顏 晰，樊建平，王 莧，馮劍飛，趙連梅，單保恩*

(1.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北 石家莊 050011；2.河北省井陘縣醫(yī)院消化內(nèi)鏡科，河北 井陘 050300；3.河北省石家莊市疾病預(yù)防控制中心微生物檢驗(yàn)所，河北 石家莊 050011；4.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院科研中心，河北 石家莊 050011)

幽門螺桿菌由Marshall和Warren于1983年首次鑒定出來[1]，是慢性胃炎、消化系統(tǒng)腫瘤發(fā)生的高危因素[2]。近年來，治療性抗體免疫制劑的應(yīng)用已成為根除幽門螺桿菌感染的有效工具[3-4]。準(zhǔn)確檢測特異性抗體的含量，對評估免疫制劑質(zhì)量及免疫治療效果具有重要意義。雙向免疫擴(kuò)散法是對抗原或抗體進(jìn)行定性鑒定、效價(jià)測定以及純度、特異性分析的傳統(tǒng)方法，這種方法耗時(shí)較長，操作復(fù)雜，難以實(shí)現(xiàn)高通量自動(dòng)化。酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA) 是基于抗原抗體固相化的酶標(biāo)記技術(shù)，具有快速、靈敏、簡便、易于標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn)，目前已廣泛用于臨床。本研究通過雙相免疫擴(kuò)散法與ELISA檢測體系檢測抗體羊奶中抗Hp特異性抗體含量，并比較二者檢測效果，旨在為免疫制劑抗體的檢測提供一種簡便、準(zhǔn)確、可靠的檢測方法。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，抗Hp特異性抗體牛奶能夠有效清除胃內(nèi)幽門螺桿菌，具有成本低、產(chǎn)量大、對胃腸道無刺激性及不會產(chǎn)生耐藥等優(yōu)點(diǎn)[5]，但考慮到部分人群對牛奶耐受性差，易引起過敏[6]，本研究選用α-S1酪蛋白、β-乳球蛋白含量較低的抗體羊奶作為研究對象，初步觀察其臨床治療效果，以期為后期臨床試驗(yàn)提供有效數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料與試劑 幽門螺桿菌菌株選用國際標(biāo)準(zhǔn)菌株H. pylori ATCC26695及SS1，均由石家莊市疾病預(yù)防控制中心提供。幽門螺桿菌培養(yǎng)基為哥倫比血亞瓊脂培養(yǎng)基(購自北京索萊寶科技有限公司)。弗氏佐劑：取羊毛脂1.5 g，液體石蠟8.5 mL，腸結(jié)核菌素0.35 mL(75 mg/mL)，置研缽內(nèi)充分研磨均勻，高壓滅菌即可。蛋白提取試劑盒、牛血清白蛋白購自美國西格瑪-奧爾德里奇公司；BCA蛋白定量試劑盒購自美國賽默飛世爾科技公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1菌株的保存與培養(yǎng) 菌株保存于凍存液置-80 ℃冰箱，將凍存的幽門螺桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC26695及SS1分別于37 ℃水浴箱解凍，混勻后各吸取100 μL菌液接種于哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基上，置于37 ℃、10%CO2、85%N2、5%O2、95%濕度條件下培養(yǎng)48～72 h，復(fù)蘇成功后傳代增菌備用。

1.2.2含Hp特異性抗體羊奶的免疫制備 用幽門螺桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株制備ATCC26695菌懸液及ATCC26695、SS1混合菌懸液，濃度為3×109CFU/mL，加入等體積的弗氏佐劑經(jīng)過超聲波粉粹，分別在待免疫奶羊兩前肢腋窩和兩后腿內(nèi)側(cè)鼠蹊部淋巴結(jié)處進(jìn)行注射免疫，每個(gè)部位注射0.5 mL，每15 d注射1次，連續(xù)注射6次，免疫35 d后收集羊奶，經(jīng)脫脂及巴氏消毒滅菌后儲存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3雙相免疫擴(kuò)散法檢測抗體 制備瓊脂凝膠板，用打孔器按孔徑3 mm，孔距15 mm 打孔，中心1個(gè)孔，四周6個(gè)孔。取新鮮抗體羊奶經(jīng)8 h 55 ℃水浴滅菌，將離心過濾去除油脂后的羊奶用生理鹽水制成1∶1稀釋待檢液。將ATCC26695及ATCC26695、SS1混合菌液免疫所得抗體羊奶待檢液分別加入凝膠板的中央孔，周圍1～6孔加入相應(yīng)的菌液；另取兩瓊脂板中央孔分別加入ATCC26695及ATCC26695、SS1混合菌液免疫所得抗體羊奶待檢液，周圍1～6孔均加入生理鹽水作為陰性對照。加樣后將瓊脂板放入濕盒內(nèi)置 37 ℃溫箱中，48 h后取出觀察結(jié)果。

1.2.4ELISA檢測體系的初步建立 制備包被板：收集培養(yǎng)的幽門螺桿菌于離心管，4 ℃、5 000 g離心力離心10 min，PBS洗滌3次，使用蛋白提取試劑盒提取蛋白，用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，用PBS調(diào)整濃度為1 mg/mL備用。微孔板用2.5%戊二醛預(yù)處理后，每孔加入100 μL上述蛋白液，4 ℃包被 16 h， 150 μL 2.5%牛血清白蛋白封閉液 37 ℃封閉 2 h。樣本檢測：使用PBS將抗體羊奶稀釋為1∶200、1∶400、1∶800的待檢液，每孔100 μL加入上述微孔板，37 ℃孵育1 h，洗滌；使用含0.1% BSA的PBS稀釋HRP標(biāo)記二抗(1∶8 000)，每孔100 μL加入微孔板，室溫孵育30 min后，洗滌；顯色后，于450 nm波長測定各孔吸光度值。同時(shí)設(shè)空白對照孔和普通牛奶對照孔，每一樣本均設(shè)復(fù)孔。

1.2.5臨床試驗(yàn) 收集河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院消化科經(jīng)三聯(lián)療法2個(gè)療程治療失敗的幽門螺桿菌感染者30例，按照隨機(jī)抽樣法分為試驗(yàn)組和對照組，2組各15例，采用雙盲安慰劑對照試驗(yàn)，試驗(yàn)組每天晚餐后1～1.5 h口服抗體羊奶200 mL+1 mL NaHCO3(1 mol/L)，對照組口服普通羊奶200 mL+1 mL NaHCO3(1 mol/L)，連續(xù)飲用30 d，分別記錄受試者服用前、后14C尿素呼氣試驗(yàn)結(jié)果。臨床試驗(yàn)注冊號：ChiCTR-PRC-14005207。

本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)；受試者均知情同意。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料比較分別采用F檢驗(yàn)、LSD-t檢驗(yàn)和配對t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1雙相免疫擴(kuò)散試驗(yàn)結(jié)果 ATCC26695免疫所得抗體羊奶免疫雙擴(kuò)試驗(yàn)結(jié)果，為1個(gè)靠近外周孔的沉淀環(huán)，表明ATCC26695菌株與羊抗體奶中相應(yīng)抗體發(fā)生沉淀反應(yīng)； ATCC26695、SS1混合免疫所得抗體羊奶免疫雙擴(kuò)試驗(yàn)結(jié)果，為1個(gè)靠近外周孔的沉淀環(huán)和另外2個(gè)靠近中心孔的沉淀環(huán)。對照試驗(yàn)無任何沉淀線產(chǎn)生。

2.2ELISA試驗(yàn)檢測結(jié)果 ATCC26695抗體羊奶組和ATCC26695、SS1抗體羊奶組中抗Hp特異性抗體含量高于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且隨著稀釋倍數(shù)增大，抗體含量逐漸降低；2種抗體羊奶間抗體含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，二者抗體效價(jià)均可達(dá)到1∶800。見表1。

組別1∶1001∶2001∶4001∶800ATCC26695抗體羊奶組2.94±0.01?2.57±0.11?1.90±0.09?1.30±0.06?ATCC26695、SS1抗體羊奶組2.86±0.10?2.50±0.08?1.79±0.05?1.06±0.13?對照組0.26±0.020.27±0.060.26±0.040.26±0.01F值1 789.000703.400580.600130.500P值0.0000.0000.0000.000

*P值<0.05與對照組比較(LSD-t檢驗(yàn))

2.3臨床試驗(yàn)效果評價(jià) 由于ELISA結(jié)果顯示ATCC26695抗體羊奶和ATCC26695、SS1抗體羊奶中抗Hp特異性抗體含量沒有差異，又因ATCC26695免疫奶羊出現(xiàn)意外，收集奶量不足，故臨床試驗(yàn)選用ATCC26695、SS1抗體羊奶進(jìn)行。結(jié)果顯示，試驗(yàn)組15例在服用抗體羊奶后有10例14C尿素呼氣試驗(yàn)數(shù)值明顯下降，有效率為66.6%，安慰劑對照組在臨床試驗(yàn)前后14C尿素呼氣試驗(yàn)數(shù)值均無變化，見表2。

在有效人群中，與服用抗體羊奶前相比，服用抗體羊奶后可顯著降低14C尿素呼氣試驗(yàn)數(shù)值，二者相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表2 2組臨床試驗(yàn)效率比較Table 2 Efficiency comparison of two groups of clinical trials (n=15)

組別14C尿素呼氣試驗(yàn)數(shù)值治療前758.5±153.8治療后354.1±110.8t值2.100P值0.040

3 討 論

目前，我國人群幽門螺桿菌感染率約為50%[7]，根除幽門螺桿菌對預(yù)防胃癌的重要性多次在相關(guān)共識中強(qiáng)調(diào)[8-9]。有研究表明，根除幽門螺桿菌可減少 50%的胃癌發(fā)病率，肯定了在癌前病變及癌癥早期階段根除幽門螺桿菌的意義[10]。近年來，幽門螺桿菌感染的治療已取得了重大進(jìn)展，但隨著臨床上根除治療的廣泛應(yīng)用，使得其耐藥率也不斷增加[11-13]，同時(shí)也給患者帶來了一定的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。本研究應(yīng)用含有抗Hp特異性抗體免疫乳治療幽門螺桿菌感染不僅解決了細(xì)菌的耐藥問題，同時(shí)提供了豐富的營養(yǎng)，是較為經(jīng)濟(jì)、安全的手段。

本研究免疫雙擴(kuò)試驗(yàn)結(jié)果顯示，2種凝膠中均有沉淀環(huán)產(chǎn)生，說明抗體羊奶中含有抗Hp特異性抗體；ELISA檢測結(jié)果顯示抗體羊奶中抗Hp特異性抗體含量較高，效價(jià)可達(dá)1∶800，說明本研究成功構(gòu)建了檢測含Hp特異性抗體的ELISA檢測方法，并獲得了高濃度的含抗Hp特異性抗體羊奶，為后續(xù)系統(tǒng)性方法學(xué)評價(jià)奠定了基礎(chǔ)。比較2種檢測方法：免疫雙擴(kuò)試驗(yàn)是一種定性試驗(yàn)，耗時(shí)長，可重復(fù)性差，肉眼觀察結(jié)果有一定偏差，且抗體奶中抗體需達(dá)到一定量才能檢出，而ELISA方法可更為精確的定量檢測抗體含量，簡便、快速且易于標(biāo)準(zhǔn)化，隨時(shí)觀察抗體奶中抗體含量的變化，所獲得的結(jié)果更為可靠，可作為抗體羊奶應(yīng)用的動(dòng)態(tài)觀察指標(biāo)。2種抗體奶檢測試驗(yàn)可作為參考指標(biāo)互相作證。

雖然本研究經(jīng)ATCC26695和ATCC26695、SS1免疫所得2種羊奶抗體含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但由于不同幽門螺桿菌菌株的基因多態(tài)性具有明顯的地域分布差異[14-15]，且免疫菌株與感染的胃內(nèi)菌株可能存在差異，故有待于進(jìn)一步篩選當(dāng)?shù)亓餍芯赀M(jìn)行下一步研究。有研究表明，pH值在7.0～8.0時(shí)，特異性抗體能與幽門螺桿菌達(dá)到最大程度結(jié)合[16]，因此，本研究受試者在服用抗體羊奶的同時(shí)服用NaHCO3以中和胃酸，避免抗體的破壞。

本研究初步結(jié)果顯示，在試驗(yàn)組15例受試者中有10例14C尿素呼氣試驗(yàn)數(shù)值發(fā)生了明顯的降低，有效率達(dá)到66.6%，而安慰劑對照組無明顯變化。說明通過被動(dòng)免疫給予受試者抗體羊奶治療后，可有效降低感染者胃中的幽門螺桿菌含量，結(jié)合以往研究，推測其機(jī)制可能有2種途徑：一是通過羊奶中的有效抗體直接與幽門螺桿菌形成抗原抗體復(fù)合物，激活補(bǔ)體系統(tǒng)溶解菌體；二是通過羊奶中的多克隆抗體與幽門螺桿菌多種表面物質(zhì)結(jié)合，改變其生存環(huán)境及黏附作用，從而使其失活。此方法經(jīng)濟(jì)、營養(yǎng)、患者依從性好、無不良反應(yīng)且不會出現(xiàn)耐藥性等問題，但由于免疫奶羊后產(chǎn)奶量下降，收集奶量不足，致使臨床試驗(yàn)例數(shù)較少，后期仍需進(jìn)行大規(guī)模的研究。