曹冉華，呼群，張國建

內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，呼和浩特010050

2018年全球結(jié)直腸癌(CRC)新發(fā)病例110萬，居所有惡性腫瘤第3位；而死亡病例88萬，居所有惡性腫瘤第4位[1]。隨著我國飲食習(xí)慣的改變，CRC發(fā)病率和病死率逐漸上升，嚴(yán)重威脅人們身體健康[2]。因此有必要深入研究其發(fā)生發(fā)展機(jī)制。微小RNA(miR)是長度為18～25個核苷酸的內(nèi)源性非編碼RNA，可調(diào)控多條細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路，在慢性炎癥、腫瘤、免疫性疾病等疾病中均發(fā)揮重要作用[3，4]。miR-137位于人類染色體1p21.3，在非小細(xì)胞肺癌[5]、胰腺癌[6]等腫瘤組織中異常表達(dá)，可通過抑制MRGBP、SRC3等基因的表達(dá)，發(fā)揮腫瘤抑制作用。Notch信號通路進(jìn)化上較為保守，該通路主要由Notch受體、Notch配體和DNA結(jié)合蛋白構(gòu)成[7]。哺乳動物Notch受體包括Notch1～4四種，Notch配體包括Jagged1、Jagged2、Delta樣配體1(DLL1)、DLL3、DLL4。腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，常存在Notch信號通路過度活化，從而抑制腫瘤細(xì)胞分化、凋亡及促進(jìn)血管生成等[8]。近年來有研究表明，腫瘤細(xì)胞表面Notch1、DLL4表達(dá)升高，DLL4-Notch1介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)在腫瘤血管生成、浸潤及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要調(diào)控作用[9]。但目前CRC組織中miR-137與Notch1、DLL4表達(dá)的關(guān)系研究較少。本研究通過觀察CRC組織中miR-137、Notch1及DLL4的表達(dá)，分析各指標(biāo)表達(dá)的相關(guān)性，并探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2015年3月～2017年3月本院診治的CRC患者100例，男59例，女41例；年齡26～79(53.6±7.9)歲；腫瘤直徑≤3 cm者62例，>3 cm者38例；直腸癌35例，結(jié)腸癌65例；病理分級為高中分化71例，低分化29例；腫瘤分期Ⅰ期27例，Ⅱ期29例，Ⅲ期32例，Ⅳ期12例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移22例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移78例；遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移15例，無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移85例。納入標(biāo)準(zhǔn)：均經(jīng)病理檢查確診為結(jié)直腸腺癌；均為初次診治，以往未接受過放化療、免疫治療；臨床資料完整，患者及家屬均簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并炎性腸病、自身免疫性疾病等；合并其他惡性腫瘤；合并嚴(yán)重心肝肺腎等臟器功能不全。研究經(jīng)本院倫理委員會審核批準(zhǔn)通過。術(shù)中收集新鮮CRC組織及距腫瘤邊緣>3 cm的正常組織，置于凍存管內(nèi)液氮罐速凍，轉(zhuǎn)運至實驗室于-80 ℃冰箱保存。

1.2 CRC組織及癌旁正常組織中miR-137表達(dá)檢測 采用熒光定量PCR法。取組織100 mg，用miRNA分離試劑盒(康朗生物有限公司)提取組織中總RNA和miRNA。紫外分光光度法鑒定RNA溶液的濃度及純度合格后，-80 ℃冰箱保存待測。以總RNA為模板，用TaqMan miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，實驗步驟嚴(yán)格按照試劑盒(新海基因檢測有限公司)說明書進(jìn)行。miR-137特異性莖環(huán)正向引物序列：5′-TATTGCTTAAGAATACGCGTAG-3′，反向引物序列：5′-AACTCCAGCAGGACCATGTGAT-3′；內(nèi)參U6上游引物序列：5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3′，下游引物序列：3′-GGAACGCTTCACGAATTTG-5′。miR-137的總反應(yīng)體系20 μL，熒光定量PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性15 min，94 ℃變性15 s，58 ℃退火30 s，70 ℃延伸30 s，共40個循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束后PCR液-20 ℃冰箱保存。反應(yīng)均在實時定量PCR儀(美國ABI公司，ABI7500)上完成，每個樣本重復(fù)檢測3次。用相對Ct值法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.3 CRC組織及癌旁正常組織中Notch、DLL4蛋白表達(dá)檢測 采用免疫組化SP法。制備羊抗人Notch、DLL4多克隆抗體(工作濃度為1∶500)和即用型二抗(工作濃度為1∶2 000)。DAB顯色，蘇木精復(fù)染，光鏡觀察。羊抗人Notch、DLL4多克隆抗體、SP試劑盒、DAB試劑盒均購自北京中杉公司。實驗步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。陽性判斷采用二級計分法，即陽性細(xì)胞百分比<5%為0分，5%～25%為1分，>25%～50%為2分，>50%～75%為3分，>75%為4分；染色程度計分標(biāo)準(zhǔn)：淡黃色為1分，黃或深黃色為2分，褐色為3分。以上兩項評分相乘結(jié)果≥3判定為陽性。應(yīng)用Image-pro Plus6.0軟件測量陽性染色區(qū)域的光密度值，每個標(biāo)本隨機(jī)選取3個視野，取平均值作為目標(biāo)蛋白的相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 CRC組織與癌旁正常組織中miR-137、Notch1及DLL4蛋白表達(dá)比較 CRC組織與癌旁正常組織中miR-137相對表達(dá)量分別為0.79±0.24、3.61±0.69，CRC組織中miR-137相對表達(dá)量低于癌旁正常組織(t=38.601，P=0.000)。CRC組織與癌旁正常組織中Notch1蛋白陽性表達(dá)分別為47例(47%)、5例(5%)，CRC組織中Notch1蛋白陽性表達(dá)率高于癌旁正常組織(χ2=45.842，P=0.000)。CRC組織與癌旁正常組織中DLL4蛋白陽性表達(dá)分別為81例(81%)、29例(29%)，CRC組織中DLL4蛋白陽性表達(dá)率高于癌旁正常組織(χ2=50.731，P=0.000)。

2.2 CRC組織中miR-137、Notch1及DLL4表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系 CRC組織中miR-137表達(dá)與腫瘤分期有關(guān)(P<0.05)，與CRC患者其他臨床病理特征無關(guān)(P均>0.05)；Notch1、DLL4蛋白陽性表達(dá)與腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)(P均<0.05)，與性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤位置、組織分化程度無關(guān)(P均>0.05)。

表1 CRC組織中miR-137、Notch1及DLL4表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系

2.3 CRC組織中miR-137與Notch1、DLL4蛋白表達(dá)的相關(guān)性 CRC組織中miR-137的相對表達(dá)量與Notch1、DLL4蛋白相對表達(dá)量均呈負(fù)相關(guān)(r分別為-0.654、-0.612，P均<0.05)。

3 討論

近年來隨著影像學(xué)技術(shù)、內(nèi)鏡技術(shù)等診斷技術(shù)的發(fā)展，基于臨床分期分級等病理學(xué)特征對患者進(jìn)行手術(shù)、放化療及分子靶向治療等，延長了患者的生存時間，5年生存率達(dá)60%[10]。但由于CRC腫瘤的異質(zhì)性，相同分期的患者對相同治療方案的反應(yīng)及預(yù)后各不相同，因此有必要深入研究CRC發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制。近年來研究表明，CRC中Notch信號通路的激活在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起至關(guān)重要的作用，如在CRC細(xì)胞系中上調(diào)Notch1基因或其配體DLL4基因的表達(dá)后，可促進(jìn)HES1等轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，導(dǎo)致上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及干性相關(guān)蛋白的表達(dá)增加，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、浸潤和轉(zhuǎn)移，與CRC患者的不良預(yù)后相關(guān)[11]。miRNA是具有基因表達(dá)調(diào)控作用的非編碼RNA調(diào)控分子，研究表明，腫瘤組織中miR-137表達(dá)降低導(dǎo)致靶基因mRNA的穩(wěn)定性增加，腫瘤細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)，而過表達(dá)miR-137后促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡[6]。本研究癌組織中miR-137的相對表達(dá)量明顯低于癌旁正常組織，與以往研究報道一致[12]。目前其具體機(jī)制尚不清楚，可能是miR-137基因啟動子區(qū)域的CpG島的甲基化、泛素化等表觀遺傳學(xué)修飾后失活，導(dǎo)致miR-137表達(dá)降低[13]。本研究CRC組織中miR137的表達(dá)與腫瘤分期有關(guān)，Ⅲ～Ⅳ期癌組織miR-137表達(dá)明顯低于Ⅰ～Ⅱ期，表明miR-137參與CRC的發(fā)生發(fā)展。

本研究CRC組織中Notch1蛋白陽性表達(dá)率明顯高于癌旁組織，表明癌組織中Notch1蛋白表達(dá)增高，與以往研究[14]一致。其機(jī)制可能是腫瘤發(fā)生時某些miRNA，如miR-34a表達(dá)下降，其結(jié)合Notch1的mRNA的3′端非編碼區(qū)能力下降，導(dǎo)致Notch1蛋白表達(dá)升高，進(jìn)而影響下游基因如纖連蛋白、波形蛋白等，促進(jìn)腫瘤的惡性進(jìn)展[15]。此外，Notch1表達(dá)與腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)，其原因可能是Notch1的過表達(dá)促進(jìn)下游Twist、Snail等轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)，腫瘤分期增高[16]。

人類DLL4基因位于15q14，可編碼由685個氨基酸構(gòu)成的DLL4蛋白，其可表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞，亦可表達(dá)于腫瘤細(xì)胞表面，通過與Notch受體胞外域結(jié)合，活化下游信號。本研究癌組織中Notch1的配體DLL4蛋白表達(dá)較癌旁組織高，表明DLL4同樣參與CRC的發(fā)生發(fā)展過程。其表達(dá)升高的機(jī)制可能與DLL4的表達(dá)受miRNA的調(diào)控有關(guān)。有研究表明,miR-30a能負(fù)性調(diào)節(jié)DLL4 mRNA的表達(dá)，腫瘤發(fā)生時miR-30a表達(dá)下降，DLL4的表達(dá)增加，進(jìn)而促進(jìn)血管新生及腫瘤轉(zhuǎn)移[17]。此外，CRC組織中DLL4表達(dá)也與腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)，其原因可能是腫瘤組織中DLL4表達(dá)通過結(jié)合Notch1進(jìn)而激活Notch信號通路，促進(jìn)腫瘤的浸潤、淋巴及血行轉(zhuǎn)移；而在敲除DLL4后，Notch信號通路受到抑制，腫瘤的浸潤及轉(zhuǎn)移能力下降[18]。

本研究進(jìn)一步分析CRC組織中miR137與Notch1、DLL4表達(dá)的相關(guān)性，結(jié)果均呈負(fù)相關(guān)。其機(jī)制可能是miR137可結(jié)合Notch1、DLL4的mRNA 3′UTR區(qū)，改變mRNA穩(wěn)定性，進(jìn)而負(fù)性調(diào)節(jié)Notch1、DLL4的表達(dá)[19]。

綜上所述，CRC組織中miR137表達(dá)下降，而Notch1、DLL4表達(dá)增加，三者共同參與CRC的發(fā)生發(fā)展，有可能成為CRC診斷、治療及預(yù)后評估的腫瘤標(biāo)志物，但對于三者之間具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。