孫麗娜，黃開華，高新華，陳 偉，白娜玲 ，呂衛(wèi)光*

（1.上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境保護(hù)研究所，上海 201403；2.上海低碳農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心，上海 201403）

氯氰菊酯屬擬除蟲菊酯類殺蟲劑之一，是1983年由Shell International Chemical公司（現(xiàn)為BASF）產(chǎn)業(yè)化開發(fā)[1]，具有廣譜殺蟲作用。氯氰菊酯可用作棉花、蔬菜、果樹、茶樹、大豆等作物上害蟲的防治。對棉花和果樹上的鱗翅目、半翅目、雙翅目、直翅目、鞘翅目、膜翅目等多種害蟲均有較好的防治效果[2]。因此，菊酯類殺蟲劑在世界范圍內(nèi)得到廣泛應(yīng)用，目前占我國農(nóng)業(yè)殺蟲劑使用面積的三分之一以上。但過度和廣泛的使用會對人體健康和生態(tài)環(huán)境安全造成威脅。研究表明，經(jīng)常接觸氯氰菊酯會產(chǎn)生免疫毒性[3]，而且此類農(nóng)藥容易在人體內(nèi)積累，引發(fā)各種慢性疾病[4]。近年來，已有多次關(guān)于氯氰菊酯蔬菜殘留的報道。李曉莉[5]于2008—2011年間對淄博市蔬菜中擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留進(jìn)行了檢測，其中氯氰菊酯殘留量最高。雷雨等[6]于2016年調(diào)查了定西地區(qū)市售蔬菜擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留，其總檢出率為45.0%，超標(biāo)率為0.04%，超標(biāo)農(nóng)藥主要為氯氰菊酯和高效氯氰菊酯。因此，有關(guān)氯氰菊酯殘留的生物修復(fù)得到了廣泛關(guān)注。

植物內(nèi)生菌是指真菌或細(xì)菌一生中的某個階段能進(jìn)入活體植物組織內(nèi)，并在植物內(nèi)不引起明顯組織變化的微生物[7]。植物內(nèi)生菌通常歸屬于宿主植物所栽種土壤中普遍存在的特殊屬，是植物組織內(nèi)的有益菌落[8]。研究表明，植物內(nèi)生細(xì)菌產(chǎn)生的酶類、生長素等次生代謝產(chǎn)物，能調(diào)節(jié)植物代謝，促進(jìn)生長，提升植物耐受性[9-11]。與從土壤中分離的降解菌株相比，植物內(nèi)生菌能有效定殖在植物體內(nèi)，促進(jìn)植物對污染物的吸收、轉(zhuǎn)化和降解，從而減輕污染物對植物的毒害作用。因此，亟需篩選具有氯氰菊酯降解特性的植物功能內(nèi)生菌。

本研究通過富集篩選得到一株以氯氰菊酯為唯一碳源生長的植物內(nèi)生細(xì)菌，并系統(tǒng)研究了其生物學(xué)特性和降解功能，以期為利用功能內(nèi)生細(xì)菌來調(diào)控植物代謝氯氰菊酯，進(jìn)而有效地規(guī)避作物污染風(fēng)險提供新途徑。

1 材料方法

1.1 試驗(yàn)材料

氯氰菊酯（純度＞98%）購于Sigma公司，甲醇為色譜純，其余試劑為分析純。

供試植株牛筋草 Eleusine indica（L.）Gaertn.，采自上海郊區(qū)某農(nóng)藥廠附近（30°55′N，121°03′E）。植株生長良好，采集后立即帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行菊酯降解菌的分離篩選。

1.2 培養(yǎng)基

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)需求，查詢相關(guān)文獻(xiàn)[12]中培養(yǎng)基的配制，以1000 mL液體培養(yǎng)基為標(biāo)準(zhǔn)。

Luria-Bertani（LB）培養(yǎng)基：10 g胰蛋白胨，5 g酵母膏，10 g氯化鈉，1000 mL去離子水，pH 7.0～7.2。固體培養(yǎng)基是在每1000 mL液體培養(yǎng)基中加入15～20 g瓊脂粉，121℃高壓蒸汽滅菌20 min。

無機(jī)鹽培養(yǎng)基（MSM）：0.4 g MgSO4·7H2O，0.2 g FeSO4· 7H2O，0.2 g K2HPO4，0.2 g（NH4）2SO4，0.08 g CaSO4，1000 mL去離子水，pH 7.0～7.2。固體培養(yǎng)基是在每1000 mL液體培養(yǎng)基中加入15～20 g瓊脂粉，121℃高壓蒸汽滅菌20 min。

菊酯降解培養(yǎng)基：將菊酯原藥溶于二甲基亞砜（色譜純度）配制成濃度為10 000μL·L-1的母液，過濾除菌，然后加入至已滅菌的MSM培養(yǎng)液，菊酯的終濃度為20 mg·L-1。

1.3 功能植物內(nèi)生細(xì)菌的分離篩選

取適量新鮮的植株樣本，用無菌水將植株表面附帶的灰塵泥土沖洗干凈，使植物表面沒有污跡，然后自然風(fēng)干。用75%酒精漂洗3～5 min，然后用無菌水沖洗3～4次，再用無菌水沖洗5次。將表面消毒沖洗好的植物組織放置于已滅菌的研缽內(nèi)研磨，吸取汁液均勻涂布于LB培養(yǎng)基平板上，于30℃條件下避光培養(yǎng)2～7 d。將最后一次沖洗的水涂布到LB培養(yǎng)基上作為對照，以檢驗(yàn)表面消毒的效果。待長出菌落后挑取單菌落進(jìn)一步劃線，以菊酯降解培養(yǎng)基來分離純化。選取能連續(xù)5次在氯氰菊酯作為唯一碳源的無機(jī)鹽培養(yǎng)基上生長的菌株，保存于LB培養(yǎng)基斜面上供進(jìn)一步研究。利用氣相色譜測定氯氰菊酯的含量，采用稀釋平板法測定菌株的細(xì)胞數(shù)量，確定降解菌株對氯氰菊酯的降解能力及生長情況。

1.4 菌株的鑒定

將分離得到的降解菌株命名為A-24，并對其進(jìn)行菌落形態(tài)學(xué)、細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察[13]及16SrDNA序列同源性比對分析，確定其分類地位。采用高鹽法提取菌體DNA[14]，擴(kuò)增降解菌株16SrRNA基因序列。引物為16SrRNA基因序列通用引物[15]，正向引物27F序列為5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，反向引物1492R序列為5′-TACCTTGTTACGACTT-3′。擴(kuò)增產(chǎn)物用AXYGEN核酸純化試劑盒純化回收，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測回收的DNA片段純度和大?。s1.5 kb），然后進(jìn)行TA克隆，測序。TA克隆體系（5μL）為：pMD18-T 0.5μL，DNA片段2μL，Solution I（TaKaRa）2.5μL，16℃酶連過夜。將測序結(jié)果在Ez?Taxon（http：//eztaxon-e.ezbiocloud.net/）上進(jìn)行在線比對分析[16]。

1.5 菌株A-24降解氯氰菊酯與其生長關(guān)系的測定

挑取A-24單菌落接種至含20 mg·L-1氯氰菊酯的100 mL LB培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r·min-1振蕩培養(yǎng)至對數(shù)期，6000 r·min-1離心收集菌體，使用MSM洗滌菌體兩次，最后用MSM重懸，調(diào)節(jié)菌體濃度為1.0×109CFU·mL-1，作為種子液備用。將1%的菌株A-24接種到菊酯降解培養(yǎng)基中，在30℃、180 r·min-1條件下培養(yǎng)，每12 h取樣一次，測定培養(yǎng)液中氯氰菊酯的含量和菌株A-24的生長量（CFU·mL-1）。

1.6 不同碳源和氮源對菌株生長的影響

將菌株以2%接種量接種到100 mL基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中，分別添加0.5%（V/m）的麥芽糖、糊精、蔗糖、葡萄糖、果糖和淀粉作為碳源，30 ℃、180 r·min-1振蕩培養(yǎng)48 h，分別測定各樣品在OD600處的吸光值，每個處理3次重復(fù)。

將菌株以2%接種量接種到100 mL基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中，分別添加0.5%（V/m）的尿素、硝酸鉀、牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、亞硝酸鈉、硫酸銨、硝酸銨作為氮源，30 ℃、180 r·min-1振蕩培養(yǎng)48 h，分別測定各樣品在OD600處的吸光值，每個處理3次重復(fù)。

1.7 菊酯降解特性研究

在菊酯降解培養(yǎng)基中，按2%接種量接入A-24菌株種子液，分別于20、25、30、35、42℃和45℃條件下，180 r·min-1搖床培養(yǎng)，48 h后取樣檢測菊酯殘留量，計算降解率，確定溫度對菌株降解聯(lián)苯菊酯的影響。

在初始pH分別為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0的MSM培養(yǎng)基中，加入20 mg·L-1的菊酯，按2%接種量接入菌株的種子液，于30℃、180 r·min-1搖床培養(yǎng)，48 h后取樣檢測菊酯殘留量，計算降解率，確定pH對菌株降解菊酯的影響。設(shè)置空白對照。采用乙酸鈉緩沖液調(diào)節(jié)pH 5.0、6.0，磷酸鈉緩沖液調(diào)節(jié)pH 6.0～8.0，Tris-HCl緩沖液調(diào)節(jié)pH 8.0～10.0。

在添加氯氰菊酯終濃度分別為20、50、100 mg·L-1和150 mg·L-1的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，按2%接種量接入A-24菌株種子液，于30 ℃、180 r·min-1搖床培養(yǎng)，48 h后取樣檢測菊酯殘留量，計算降解率，確定初始氯氰菊酯濃度對菌株A-24降解率的影響。對照是添加相應(yīng)二甲基亞砜溶劑到無鹽培養(yǎng)基中，并在相同條件下培養(yǎng)。

在菊酯降解培養(yǎng)基中，分別按0.5%、1%、2%、5%和10%接種量接入A-24菌株種子液，于30℃、180 r·min-1搖床培養(yǎng)，48 h后取樣檢測菊酯殘留量，計算降解率，確定接種量對菌株A-24降解氯氰菊酯的影響。

1.8 氯氰菊酯含量測定及降解產(chǎn)物檢測

氯氰菊酯含量測定采用全量提取法：在20 mL培養(yǎng)基中加20 mL二氯甲烷，劇烈振蕩3 min后，靜置分層，取有機(jī)相經(jīng)無水Na2SO4脫水，然后準(zhǔn)確取1 mL有機(jī)相置于2 mL離心管中，并在通風(fēng)柜內(nèi)揮發(fā)后，重新定容到1 mL色譜純正己烷中，氣相色譜檢測氯氰菊酯濃度。氣相色譜檢測條件：ECD檢測器、SPB-5毛細(xì)管柱（30.0 mm×0.530 mm×1.5μm），進(jìn)樣口溫度240℃，柱溫240℃，檢測器溫度310℃，載氣為氮?dú)?，流速? mL·min-1[17]。

降解產(chǎn)物檢測采用全量提取法：準(zhǔn)確取1 mL有機(jī)相置于2 mL離心管中，并在通風(fēng)柜內(nèi)揮發(fā)，最后定容到1 mL乙腈/水（60/40，V/V，用甲酸酸化pH為3.0）溶液中，采用高效液相色譜法對降解產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。高效液相色譜（HPLC）檢測條件：液相色譜柱為C18反相柱，規(guī)格250 mm×4.6 mm；流動相為乙腈∶水（60∶40，V∶V）；加入甲酸，pH調(diào)為3.0，柱溫為30 ℃；流速1.0 mL·min-1；檢測波長270 nm[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離篩選

從上海郊區(qū)某農(nóng)藥廠附近采集植物樣品牛筋草，從其根莖中分離到1株降解氯氰菊酯的內(nèi)生菌，命名為A-24。菌株A-24的菌落圓形隆起、奶油狀、邊緣整齊，其生理生化特征為：需氧，革蘭氏染色呈陰性，氧化酶、脲酶和過氧化氫酶呈陽性，硝酸還原酶和淀粉水解酶呈陰性。

通過引物27F和1492R對菌株A-24的16SrRNA進(jìn)行擴(kuò)增，獲得1398 bp的基因序列，將該序列提交到GenBank，登錄號為MK454541。將菌株A-24的16S rRNA基因序列在數(shù)據(jù)庫EzBilCloud中比對分析，結(jié)果顯示菌株A-24與Achromobacter屬親緣關(guān)系最近，其中與Achromobacter xylosoxidans NBRC 15126T相似性達(dá)99.00%，與Achromobacter marplatensis B2T相似性達(dá)98.76%。運(yùn)用MEGA5.0軟件通過Neighbor-join?ing法對菌株A-24構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1），結(jié)果表明，菌株A-24與菌株Achromobacter xylosoxidans NBRC 15126T位于同一分支。結(jié)合菌落形態(tài)特性、生理生化特征以及16SrRNA基因比對分析，菌株A-24初步鑒定為Achromobacter屬。

圖1 基于16SrRNA基因序列構(gòu)建的菌株A-24系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 1 Phylogenetic tree constructed by the neighbor-joining analysis based on 16SrRNA gene sequences of strain A-24 and related species

2.2 菌株A-24以氯氰菊酯為唯一碳源的降解和生長曲線

氯氰菊酯的含量和菌株A-24的生長量結(jié)果如圖2所示。菌株A-24在48 h內(nèi)對20 mg·L-1氯氰菊酯的降解率為91.8%，72 h內(nèi)完全降解氯氰菊酯。菌株A-24在降解氯氰菊酯的過程中能夠利用其作為唯一碳源生長，菌體生長在12 h前為延滯期，12～60 h為對數(shù)期，由最初1.32×107CFU·mL-1增加至 6.92×107CFU·mL-1。表明菌株A-24能夠降解氯氰菊酯，并能夠利用氯氰菊酯作為碳源和能源生長。

圖2 菌株A-24降解氯氰菊酯及其生長曲線Figure 2 The growth of stain A-24 and degradation of cypermethrin by A-24

2.3 不同碳源和氮源對菌株A-24生長的影響

各碳源對菌株A-24生長的影響結(jié)果如圖3A。培養(yǎng)基MSM中添加果糖時菌株A-24在OD600處的吸光值最高，麥芽糖其次，葡萄糖最低。

各氮源對菌株A-24生長的影響結(jié)果如圖3B。菌株A-24在OD600處的吸光值隨著時間的增加而增加，有機(jī)氮源牛肉膏、蛋白胨和酵母膏培養(yǎng)基中A-24的吸光值高于尿素培養(yǎng)基，無機(jī)氮源硝酸鉀、硝酸銨和硫酸銨培養(yǎng)基中的吸光值明顯高于亞硝酸鈉。

2.4 溫度和pH對菌株A-24降解氯氰菊酯的影響

如圖4A所示，菌株A-24在30℃時對氯氰菊酯的降解率最高，在25～42℃范圍內(nèi)，均能很好地降解氯氰菊酯，降解率均在75%以上；當(dāng)溫度在20℃時，菌株A-24對氯氰菊酯的降解率在60%以下；當(dāng)溫度在45℃時，菌株A-24對氯氰菊酯的降解率在40%以下。如圖4B所示，菌株A-24在pH為7時對氯氰菊酯的降解效果最好，且與其他處理相比差異顯著（P＜0.05）；在pH 7～8的范圍內(nèi)菌株A-24均能較好地降解氯氰菊酯；而當(dāng)pH為5或10時，與其他pH值相比其降解能力明顯下降，且差異顯著（P＜0.05），降解率低于60%。

2.5 初始氯氰菊酯濃度對菌株A-24降解的影響

如圖5所示，當(dāng)初始氯氰菊酯濃度≤50 mg·L-1時，菌株A-24對氯氰菊酯的降解都在70%以上；初始濃度控制在100 mg·L-1時，菌株A-24對氯氰菊酯的降解低于45%，且與20、50 mg·L-1處理差異顯著（P＜0.05），表明隨著氯氰菊酯初始濃度的升高菌株A-24的降解率降低；當(dāng)初始濃度為150 mg·L-1時，菌株A-24對氯氰菊酯降解率為30.85%，表明菌株A-24可耐受高濃度的氯氰菊酯。其助劑二甲基亞砜對菌株A-24的生長沒有影響。

圖3 添加不同碳源和氮源對菌株A-24生長的影響Figure 3 Effect of adding different carbon and nitrogen sources on the growth of strain A-24

2.6 接種量對菌株A-24降解氯氰菊酯的影響

對不同接種量條件下氯氰菊酯的降解效率的檢測結(jié)果如圖6所示。當(dāng)接種量為0.5%、1%和2%時，氯氰菊酯48 h降解率分別為38.7%、67.2%和91.8%；當(dāng)接種量為5%時，氯氰菊酯48 h的降解率即可達(dá)到99.45%；當(dāng)接種量為10%時，36 h氯氰菊酯全部降解。結(jié)果表明，接種量對菌株A-24降解氯氰菊酯影響較大，隨著菌株A-24接種量的增大，氯氰菊酯的降解效率逐漸增大，兩者呈正相關(guān)關(guān)系。

3 討論

圖4 溫度和pH對菌株A-24降解氯氰菊酯的影響Figure 4 Effects of temperature and pH on degradation of cypermethrin by strain A-24

圖5 初始氯氰菊酯濃度對菌株A-24降解氯氰菊酯的影響Figure 5 Effect of initial concentration on degradation of cypermethrin by strain A-24

植物內(nèi)生菌可以提高土壤中污染物的降解性能，以減輕農(nóng)藥對植物的毒害作用[12，18-20]。與動物不同，植物沒有體細(xì)胞免疫，對于環(huán)境中的微生物，植物體是一個相對開放的空間，所以幾乎所有的植物體內(nèi)都含有內(nèi)生菌[21]。污染物的降解過程是酶催化反應(yīng)的過程，針對不同的污染物，微生物會分泌不同的酶參與反應(yīng)，從而將復(fù)雜的農(nóng)藥結(jié)構(gòu)降解為簡單的結(jié)構(gòu)[17，22-26]。馮發(fā)運(yùn)[27]在植物小飛蓬體內(nèi)分離出Crono?bactersp.植物內(nèi)生菌XFP-gy，其5 d降解20 mg·L-1毒死蜱的降解率為69.59%，外加碳源的降解率可達(dá)98.0%。在韭菜體內(nèi)分離出Sphingomonassp.植物內(nèi)生菌HJY，其15 d內(nèi)可代謝95.88%初始濃度為20 mg·L-1的毒死蜱，1%的外加葡萄糖可使其對毒死蜱的降解率提高到6 d 98.48%。劉爽[28]在看麥娘中分離篩選出降解菲的植物內(nèi)生菌Pn2，經(jīng)鑒定該菌株為Naxibactersp.，此內(nèi)生菌72 h對初始濃度49.92 mg·L-1的菲降解率達(dá)98.78%。孫凱等[29]從小飛蓬和三葉草中分離篩選出能降解芘的內(nèi)生細(xì)菌BJ03和BJ05，初步鑒定為Acinetobactersp.和Kocuriasp.，15 d 對 50 mg·L-1的芘降解率分別為65.0%和53.3%。封國君[30]分離到能降解二甲四氯的植物內(nèi)生菌E41和E68，并研究了菌株的降解特性，鑒定了菌株降解二甲四氯的產(chǎn)物為4-氯-2-甲基苯酚。有關(guān)氯氰菊酯微生物降解菌已經(jīng)有很多報道[17，31-33]，但植物內(nèi)生氯氰菊酯降解菌鮮有報道。

圖6 接種量對菌株A-24降解氯氰菊酯的影響Figure 6 Effect of inoculation size on degradation of cypermethrin by strain A-24

本研究的結(jié)果表明碳源、氮源種類影響微生物的生長，雖然菌株A-24均能以葡萄糖、蔗糖、淀粉等為碳源生長，但在以果糖為碳源時，生長最快，以牛肉膏、蛋白胨、酵母膏為氮源時生長較快，說明只有添加適當(dāng)?shù)耐饧犹荚?、氮源，才能保證細(xì)胞的正常生長。有關(guān)微生物降解氯氰菊酯代謝途徑的研究已經(jīng)有報道。Wang等[17]推測了菌株JZ-1降解氯氰菊酯的途徑，其可生成二氯菊酸和3-苯氧基苯甲醛，3-苯氧基苯甲醛再轉(zhuǎn)化成3-苯氧基苯甲酸。為研究菌株A-24降解氯氰菊酯的代謝途徑，在氯氰菊酯降解過程中定時取樣，并利用HPLC檢測其代謝產(chǎn)物。與標(biāo)準(zhǔn)品對照并根據(jù)其他菌株降解氯氰菊酯的代謝途徑[17]，將產(chǎn)物鑒定為3-苯氧基苯甲酸（3-PBA）。據(jù)此推測菌株A-24降解氯氰菊酯的途徑為：氯氰菊酯首先通過酯鍵水解生成二氯菊酸和3-苯氧基苯甲醛，在脫氫酶的作用下，3-苯氧基苯甲醛生成3-PBA，然后在雙加氧酶的作用下進(jìn)一步降解（圖7）。

本研究結(jié)果表明，植物內(nèi)生菌株A-24的生長與降解對初始氯氰菊酯濃度、溫度和pH的適應(yīng)范圍較寬，適合用于田間復(fù)雜多變的自然環(huán)境中菊酯污染的修復(fù)。因此深入研究菌株A-24降解氯氰菊酯機(jī)理，以及生物修復(fù)適用性等問題將是我們下一步研究的重點(diǎn)內(nèi)容，這對植物內(nèi)生細(xì)菌-植物聯(lián)合修復(fù)有機(jī)污染具有現(xiàn)實(shí)指導(dǎo)意義。

4 結(jié)論

（1）從農(nóng)藥廠附近牛筋草中篩選到1株能夠以氯氰菊酯為唯一碳源生長的高效降解菌A-24，革蘭氏染色鑒定為陰性菌，經(jīng)16SrDNA測序鑒定為Achro?mobacter屬。

（2）在不同碳源、氮源條件下，菌株A-24的生長速率不同，以果糖為碳源時菌株A-24生長最快，麥芽糖其次，葡萄糖最慢。在有機(jī)氮源牛肉膏、蛋白胨、酵母膏培養(yǎng)基中A-24生長較快，其中無機(jī)氮源亞硝酸鈉中最慢。

（3）菌株A-24在30℃時對氯氰菊酯的降解率最高，在pH 7時對氯氰菊酯的降解效果最好。當(dāng)初始氯氰菊酯濃度≤50 mg·L-1時，菌株A-24對氯氰菊酯的降解率較高。隨著菌株A-24接種量的增大，氯氰菊酯的降解效率逐漸增大。

圖7 推測菌株A-24降解氯氰菊酯的途徑Figure 7 Proposed metabolic pathway of cypermethrin by strain A-24