胡小婕，秦 超，林志鵬，高彥征

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)土壤有機(jī)污染控制與修復(fù)研究所，南京 210095）

隨著社會經(jīng)濟(jì)快速發(fā)展，人們生活水平不斷提高，對環(huán)境安全提出了更高要求。然而，多環(huán)芳烴（PAHs）、多氯聯(lián)苯（PCBs）、農(nóng)藥等有毒有機(jī)物廣泛存在于污染環(huán)境中，其中一些有毒有機(jī)物具有“致畸、致癌、致突變”效應(yīng)，易在環(huán)境中持留，并被生物累積，嚴(yán)重威脅生態(tài)安全和人群健康[1]。圖1總結(jié)了Web of Science數(shù)據(jù)庫中有毒有機(jī)物與DNA相關(guān)研究的高頻詞匯。由圖可見，有毒有機(jī)物廣泛存在于水體、土壤、空氣中，PAHs、PCBs等出現(xiàn)頻率較高，屬環(huán)境領(lǐng)域關(guān)注的熱點污染物。近些年來，抗生素、環(huán)境激素、塑化劑等40 000余種物質(zhì)被視為環(huán)境中潛在的新型有毒有機(jī)物[2]，其環(huán)境行為及污染效應(yīng)的研究已受到重視。有毒有機(jī)物污染問題已成為國際環(huán)境領(lǐng)域研究熱點之一，備受各國政府和百姓的廣泛關(guān)注。

生命遺傳物質(zhì)脫氧核糖核酸（DNA）可與有毒有機(jī)物共存于污染環(huán)境中，通常以胞外或胞內(nèi)DNA形式存在[3]。胞外DNA多來源于原核與真核細(xì)胞的裂解釋放，較為活潑的化學(xué)活性使其在環(huán)境中易與其他物質(zhì)發(fā)生作用[4]。例如，胞外DNA可吸附于土壤礦物表面[5]，水中金屬陽離子Al（Ⅲ）、Fe（Ⅲ）可與其磷酸骨架結(jié)合進(jìn)而造成DNA團(tuán)聚[6]。胞外DNA也會與有毒有機(jī)物結(jié)合而形成加合物（圖1中“DNA adduct”），進(jìn)而影響胞外DNA的降解（圖1中“degradation”）等環(huán)境歸趨。另外，胞外DNA或質(zhì)粒可通過遷移進(jìn)入其他生命體內(nèi)，這也是生物多樣性的重要基礎(chǔ)[7-8]。有毒有機(jī)物能夠通過污染脅迫，造成微生物產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞膜組成或結(jié)構(gòu)變化，產(chǎn)生細(xì)胞毒性（圖1中“cytotoxicity”），進(jìn)而影響微生物生長和DNA或質(zhì)粒遷移。有毒有機(jī)物污染也會引起胞內(nèi)DNA損傷，影響其基因表達(dá)，進(jìn)而產(chǎn)生基因毒性（圖1中“genotoxic?ity”）。有關(guān)有毒有機(jī)物與DNA互作及效應(yīng)已成為環(huán)境領(lǐng)域研究的熱點和前沿之一。

自20世紀(jì)40年代以來，隨著抗生素在醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的過度使用，環(huán)境中抗生素抗性基因（Antibi?otic resistance genes，ARGs）豐度顯著增加[9]，多重耐藥菌（超級細(xì)菌）被陸續(xù)報道，對人類健康造成嚴(yán)重威脅[10]。2006年，Pruden等[11]首次將ARGs看作為一種新型環(huán)境污染物。DNA上的ARGs不僅可以通過直系傳代由母體細(xì)胞轉(zhuǎn)移至子代細(xì)胞，而且基因橫向遷移（Lateral gene transfer，LGT）可使ARGs在相同或不同物種生物體之間傳播，這大幅增加了ARGs的生態(tài)和人群健康風(fēng)險。環(huán)境中有毒有機(jī)物與ARGs復(fù)合污染問題應(yīng)受到重視和關(guān)注；近些年來，該領(lǐng)域研究已取得一些重要進(jìn)展?；诖?，本文主要綜述了有毒有機(jī)物與DNA結(jié)合作用及其對DNA酶解和ARGs橫向遷移的影響，試圖為人們系統(tǒng)、全面地認(rèn)識環(huán)境中有毒有機(jī)物和ARGs互作及風(fēng)險提供參考。

圖1 有毒有機(jī)物與DNA研究熱點圖（于2019年12月7日統(tǒng)計自Web of Science數(shù)據(jù)庫）Figure 1 Hotspots of toxic organic substance and DNA research（Statistics collected fromthe Web of Science database on December 7th，2019）

1 有毒有機(jī)物與DNA結(jié)合作用

有毒有機(jī)物易與DNA發(fā)生相互作用，改變其基因調(diào)控和表達(dá)功能。PAHs及其衍生物[12]、農(nóng)藥[13]、抗生素[14]、生物激素[15]、消毒副產(chǎn)物[16]、塑化劑[17]等一些有毒有機(jī)物易進(jìn)入機(jī)體細(xì)胞，并與胞內(nèi)DNA結(jié)合，進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞功能障礙。由于DNA具有堿基、磷酸骨架和脫氧核糖等獨特結(jié)構(gòu)，其堿基的平行堆積、磷酸骨架的負(fù)電性以及雙螺旋結(jié)構(gòu)所形成的大溝、小溝均為有毒有機(jī)物提供了潛在的結(jié)合位點。闡明有毒有機(jī)物與DNA間結(jié)合作用，有助于揭示有毒有機(jī)物致毒效應(yīng)的分子生物學(xué)機(jī)制。

有毒有機(jī)物與DNA結(jié)合作用的研究最早可追溯至19世紀(jì)80年代[18]，其研究方法較多。電化學(xué)方法具有靈敏度高、可控性強(qiáng)、選擇性好等優(yōu)點，早期關(guān)于有毒有機(jī)物與DNA結(jié)合的研究多采用該方法。例如，Pandey等[19]通過電化學(xué)方法研究了水溶液中蒽醌類化合物與小牛胸腺DNA之間的結(jié)合作用，發(fā)現(xiàn)結(jié)合方式為插入結(jié)合。Wang等[20]采用電位溶出分析法揭示了有毒肼類化合物與DNA之間的結(jié)合作用，發(fā)現(xiàn)該類有機(jī)物可導(dǎo)致DNA堿基G發(fā)生N-7位和O-6位的甲基化。隨著現(xiàn)代分析技術(shù)的發(fā)展，有毒有機(jī)物與DNA結(jié)合作用的研究方法更加多樣。紫外可見吸收光譜法可以通過觀察有毒有機(jī)物與DNA作用前后于波長260 nm處的吸光度變化來判斷二者之間結(jié)合對DNA結(jié)構(gòu)的影響，吸光度增強(qiáng)（增色效應(yīng)）表示DNA雙鏈水解、堿基暴露增加，吸光度減弱（減色效應(yīng)）表示DNA分子的右手螺旋性和堿基堆積增加、分子結(jié)構(gòu)緊湊。DNA熱變性及黏度法可通過測定有毒有機(jī)物與DNA結(jié)合后熱變性溫度Tm值和黏度值的增高來判斷二者之間結(jié)合為插入結(jié)合。熒光光譜法可通過量化有毒有機(jī)物與DNA結(jié)合后所導(dǎo)致的熒光猝滅強(qiáng)度，來判斷有毒有機(jī)物與DNA之間的作用方式。共振光散射法也是研究有毒有機(jī)物與DNA結(jié)合的常用方法，該方法靈敏度高，常用于低濃度DNA溶液與有毒有機(jī)物相互作用的研究。除此之外，圓二色譜法、拉曼光譜法、傅立葉紅外光譜法、電泳法、質(zhì)譜法等眾多方法，均被用于研究有毒有機(jī)物與DNA的結(jié)合過程。

從已有的報道來看，有毒有機(jī)物與DNA的結(jié)合方式主要有共價結(jié)合、非共價結(jié)合、剪切作用等[21]。表1分別從有毒有機(jī)物類別、DNA種類、結(jié)合方式、結(jié)合位點、作用力、結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點數(shù)等方面呈現(xiàn)了28種12類有毒有機(jī)物與DNA之間的結(jié)合作用。由表1可知，有毒有機(jī)物與DNA的結(jié)合方式多以非共價結(jié)合為主，共價結(jié)合方式相對較少。有毒有機(jī)物與DNA結(jié)合的作用力主要有范德華力、π-π相互作用力、疏水作用力、氫鍵、鹵鍵等，二者之間表觀結(jié)合常數(shù)為2.07×103～6.80×1018L·mol-1，結(jié)合位點數(shù)為0.30～9.00。有毒有機(jī)物與DNA之間結(jié)合方式顯著影響其結(jié)合位點以及結(jié)合強(qiáng)度。

1.1 共價結(jié)合

細(xì)胞內(nèi)有毒有機(jī)物可與DNA分子的磷酸骨架、堿基或脫氧核糖以共價鍵結(jié)合生成穩(wěn)定的配合物，使DNA雙鏈發(fā)生解旋進(jìn)而產(chǎn)生彎曲形變，包括DNA的烷基化反應(yīng)、鏈內(nèi)交聯(lián)、鏈間交聯(lián)反應(yīng)等。以PAHs為例，其在人體內(nèi)的代謝產(chǎn)物二氫二醇環(huán)氧化物可與DNA的鳥嘌呤外環(huán)胺基端以共價鍵形式結(jié)合形成加合物（圖2），導(dǎo)致DNA損傷，進(jìn)而誘導(dǎo)基因突變和細(xì)胞癌變，最終在人體內(nèi)誘發(fā)腫瘤，對人體健康造成威脅[39-40]。一種具有抗腫瘤活性的抗生素倍癌霉素（Duocarmycin），可與DNA小溝內(nèi)特定腺嘌呤中的N3發(fā)生共價結(jié)合，使該位點脫去嘌呤[41]。Stiborov等[42]研究指出，工業(yè)污染物2-硝基苯甲醚（2-NA）被人肝細(xì)胞溶質(zhì)和黃嘌呤氧化酶還原激活后，在體外可與DNA共價結(jié)合，形成衍生自2-NA還原代謝產(chǎn)物N-（2-甲氧基苯基）羥胺的脫氧鳥苷加合物，進(jìn)而產(chǎn)生致癌作用。

1.2 非共價結(jié)合

細(xì)胞外有毒有機(jī)物主要以非共價結(jié)合形式與DNA發(fā)生作用[43]。非共價結(jié)合主要由范德華力、疏水作用力、氫鍵、靜電力等弱相互作用力驅(qū)動，這些弱相互作用力在分子水平的生命過程中對轉(zhuǎn)錄、復(fù)制等基因調(diào)控具有重要調(diào)節(jié)作用，也對其他生物大分子（如RNA、蛋白等）功能的調(diào)控發(fā)揮關(guān)鍵作用。有毒有機(jī)物與DNA非共價結(jié)合作用可分為三種模式，包括插入結(jié)合、溝槽結(jié)合和靜電作用[44]（圖3）。通常這三種相互作用力不是單獨存在，而是多種共存并協(xié)同作用。例如，抗生素泰樂菌素可通過靜電作用被DNA吸引，然后其分子結(jié)構(gòu)中的吡喃和大環(huán)內(nèi)酯則會插入DNA堿基對平面進(jìn)而吸附在DNA分子上[45]。

1.2.1 插入結(jié)合

一方面，有毒有機(jī)物的平面結(jié)構(gòu)嵌插到DNA堿基中，即發(fā)生了插入結(jié)合，這是具有平面芳環(huán)結(jié)構(gòu)的有毒有機(jī)物與DNA結(jié)合的主要形式，也是非共價結(jié)合中最強(qiáng)的一種，這種結(jié)合方式通常發(fā)生于GC堿基富集區(qū)[46]。此類插入結(jié)合主要是由有毒有機(jī)物特定芳環(huán)結(jié)構(gòu)與DNA堿基之間的π-π相互作用、偶極-偶極相互作用以及二者之間的疏水作用等作用的結(jié)果。另一方面，對于另一些含有龐大取代基的有機(jī)分子（如吡啶環(huán)取代的卟啉分子），其在與DNA結(jié)合過程中，自身取代基會發(fā)生旋轉(zhuǎn)，與母環(huán)形成共平面，進(jìn)而插入DNA堿基。當(dāng)有毒有機(jī)物以插入結(jié)合的方式與DNA作用后，可導(dǎo)致DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄功能被抑制，或進(jìn)一步活化后直接使DNA發(fā)生斷裂受損，從而影響DNA的正常功能。魯嘉等[30]研究表明，有機(jī)氯農(nóng)藥DDT可與DNA結(jié)合，導(dǎo)致DNA在260 nm處的紫外吸收光譜發(fā)生減色效應(yīng)，且伴隨著明顯的光譜紅移現(xiàn)象，表明DDT與DNA之間發(fā)生了較強(qiáng)的結(jié)合作用，形成了二元復(fù)合物，DDT與DNA結(jié)合常數(shù)為1.56×105L·mol-1，結(jié)合位點數(shù)為1.07。

表1 有毒有機(jī)物與DNA的結(jié)合Table 1 Binding of toxic organic substances with DNA

圖2 體內(nèi)PAHs代謝物與DNA形成加合物Figure 2 Adducts formation between PAH metabolites and DNA in human body

圖3 有毒有機(jī)物與DNA非共價結(jié)合示意圖Figure 3 Non-covalent binding of toxic organic substances with DNA

1.2.2 溝槽結(jié)合

當(dāng)有毒有機(jī)物分子與DNA小溝或大溝的堿基對邊緣進(jìn)行直接作用而插入到DNA雙鏈中時會發(fā)生溝槽結(jié)合作用。溝槽結(jié)合通常發(fā)生在AT堿基富集區(qū)[34]。當(dāng)有毒有機(jī)物分子較小時，其可通過與胸腺嘧啶C-2上的羰基氧或腺嘌呤N-3上的氮形成氫鍵而與DNA小溝結(jié)合。此類有毒有機(jī)物通常為具有呋喃、吡咯、苯環(huán)等結(jié)構(gòu)的簡單芳環(huán)小分子有機(jī)物。李松等[38]研究表明，鄰苯二甲酸二丁酯與小牛胸腺DNA以疏水作用和氫鍵為驅(qū)動力發(fā)生了溝槽結(jié)合，結(jié)合區(qū)域為AT堿基富集區(qū)，導(dǎo)致DNA結(jié)構(gòu)變得松散且未造成DNA損傷。Zhang等[25]采用紫外光譜和電泳方法，發(fā)現(xiàn)抗腫瘤抗生素Shishijimicin A與雙鏈DNA的小溝結(jié)合，其β-咔啉部分可通過嵌入在結(jié)合中發(fā)揮作用，證實Shishijimicin A的烯二炔核心在被硫醇激活后通過Bergman環(huán)芳香化形成的1，4-苯甲雙自由基引起DNA鏈斷裂，進(jìn)而產(chǎn)生強(qiáng)烈的細(xì)胞毒性。

1.2.3 靜電作用

靜電作用是指帶有電性的有毒有機(jī)物與DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)外側(cè)帶負(fù)電的核糖-磷酸骨架直接發(fā)生靜電作用。這種結(jié)合方式通常不具選擇性，且常與其他作用方式共同起作用（表1）。Liu等[47]采用紫外可見光譜和以中性紅作為熒光探針的熒光光譜證實，馬錢子堿與DNA相互作用不僅是插入結(jié)合，也存在靜電相互作用。靜電作用的產(chǎn)生可用于改善有毒有機(jī)物與DNA之間的結(jié)合強(qiáng)度。如在抗生素CC-1065結(jié)構(gòu)中引入一個具有正電性的C-5季銨，可通過增加穩(wěn)定的靜電作用而顯著增加其與DNA間的親和性[48]。

1.3 剪切作用

部分有毒有機(jī)物可通過與DNA鏈上某些特異性位點結(jié)合的剪切作用導(dǎo)致DNA鏈斷裂，從而造成DNA損傷，使DNA上特定基因發(fā)生突變。雖然有報道證實，剪切作用是小分子有機(jī)物與DNA結(jié)合的作用形式，但此作用形式仍然缺乏系統(tǒng)、深入的研究，相關(guān)報道仍然有限。

2 有毒有機(jī)物影響DNA酶解

環(huán)境中DNA豐度及其生物學(xué)意義受其降解作用影響。溶液pH、溫度、紫外線B輻射強(qiáng)度、陽離子類型及濃度等環(huán)境因素影響著DNA降解過程。據(jù)報道，較高溫度、中性pH、中等偏高的紫外線B輻射有利于環(huán)境中DNA降解[49]。在DNA眾多降解方式中，酶促反應(yīng)被認(rèn)為是環(huán)境中DNA主要的降解途徑[50-51]。DNA的酶解受DNA降解酶的種類、活性和反應(yīng)模式影響[52]。而污染環(huán)境中大量共存的有毒有機(jī)物如何影響DNA酶解過程，國內(nèi)外相關(guān)研究仍很少。闡明這一重要科學(xué)問題，對于人們理解有毒有機(jī)物污染的分子生態(tài)效應(yīng)及機(jī)制有重要意義，未來該領(lǐng)域研究應(yīng)得到重視和關(guān)注。

一方面，有毒有機(jī)物可以通過改變DNA降解酶的活性進(jìn)而影響DNA酶解過程。據(jù)報道，苯酚、溴苯、氯苯等有毒有機(jī)物可顯著提高DNA降解酶DNaseⅠ的活性，從而促進(jìn)海洋環(huán)境中DNA的降解[53]。另一方面，有毒有機(jī)物還可通過占據(jù)DNA上降解酶的酶切位點進(jìn)而影響DNA酶解過程。Kang等[54]發(fā)現(xiàn)，痕量（10-9量級）的PAHs（菲、芘）暴露不會導(dǎo)致DNaseⅠ失活，因此排除了PAHs誘導(dǎo)酶活性變化對DNA酶解的影響，但溶液中菲、芘顯著降低了DNA酶解速率，增加了酶解后DNA的殘留量，抑制了DNA的酶解過程。該研究證實PAHs與DNA堿基鳥嘌呤、咪唑環(huán)和呋喃核部分結(jié)合，而DNA降解酶DNaseⅠ同樣作用于鳥嘌呤、DNA骨架中的C-C鍵和-PO2基團(tuán)。由此可知，PAHs和DNaseⅠ之間在DNA分子上的活性位點重疊，這是導(dǎo)致PAHs抑制DNA酶解的主要原因。

此外，有毒有機(jī)物還可以通過結(jié)合DNA造成DNA構(gòu)型改變，進(jìn)而影響DNA的酶解。Woegerbauer等[55]報道，濃度為2.00 mmol·L-1的新霉素B（一種氨基糖苷類抗生素）可完全抑制DNaseⅠ對質(zhì)粒DNA的降解，這是由于新霉素與DNA結(jié)合，造成DNA構(gòu)型由B型向A型轉(zhuǎn)變。表明有毒有機(jī)物與DNA結(jié)合造成DNA構(gòu)型的改變也可以影響DNA酶解。

部分有毒有機(jī)物還可通過改變DNA分子結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響DNA酶解。Yang等[33]采用凝膠電泳和紫外吸收光譜方法，發(fā)現(xiàn)農(nóng)藥毒死蜱（0～2.00 mg·L-1）和甲基毒死蜱（0～4.00 mg·L-1）可促進(jìn)DNA酶解。光譜分析結(jié)合分子動力學(xué)計算、量子化學(xué)計算等結(jié)果表明，毒死蜱和甲基毒死蜱可通過與DNA結(jié)合，導(dǎo)致DNA堿基的非共價堆積、DNA凹槽擴(kuò)大和水合層破壞，進(jìn)而促進(jìn)DNA的酶解過程。近來，Qin等[31]采用熒光滴定試驗剖析了三種六六六異構(gòu)體（α-HCH、β-HCH、γ-HCH）在0～4.00 mg·L-1的濃度范圍內(nèi)對DNA酶解的影響，發(fā)現(xiàn)HCHs可通過范德華力、鹵鍵等弱相互作用力與DNA結(jié)合，造成DNA螺旋性和堿基堆積增加，使DNA分子結(jié)構(gòu)更緊湊，進(jìn)而促進(jìn)DNA酶解，其分子機(jī)制如圖4所示；六六六對DNaseⅠ酶活性的影響與對DNA酶解的促進(jìn)作用無關(guān)。

環(huán)境條件會影響有毒有機(jī)物作用下DNA的酶解過程，但相關(guān)資料仍很少。有報道證實，DNA在土壤礦物表面的吸附可導(dǎo)致其不易被DNaseⅠ降解[56]。一些有毒有機(jī)物可通過影響土壤pH值等微環(huán)境進(jìn)而影響DNA在礦物表面的吸附和酶解[57]。

3 有毒有機(jī)物影響抗生素抗性基因橫向遷移

3.1 基因橫向遷移的方式

環(huán)境中基因橫向遷移（LGT）主要有三種方式：接合、轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)導(dǎo)（圖5）。接合主要指微生物之間彼此連接，通過接連處形成的洞口進(jìn)行基因交換，是基因橫向遷移的重要方式。接合遷移的基因物質(zhì)通常負(fù)載于可動遺傳因子（Mobile genetic element，MGE）如質(zhì)粒、整合子、轉(zhuǎn)座子等上，以確保其可全部遷移進(jìn)入受體細(xì)胞，并成功重組進(jìn)受體細(xì)胞基因組[58]。轉(zhuǎn)導(dǎo)通常指基因通過噬菌體在微生物間傳遞，噬菌體會在供體細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制，隨機(jī)捕獲或就近攜帶附著點周圍的基因片段。轉(zhuǎn)化則指細(xì)胞在自然生長情況下形成感受態(tài)，攝取胞外游離態(tài)DNA，整合進(jìn)基因組并表達(dá)的過程。感受態(tài)的形成通常與生長環(huán)境突變、饑餓脅迫等有關(guān)[59-61]。另外，環(huán)境中廣泛存在的鈣離子也會引發(fā)細(xì)菌形成感受態(tài)[62-63]。

圖4 六六六與DNA結(jié)合促進(jìn)DNA酶解Figure 4 HCHs binding with DNA expedited the enzymatic degradation of DNA

圖5 基因橫向遷移的三種方式Figure 5 Three modes of lateral/horizontal gene transfer

3.2 有毒有機(jī)物影響抗生素抗性基因橫向遷移的機(jī)制

通常以接合及轉(zhuǎn)導(dǎo)方式遷移的基因多負(fù)載于胞內(nèi)DNA上，以轉(zhuǎn)化方式遷移的基因則多負(fù)載于胞外DNA上。外界環(huán)境因素對接合及轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響多取決于其對供體或受體細(xì)胞的相關(guān)作用，而對轉(zhuǎn)化方式遷移的影響則主要取決于這些因素對受體細(xì)胞或胞外游離態(tài)DNA的作用。本文總結(jié)了有毒有機(jī)物影響ARGs橫向遷移的六種機(jī)制，見表2。當(dāng)前相關(guān)研究多集中于有毒有機(jī)物對供體或受體細(xì)胞的影響，如調(diào)控可動遺傳因子，引起細(xì)胞SOS反應(yīng)、脅迫細(xì)胞形成自然感受態(tài)、形成生物膜和改變細(xì)胞膜通透性等；而有關(guān)有毒有機(jī)物與胞外DNA相互作用對基因橫向遷移的影響還少有報道。

3.2.1 調(diào)控可動遺傳因子（MGEs）

有毒有機(jī)物脅迫時微生物會相應(yīng)地產(chǎn)生防御機(jī)制，在此篩選作用下胞內(nèi)有毒有機(jī)物抗性/降解基因豐度顯著增加。某些有毒有機(jī)物抗性/降解基因與ARGs會同時存在于同一可動遺傳因子上，在有毒有機(jī)物調(diào)控下這些可動遺傳因子豐度大量增加，隨之導(dǎo)致ARGs在細(xì)胞間的橫向遷移（接合）更為頻繁。據(jù)報道，PAHs、農(nóng)藥等多可通過此機(jī)制影響ARGs的橫向遷移[64-68]。Wang等[64]采集了大連沿海海水并將其暴露于PAHs，發(fā)現(xiàn)PAHs污染的海水中sulI及aadA2豐度顯著高于對照，同時PAHs也顯著提高了可動遺傳因子classⅠ整合子豐度，并與ARGs豐度呈現(xiàn)良好線性關(guān)系（R2=0.988），這表明ARGs豐度的提高源于classⅠ整合子介導(dǎo)的橫向遷移。Wang等[64]進(jìn)一步開展了Aerococcussp.和Pseudoalteromonassp.兩種菌之間的classⅠ整合子接合試驗，發(fā)現(xiàn)PAHs（萘、菲）顯著提高了ARGs在兩株菌間的遷移效率。

3.2.2 引起細(xì)胞SOS反應(yīng)

當(dāng)有毒有機(jī)物造成胞內(nèi)DNA損傷時，微生物會相應(yīng)啟動SOS應(yīng)激反應(yīng)修復(fù)系統(tǒng)，該系統(tǒng)可誘導(dǎo)基因的橫向遷移[69-70]。一些抗生素可通過此方式影響ARGs的橫向遷移。例如，人類及動物醫(yī)療中廣泛使用的氟喹諾酮類抗生素會抑制DNA旋轉(zhuǎn)酶及拓?fù)洚悩?gòu)酶活性，進(jìn)而損傷胞內(nèi)DNA，細(xì)胞相應(yīng)開啟SOS反應(yīng)系統(tǒng)，試圖進(jìn)行DNA修復(fù)，同時誘發(fā)了胞內(nèi)原噬菌體（Prophage）的形成，進(jìn)而促進(jìn)卡納青霉素抗性質(zhì)粒在細(xì)胞間通過轉(zhuǎn)導(dǎo)方式橫向遷移[71]；細(xì)胞內(nèi)，SXT（整合型接合元件，負(fù)載多種ARGs）接合遷移相關(guān)轉(zhuǎn)錄激活因子（setC及setD）的表達(dá)被阻遏蛋白（SetR）抑制，而廣譜抗腫瘤抗生素絲裂霉素C則可通過引發(fā)SOS反應(yīng)大幅降低此阻遏蛋白的表達(dá)量，使轉(zhuǎn)錄激活因子得以充分表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)橫向遷移效率[72]。

3.2.3 脅迫細(xì)胞形成自然感受態(tài)

面對DNA損傷脅迫，某些缺乏SOS反應(yīng)系統(tǒng)的微生物則會通過形成感受態(tài)來增強(qiáng)其獲取外部基因（如ARGs）的能力，抵御外界壓力，進(jìn)而促進(jìn)ARGs的橫向遷移。2006年，Prudhomme等[74]發(fā)現(xiàn)絲裂霉素C會誘發(fā)肺炎鏈球菌形成感受態(tài)，從而促進(jìn)了鏈霉素抗性基因轉(zhuǎn)化遷移，其主要原因在于絲裂霉素C激活了胞內(nèi)晚期感受態(tài)基因ssbB及recA，這兩種基因具有調(diào)控細(xì)胞攝取并重組外源DNA的能力。

3.2.4 形成生物膜

生物膜中微生物密度大，新陳代謝活躍，彼此之間極為貼近，因此其被視為基因橫向遷移的熱點區(qū)域[80]。生物膜不僅可以加強(qiáng)質(zhì)粒的穩(wěn)定性，擴(kuò)展可動遺傳因子宿主范圍[81]，也可通過群體感應(yīng)（Quorum sensing）機(jī)制促進(jìn)基因的橫向遷移[82]。生物膜多形成于水-固相界面[83]，需要一定的物質(zhì)載體，大分子（大顆粒）有毒有機(jī)物便可作為其中一種。例如Arias-Andres等[75]發(fā)現(xiàn)，水中微塑料表面會形成一定量的生物膜，這些生物膜中抗生素抗性質(zhì)粒pKJK5在細(xì)菌間的接合遷移效率顯著高于周圍環(huán)境中的游離細(xì)菌。環(huán)境中低于細(xì)菌最小抑菌濃度的抗生素通常會促進(jìn)生物膜生成。Salcedo等[76]發(fā)現(xiàn)，100～1000 μg·L-1濃度四環(huán)素或頭孢拉啶會顯著促進(jìn)生物膜生長，生物膜的形成也相應(yīng)促進(jìn)了其中pB10質(zhì)粒的橫向遷移。

表2 有毒有機(jī)物影響抗生素抗性基因橫向遷移的機(jī)制Table 2 The mechanisms of toxic organic substance-influenced lateral/horizontal transfer of ARGs

3.2.5 改變細(xì)胞膜通透性

細(xì)胞膜是基因橫向遷移需要突破的重要障礙之一[58]，其通透性通常影響著橫向遷移的成功率。例如，金屬氧化鋁納米顆粒可以造成大腸桿菌（Esche?richia coli）細(xì)胞膜形成納米孔洞，進(jìn)而使質(zhì)粒pBR322更易進(jìn)入胞內(nèi)表達(dá)其抗性[84]。近年來，有研究借助碘化丙啶（PI）染色-流式細(xì)胞術(shù)，發(fā)現(xiàn)離子液體（C8H16N2PF6）會造成細(xì)胞膜組成改變，從而使膜通透性顯著增加，進(jìn)而提高了classⅠ整合子在Alcaligenessp.和Acinetobactersp.之間的橫向遷移效率[77]。離子液體分子碳鏈長度是其影響細(xì)胞膜通透性的重要因素，數(shù)據(jù)擬合結(jié)果表明細(xì)胞膜通透性與接合頻率之間呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系（R2=0.682）[78]。

3.2.6 與胞外質(zhì)粒形成加合物

胞外DNA（如質(zhì)粒）與其他物質(zhì)結(jié)合不僅影響DNA酶解，也會影響基因橫向遷移進(jìn)入微生物體內(nèi)。例如質(zhì)粒吸附于土壤礦物、膠體會顯著改變其轉(zhuǎn)化效率[85-88]；我們前期研究發(fā)現(xiàn)，金屬氧化物納米顆粒會與質(zhì)粒結(jié)合發(fā)生團(tuán)聚，進(jìn)而阻礙其進(jìn)入細(xì)胞體內(nèi)，抑制氨芐青霉素抗性基因（負(fù)載于pUC19質(zhì)粒上）的轉(zhuǎn)化遷移[89]。然而，迄今關(guān)于有毒有機(jī)物與胞外質(zhì)粒相互作用影響ARGs橫向遷移的研究仍然很少。一些環(huán)境中胞外DNA占DNA總量的比例較高[3]，其上負(fù)載的ARGs豐度也顯著高于胞內(nèi)DNA[3]，因此有毒有機(jī)物對于胞外DNA上ARGs橫向遷移的影響應(yīng)得到更多關(guān)注。近年來，我們發(fā)現(xiàn)PAHs與pUC19質(zhì)粒結(jié)合影響了其轉(zhuǎn)化遷移進(jìn)入大腸桿菌[37]。借助原子力顯微鏡我們觀察到pUC19質(zhì)粒與菲、芘形成了絨團(tuán)狀團(tuán)聚物，利用紅外光譜進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)其作用位點主要位于質(zhì)粒堿基，兩者之間通過非共價作用相結(jié)合（圖6），該結(jié)合作用顯著抑制了氨芐青霉素抗性基因的轉(zhuǎn)錄過程，進(jìn)而降低了其橫向遷移效率；PAHs分子越小越易插入DNA雙鏈與質(zhì)粒堿基發(fā)生作用，進(jìn)而更顯著地抑制ARGs橫向遷移。Mizusawa等[79]也發(fā)現(xiàn)，質(zhì)粒與BP-DEI（一種苯并[a]芘與功能氧化酶混合產(chǎn)物）結(jié)合后其構(gòu)型會發(fā)生改變，并且復(fù)制功能等也被抑制，最終導(dǎo)致其轉(zhuǎn)化效率明顯降低。

4 展望

DNA的環(huán)境行為與歸趨是生物多樣性的重要基礎(chǔ)，也直接影響著抗生素抗性基因豐度和分布。環(huán)境中與DNA共存的有毒有機(jī)物種類眾多，這些共存污染物如何影響DNA酶解和遷移是環(huán)境領(lǐng)域值得關(guān)注和重視的一個關(guān)鍵科學(xué)問題。然而，當(dāng)前相關(guān)研究仍多集中于DNA與有毒有機(jī)物的結(jié)合作用，從結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點，到相互作用力，從現(xiàn)象到機(jī)制，國內(nèi)外已取得了較系統(tǒng)的研究進(jìn)展。相較而言，有毒有機(jī)物影響下環(huán)境中DNA兩大歸趨——酶解和遷移方面的研究仍顯單薄，亟待深化。

在有毒有機(jī)物影響DNA酶解方面，目前相關(guān)研究僅涉及PAHs、新霉素B、毒死蜱、六六六等很少種類的有毒有機(jī)物，供試DNA和酶也多為鮭魚精DNA和DNaseⅠ，相關(guān)現(xiàn)象和數(shù)據(jù)仍顯匱乏，遠(yuǎn)未形成系統(tǒng)性的理論認(rèn)知。目前，已報道的有毒有機(jī)物有上千種，動物、植物、微生物的DNA種類繁多，諸多酶可參與DNA降解過程；顯然，基于實際污染環(huán)境的更多更具代表性的有毒有機(jī)物、DNA和酶仍待未來予以研究和試驗，以形成更具普適性的有毒有機(jī)物影響DNA酶解的理論體系。另外，有毒有機(jī)物-DNA-酶之間的交互作用仍是破解其內(nèi)在機(jī)制的關(guān)鍵所在，而有毒有機(jī)物和DNA的結(jié)構(gòu)效應(yīng)、環(huán)境因子影響效應(yīng)也是該領(lǐng)域未來需要著力補充的重要內(nèi)容。

圖6 PAHs與pUC19質(zhì)粒結(jié)合抑制ARGs橫向遷移[23]Figure 6 Binding of PAHs with pUC19 plasmid inhibited the lateral transfer of ARGs[23]

作為新型污染物，ARGs及其遷移風(fēng)險是近些年來環(huán)境領(lǐng)域關(guān)注的熱點之一。在有毒有機(jī)物影響ARGs橫向遷移方面，以往相關(guān)研究多集中于探討有毒有機(jī)物對于供體或受體（宿主）細(xì)胞的影響以及與ARGs遷移的關(guān)系。實際污染環(huán)境中通常存在大量游離胞外DNA，共存有毒有機(jī)物如何作用于胞外DNA，進(jìn)而影響其構(gòu)型和ARGs橫向遷移，該領(lǐng)域研究仍顯薄弱。另外，從已有的報道來看，其多是通過分子生態(tài)學(xué)或抗性篩選手段來觀察ARGs豐度或抗性受體多寡，進(jìn)而分析有毒有機(jī)物影響ARGs遷移的表觀效應(yīng)；實質(zhì)上，ARGs進(jìn)入細(xì)胞后的復(fù)制和表達(dá)過程也直接決定著抗性受體的多少。而有毒有機(jī)物進(jìn)入細(xì)胞后如何作用于ARGs的復(fù)制和表達(dá)，這可能是揭開有毒有機(jī)物影響ARGs橫向遷移機(jī)制的一個關(guān)鍵所在，該領(lǐng)域研究仍待深化。