）；siRNA（銳博，中國(guó)）；Trizol（Invitrogen，美國(guó)）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Taka?ra，日本）；qPCR試劑盒（Takara，日本）；β-tubulin抗體（Cell Signaling Technology，美國(guó)）；CXCR4抗體（Abcam，美國(guó)）；Transwell小室（Corning，美國(guó)）；CD34-FITC抗體（BD，美國(guó)）；CD90-PE抗體（BD，美國(guó)）；CD105-Alexa Fluor 647（BD，美國(guó)）；CD11b-FITC抗體（Biolegend，美國(guó)）；CD45-FITC抗體（Bio?legend，美國(guó)）；CD44-FITC抗體（Biolegend，美國(guó)）。

1.2 方 法

1.2.1 大鼠BMSC的分離與培養(yǎng) 取3周齡SD雌性大鼠，腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉后斷頸處死，75%乙醇浸泡5 min，超凈臺(tái)中分離雙側(cè)脛腓骨，剪斷兩側(cè)干骺端，用含10% FBS L-DMEM培養(yǎng)基沖洗至骨髓腔發(fā)白，收集BMSC，置于體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h半量換液，72 h全量換液，待細(xì)胞長(zhǎng)滿后傳代。

1.2.2 流式細(xì)胞術(shù)鑒定BMSC取P3細(xì)胞，消化計(jì)數(shù)，離心后用PBS重懸至2×107/mL，向流式檢測(cè)管中各加入50 μL細(xì)胞懸液及50 μL PBS，按照各抗體使用說(shuō)明加入適宜體積的抗體，并用PBS補(bǔ)齊至20 μL。冰上及搖床上孵育30 min后，離心棄上清，加入PBS重懸，重復(fù)3次，最后補(bǔ)齊至500 μL用于流式檢測(cè)。

1.2.3 總RNA提取-逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)用Trizol試劑提取總RNA并檢測(cè)濃度及純度，并根據(jù)Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)反轉(zhuǎn)錄成cD?NA。qPCR所用引物均由上海生工生物公司合成，以GAPDH作為內(nèi)參基因，相關(guān)引物序列如下：GAPDH上游5′-CAAGGTCATCCATGACAACTTTG-3′和下游5′-GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG-3′；Xist上 游5′-CAAGGCTGCGGACTGTCATCATAG-3′和下游5′-CTGCTGAAGGTGGTGGTGTGAG-3′；SDF-1上游5′-CGAGAGTCACTCAGCTCAAGGTT?G-3′和下游5′-GCATTGGCAGGTCAGGCTACAG-3′；CXCR4上游5′-CAGCCTGTGGATGGTGGTGTT?C-3′和下游5′-CCTTGGAGTGTGACAGCTTGGA?G-3′；根據(jù)Takara qPCR試劑盒說(shuō)明書(shū)配置qPCR反應(yīng)體系，擴(kuò)增反應(yīng)條件設(shè)置為預(yù)變性95 ℃30 s；PCR反應(yīng)：95 ℃3 s，60 ℃30 s，循環(huán)40次。

1.2.4 細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 根據(jù)Lipofectamine 2000說(shuō)明書(shū)，將適宜濃度si-Xist或si-NC轉(zhuǎn)染到BMSC細(xì)胞中，4～6 h換液后繼續(xù)培養(yǎng)。相關(guān)siRNA靶序列如下，si-Xist1：5′-GCACGATCAAGAAATGTAA-3′；si-Xist2：5′-GGAATGAGATAATGCTTAA-3′；si-Xist3：5′-GAATAGTAGAAATAGTTAA-3′；si-NC為與大鼠所有基因無(wú)同源性的隨機(jī)序列，由銳博公司提供。

1.2.5 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖能力 轉(zhuǎn)染48 h后消化各組細(xì)胞，以5 000個(gè)/孔的密度接種至96孔板中，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，置于體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于12、24、48 h 3個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行CCK-8檢測(cè)。檢測(cè)時(shí)每孔加入10 μL CCK-8試劑，37 ℃孵育40～50 min，酶標(biāo)儀450 nm處檢測(cè)吸光度值，去除大小值后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.6 劃痕實(shí)驗(yàn)及Transwell遷移實(shí)驗(yàn) 劃痕實(shí)驗(yàn)：在六孔板底部用馬克筆劃五條平行橫線，轉(zhuǎn)染后待細(xì)胞長(zhǎng)到80%左右時(shí)，用200 μL槍頭在每孔相同位置作縱向劃痕，利用縱向劃痕與橫線標(biāo)記的交點(diǎn)定位，在倒置顯微鏡下定點(diǎn)拍照。5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，在與之前相同位置拍照。Image J軟件測(cè)量劃痕區(qū)域面積。計(jì)算傷口愈合百分比，傷口愈合百分比（%）=（1-24 h劃痕面積/0 h劃痕面積）×100%。Transwell遷移實(shí)驗(yàn)：使用無(wú)血清培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/mL，上室加入300 μL細(xì)胞懸液，下室加入500 μL 20%FBS L-DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h，PBS清洗兩次，加入40 g/L多聚甲醛固定20 min，PBS清洗兩遍，1%結(jié)晶紫染色液染色10 min，用PBS清洗至干凈為止，拍照前用棉簽?zāi)ㄈド蠈游催w移細(xì)胞，隨機(jī)取10個(gè)視野（100×）在正置顯微鏡下拍照，計(jì)算各孔遷移細(xì)胞數(shù)。

1.2.7 免疫印跡檢測(cè) 常規(guī)提取細(xì)胞總蛋白，檢測(cè)膜蛋白時(shí)免去煮沸步驟。用適宜濃度SDSPAGE凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，5% BSA封閉1 h，必要時(shí)麗春紅染色查看蛋白條帶，1×TBST洗膜后4 ℃孵育一抗過(guò)夜，1×TBST洗膜10 min 3次，室溫孵育相應(yīng)二抗1 h，1×TBST洗膜10 min 3次，加入ECL工作液，于凝膠成像儀中檢測(cè)蛋白條帶。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

統(tǒng)計(jì)分析采用IBM SPSS Statistics 25軟件，呈正態(tài)分布的定量數(shù)據(jù)表示為Mean±SD，兩組間比較，數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布且方差齊的數(shù)據(jù)采用t檢驗(yàn)；呈正態(tài)分布但方差不齊的數(shù)據(jù)采用秩和檢驗(yàn)。多組間比較數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布且方差不齊，采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的單因素方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用Games-Howell檢驗(yàn)。所有統(tǒng)計(jì)學(xué)分析均為雙側(cè)檢驗(yàn)，α=0.05，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BMSC的鑒定

BMSC P3代細(xì)胞呈梭形、漩渦狀生長(zhǎng)；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD11b、CD34、CD45、CD44、CD90、CD105表達(dá)，BMSC陽(yáng)性表達(dá)CD44、CD90、CD105，而陰性表達(dá)CD11b、CD34、CD45，符合BMSC表面標(biāo)志物的特征，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)（圖1）。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)鑒定BMSCFig.1 Identification of BMSC with flow cytometry

2.2 篩選lncRNA Xist沉默效率高的siRNA

設(shè)計(jì)3條siRNA，分別用siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3及陰性對(duì)照si-NC轉(zhuǎn)染BMSC，48 h后qRT-PCR檢測(cè)lncRNA Xist的相對(duì)表達(dá)量。經(jīng)方差分析4組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=2 748，P＜0.001），進(jìn)一步進(jìn)行Games-Howell檢驗(yàn)，除siR?NA-1組和siRNA-2組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，其他任何兩組間在沉默lncRNA Xist效率上的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。即3條siRNA均對(duì)lncRNA Xist有沉默作用，沉默效率分別為67.92%、68.72%、98.32%，沉默效率最佳的siRNA-3被用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)（圖2）。

2.3 lncRNA Xist對(duì)BMSC增殖和遷移能力的影響

2.3.1 lncRNA Xist對(duì)BMSC增殖能力的影響 分別使用si-Xist和si-NC轉(zhuǎn)染BMSC P3細(xì) 胞，轉(zhuǎn)染后消化至96孔板中，分別于12 h、24 h、48 h行CCK-8實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)450 nm處吸光度值。12 h時(shí)si-Xist組與si-NC組OD值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=-1.732，P=0.083）。24 h時(shí)si-Xist組OD值為0.940±0.056，si-NC組OD值 為1.217±0.062，48 h時(shí)，si-Xist組OD值為1.145±0.063，si-NC組OD值為1.460±0.092。24 h及48 h時(shí)，si-Xist組吸光度值明顯低于si-NC組（t24h=6.639，P＜0.001；t48h=5.668，P=0.001；圖3A）。

圖2 三條siRNA對(duì)lncRNA Xist沉默效率的比較Fig.2 Comparison of silencing efficiency of three siRNAs in silencing lncRNA Xist

2.3.2 lncRNA Xist對(duì)BMSC遷移能力的影響 分別使用si-Xist和si-NC轉(zhuǎn)染BMSC P3細(xì)胞，待細(xì)胞長(zhǎng)滿后行劃痕實(shí)驗(yàn)，分別在0 h、24 h拍照，測(cè)量劃痕區(qū)域面積，計(jì)算傷口愈合百分比。si-Xist組和si-NC組傷口愈合百分比分別為（16.3±6.3）%、（41.2±8.4）%，si-Xist組傷口愈合百分比明顯低于si-NC組（t=4.105，P=0.015）（圖3B、C）。轉(zhuǎn)染后48 h行Transwell遷移實(shí)驗(yàn)，遷移6 h后拍照計(jì)數(shù)。si-Xist組和si-NC組遷移細(xì)胞數(shù)（個(gè)）分別為139±21、326±15，si-Xist組遷移細(xì)胞數(shù)明顯低于si-NC組（t=12.56，P＜0.001；圖3D、E）。

圖3 lncRNA Xist對(duì)BMSC增殖和遷移能力的影響Fig.3 Effects of lncRNA Xist on BMSC proliferation and migration

2.4 lncRNA Xist調(diào)控SDF-1/CXCR4軸

圖4 lncRNA Xist對(duì)BMSC SDF-1/CXCR4軸的影響Fig.4 Effect of lncRNA Xist on BMSC SDF-1/CXCR4 axis

分別使用si-Xist和si-NC轉(zhuǎn)染BMSC P3細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后48 h，提取總RNA進(jìn)行qRT-PCR，分別檢測(cè)GAPDH、Xist、CXCR4、SDF-1 mRNA。在干擾lncRNA Xist表達(dá)后，si-Xist組lncRNA Xist相對(duì)表達(dá)量明顯降低，相當(dāng)于si-NC組的0.43±0.08倍（t=11.02，P＜0.001）；同時(shí)，干擾后si-Xist組CX?CR4 mRNA的相對(duì)表達(dá)量下降為si-NC組的0.59±0.12倍（t=4.60，P=0.010）；兩組間SDF-1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-1.14，P=0.318；圖4A）。轉(zhuǎn)染后72 h，提取總蛋白進(jìn)行western blot檢測(cè)，si-Xist組和si-NC組灰度值分別為0.56±0.04、0.72±0.07，即si-Xist組CXCR4蛋白相對(duì)表達(dá)量低于si-NC組（t=3.32，P=0.029；圖4B、C）。

3 討論

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)在降低lncRNA Xist的表達(dá)后，BMSC的遷移能力下降，其機(jī)制可能是ln?cRNA Xist通過(guò)降低BMSC膜受體CXCR4的表達(dá)，從而抑制BMSC遷移。

間充質(zhì)干細(xì)胞治療心肌梗死有多種機(jī)制，包括免疫調(diào)節(jié)和抗炎作用、抗纖維化、分化為心肌和血管等，其發(fā)揮作用要求BMSC歸巢至缺血心肌附近，因此提高BMSC的遷移能力是改善干細(xì)胞治療心梗療效的第一步［12］。許多研究者對(duì)此作了諸多探索，如低氧預(yù)適應(yīng)、細(xì)胞因子預(yù)處理、基因修飾等［13］。LncRNA作為一種非編碼RNA，由于其廣泛的調(diào)節(jié)作用，有望成為干細(xì)胞修飾的新靶點(diǎn)，如LOC101928674等參與調(diào)節(jié)MSC的免疫功能［14］，lncTCF7可在缺氧條件下維持MSCs的干性［15］，LincRNA-p21在體外促進(jìn)缺氧條件下MSCs的遷移和存活等［16］。LncRNA XIST是一種位于雌性失活X染色體上的長(zhǎng)鏈非編碼RNA，lncRNA XIST在腫瘤中的研究較多，如在非小細(xì)胞癌、乳腺癌、肝癌等多種腫瘤中均表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移［10］。但lncRNA XIST在BMSC中的作用尚不清楚。我們?cè)谇玫虰MSC中l(wèi)ncRNA Xist的表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)BMSC的增殖能力和遷移能力均顯著下降，提示lncRNA Xist參與了BMSC遷移的調(diào)節(jié)，與其在腫瘤中觀察到的作用一致。

CXCR4是一種重要的趨化因子，可與配體SDF-1結(jié)合，共同參與趨化過(guò)程，是參與間充質(zhì)干細(xì)胞遷移與歸巢的主要信號(hào)通路［11］。我們的研究發(fā)現(xiàn)，在敲低lncRNA Xist后，BMSC中SDF-1的表達(dá)量無(wú)明顯變化，而CXCR4在mRNA和蛋白水平的表達(dá)量均顯著下降，提示lncRNA Xist可能直接或間接地作用于CXCR4，從而參與BMSC的遷移過(guò)程。另外，我們觀察到，在干擾lncRNA Xist后，CXCR4表達(dá)在mRNA和蛋白水平雖然均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但在mRNA水平的變化較蛋白水平更為明顯，提示可能還有其他機(jī)制參與CXCR4的表達(dá)調(diào)節(jié)，如轉(zhuǎn)錄后磷酸化修飾等，這有待于進(jìn)一步研究證實(shí)。此外需要注意的是，在轉(zhuǎn)染時(shí)，由于受細(xì)胞狀態(tài)、細(xì)胞密度的影響，每次實(shí)驗(yàn)siRNA的沉默效率之間的差異較大，我們?cè)诿看无D(zhuǎn)染后，qPCR檢測(cè)同批同組細(xì)胞中的lncRNA Xist的表達(dá)量，以此保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。

盡管我們初步證明了lncRNA Xist可通過(guò)CXCR4來(lái)調(diào)節(jié)BMSC的增殖和遷移能力，但研究仍存在許多不足之處。首先，本研究?jī)H做了低表達(dá)實(shí)驗(yàn)，未進(jìn)行過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)，因此不能完全確證lncRNA Xist的作用。其次，由于沒(méi)有在體外模擬缺氧環(huán)境，因而不能反映體內(nèi)復(fù)雜環(huán)境下BMSC的遷移過(guò)程。此外，本實(shí)驗(yàn)僅證明lncRNA Xist可以通過(guò)CXCR4發(fā)揮作用，但未對(duì)調(diào)控lncRNA Xist和直接調(diào)控CXCR4對(duì)BMSC的影響進(jìn)行對(duì)比，這有待于進(jìn)一步的研究。