王思源，韓波，南春紅，平靜

遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，沈陽(yáng)110032

哮喘是兒童常見的慢性炎癥性疾病之一，該病除過敏因素誘發(fā)外，呼吸道病毒感染也是主要原因之一[1,2]，其中呼吸道合胞病毒(RSV)是誘發(fā)和加重哮喘的主要原因[3]。RSV感染誘發(fā)哮喘導(dǎo)致機(jī)體的免疫應(yīng)答及細(xì)胞因子水平異常，表現(xiàn)為輔助性T細(xì)胞(Th1/Th2)失衡、Th2功能活化亢進(jìn)[4,5]。細(xì)胞因子受體介導(dǎo)的Janus激酶/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子(JAK/STAT)信號(hào)通路在RSV誘發(fā)的哮喘發(fā)病中起重要作用[6]。此外調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)與Th17細(xì)胞之間的平衡在RSV誘發(fā)的哮喘發(fā)病過程中也發(fā)揮重要作用[7]。麻杏石甘湯出自《傷寒論》，具有辛涼宣肺、止咳平喘之功，是治療哮喘的常用方劑之一。以麻杏石甘湯為基礎(chǔ)方劑的制劑在臨床上應(yīng)用廣泛，療效明確[8]。麻杏石甘湯治療急性病毒性感染哮喘效果較好[9]，但具體作用機(jī)制尚不清楚。2017年5月～2019年4月，本研究觀察了麻杏石甘湯對(duì)RSV感染哮喘小鼠肺組織的作用及機(jī)制，為中醫(yī)藥防治病毒性哮喘的作用機(jī)制研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 SPF級(jí)雄性Balb/c小鼠50只，6～8周齡，體質(zhì)量(18±2)g，購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物科技股份有限公司。小鼠置于無(wú)病原體清潔籠內(nèi)飼養(yǎng)，飼料和飲用水經(jīng)高溫高壓消毒。麻杏石甘湯(麻黃6 g、杏仁9 g、甘草6 g、石膏24 g)購(gòu)自遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院。陽(yáng)性對(duì)照藥順爾寧購(gòu)自杭州默沙東制藥有限公司。RSV Long株，由中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒所毒種室提供，培養(yǎng)Hep-2細(xì)胞進(jìn)行RSV擴(kuò)增，測(cè)定半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量(TCID50)=3.23，測(cè)定小鼠病毒半數(shù)致死量=3.4。卵清白蛋白(OVA)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；兔抗小鼠JAK1多克隆抗體購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；兔抗小鼠STAT6多克隆抗體購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；二步法免疫組化檢測(cè)試劑、DAB顯色試劑盒、蘇木精染液購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；小鼠IL-10、IL-17的ELISA試劑盒購(gòu)自南京凱基生物科技有限公司。

1.2 藥物配置 麻杏石甘湯煎制方法參照衛(wèi)生部國(guó)家中醫(yī)藥管理局發(fā)布的《醫(yī)療機(jī)構(gòu)中藥煎藥室管理規(guī)范》，麻黃、甘草采用500 mL無(wú)菌蒸餾水浸泡30 min，煮60 min，然后加入杏仁、石膏(紗布包裹)同煮30 min，過濾留上清液，殘?jiān)? 000 mL雙蒸水煎30 min，過濾，合并濾液，濃縮至麻杏石甘湯高劑量(MGDH)、低劑量(MGDL)分別含生藥0.24、0.12 g/mL。陽(yáng)性對(duì)照藥順爾寧5 mg，以無(wú)菌蒸餾水稀釋至12 μg/mL。按照70 kg成人臨床等效劑量折算小鼠用量，MGDH、MGDL、順爾寧的劑量分別為12、6、0.6 mg/(kg·d)，4 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 動(dòng)物分組及模型制備 將小鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、MGDH組、MGDL組、陽(yáng)性藥對(duì)照組5組，每組10只。除正常組外，其余各組參考文獻(xiàn)[10]建立哮喘模型，于第1、8天經(jīng)腹腔注射致敏液OVA 20 μg與Al(OH)32.25 mg，第14～27天將小鼠置于透明密閉容器中以1% OVA溶液10 mL霧化吸入，每次20 min，分別于第28～30天以10 TCID50的RSV 25 μL鼻腔滴入，每天1次；正常組以生理鹽水替代，每日觀察小鼠癥狀。末次RSV滴鼻2 h后，MGDH組、MGDL組分別給予MGD 12、6 mg/(kg·d)灌胃，陽(yáng)性藥對(duì)照組給予順爾寧0.6 mg/(kg·d)灌胃，模型組給予等量生理鹽水灌胃，均每天1次，連續(xù)灌胃7 d。于末次給藥2 h后，用水合氯醛麻醉，經(jīng)腹主動(dòng)脈取血，5 000 r/min離心，取上清液，-80 ℃保存?zhèn)溆?，分離小鼠肺組織，取肺葉放于4%多聚甲醛溶液中固定。

1.4 肺組織病理變化觀察 取固定好的肺組織石蠟包埋，切片(厚5 μm)，經(jīng)HE染色、中性樹膠封固后于顯微鏡下觀察肺組織病理變化。

1.5 血清IL-10、IL-17檢測(cè) 采用ELISA法檢測(cè)血清IL-10、IL-17，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.6 肺組織中JAK1、STAT6蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用免疫組化法。取石蠟切片常規(guī)脫水，過氧化氫室溫處理10 min，進(jìn)行熱修復(fù)抗原；滴加正常山羊血清封閉，室溫靜置20 min。加一抗：JAK1、STAT6兔抗小鼠多克隆抗體，1∶200稀釋，4 ℃孵育過夜。加生物素標(biāo)記的二抗(山羊抗兔的IgG)，37 ℃孵育20 min。DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水、透明、封片。光學(xué)顯微鏡觀察，采用北航圖像采集分析系統(tǒng)對(duì)肺組織切片進(jìn)行圖像采集，每張切片隨機(jī)選取4個(gè)不重疊視野拍照。以肺組織中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性表達(dá)。Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)分析圖像，測(cè)定肺組織中陽(yáng)性細(xì)胞積分光密度值，以均值作為JAK1、STAT6蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 各組肺組織病理變化 鏡下可見正常組肺泡壁光滑，毛細(xì)血管無(wú)擴(kuò)張，支氣管管腔規(guī)則，氣道內(nèi)未見黏液分布及黏液栓，無(wú)炎性細(xì)胞沁潤(rùn)。模型組肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡腔明顯變窄，毛細(xì)血管擴(kuò)張充血，氣道結(jié)構(gòu)紊亂，氣道上皮細(xì)胞壞死、甚至脫落，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯。MGDH組、陽(yáng)性藥對(duì)照組，肺內(nèi)炎性細(xì)胞減少，氣道上皮黏液分泌物減少、形態(tài)較完整。MGDL組肺內(nèi)細(xì)支氣管及血管周圍炎性細(xì)胞浸潤(rùn)有一定改善。

2.2 各組血清IL-10、IL-17水平比較 與正常組比較，模型組血清IL-10水平低、IL-17水平高(P均<0.05)；與模型組比較，MGDL組、MGDH組、陽(yáng)性藥對(duì)照組血清IL-10水平高、IL-17水平低(P均<0.05)；與MGDL組比較，MGDH組、陽(yáng)性藥對(duì)照組血清IL-10水平高、IL-17水平低(P均<0.05)；MGDH組、陽(yáng)性藥對(duì)照組血清IL-10、IL-17水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表1。

表1 各組血清IL-10、IL-17水平比較

注：與正常組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05；與MGDL組比較，△P<0.05

2.3 各組肺組織中JAK1、STAT6蛋白表達(dá)比較 與正常組比較，模型組肺組織中JAK1、STAT6蛋白相對(duì)表達(dá)量高(P均<0.05)；與模型組比較，MGDL劑量組、MGDH劑量組、陽(yáng)性藥對(duì)照組肺組織中JAK1、STAT6蛋白表達(dá)低(P均<0.05)；與MGDL組比較，MGDH組肺組織中STAT6蛋白低(P<0.05)，陽(yáng)性藥對(duì)照組肺組織中JAK1、STAT6蛋白表達(dá)低，(P均<0.05)；與MGDH組比，陽(yáng)性藥對(duì)照組肺組織中JAK1、STAT6蛋白相對(duì)表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表2。

表2 各組肺組織中JAK1、STAT6蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

注：與正常組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05；與MGDL組比較，△P<0.05

3 討論

RSV是嬰幼兒時(shí)期導(dǎo)致呼吸道感染最重要的病毒之一，嚴(yán)重者表現(xiàn)為毛細(xì)支氣管炎，進(jìn)一步感染能導(dǎo)致嬰幼兒反復(fù)喘息、氣道高反應(yīng)性而誘發(fā)哮喘。臨床以傳統(tǒng)古方麻杏石甘湯為基本方進(jìn)行治療，取得了滿意療效。麻杏石甘湯出自《傷寒論》，該方由麻黃、杏仁、石膏、甘草組成，具有清肺滌痰平喘作用。方中麻黃乃“喘家圣藥”，能宣肺降氣，止咳平喘；杏仁味苦性微溫，能降肺氣、平喘止咳，助麻黃疏肺利氣、止咳平喘。二藥有宣有降，可暢通氣道。石膏清泄肺熱，甘草鎮(zhèn)咳平喘。研究證實(shí),麻杏石甘湯通過調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡，加強(qiáng)肺功能，改善支氣管哮喘[11]；并通過降低基質(zhì)金屬蛋白酶9、基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子1的表達(dá)改善哮喘模型小鼠氣道重塑狀態(tài)[12]。加味麻杏石甘湯有效抑制呼吸道RSV大鼠模型血清腫瘤壞死因子α、嗜酸性陽(yáng)離子蛋白[13]，可見麻杏石甘湯治療病毒性哮喘有一定效果。

RSV誘發(fā)哮喘可能與Treg/Th17失衡有關(guān)[14]。Th17主要通過分泌IL-17發(fā)揮其作用，IL-17是一種前炎性細(xì)胞因子，可分泌IL-8、IL-6等炎性細(xì)胞因子，使嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞在哮喘的氣道中聚集[15]，增加氣道的高反應(yīng)性，進(jìn)而促使哮喘氣道重塑。Treg細(xì)胞是一種免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞，主要通過調(diào)節(jié)外周免疫耐受控制免疫性疾病，避免免疫反應(yīng)中效應(yīng)性T細(xì)胞過度活化和組織損傷。Treg細(xì)胞通過抑制細(xì)胞因子IL-10和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β發(fā)揮作用。IL-10是具有多項(xiàng)生物學(xué)活性的強(qiáng)力免疫抑制因子，可以阻斷炎癥細(xì)胞、炎癥因子的釋放，還可抑制巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞的功能，IL-10在哮喘的控制中起重要作用[16]。本研究中模型組炎性因子IL-17分泌增加，抗炎性因子IL-10減少，推測(cè)RSV可能通過增強(qiáng)機(jī)體的炎癥反應(yīng)，進(jìn)而影響Treg/Th17的免疫調(diào)節(jié)。MGDH、MGDL治療后改善RSV誘發(fā)哮喘小鼠Treg/Th17細(xì)胞因子失衡；與模型組比較，MGDH、MGDL組及陽(yáng)性藥對(duì)照組可IL-10水平升高，IL-17水平降低。且麻杏石甘湯的療效可能在一定范圍內(nèi)隨著劑量的增加而增強(qiáng)。

免疫機(jī)制研究顯示，RSV哮喘典型代表為Th1/Th2細(xì)胞因子失衡，這兩類細(xì)胞因子介導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)，均與JAK/STAT信號(hào)通路激活有關(guān)。JAK/STAT信號(hào)通路是細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要途徑之一，參與炎癥反應(yīng)，同時(shí)也影響細(xì)胞增殖、分化、凋亡以及免疫調(diào)節(jié)[17]。研究表明，RSV導(dǎo)致的哮喘Th2分泌的白細(xì)胞介素、干擾素等高表達(dá)，與其受體結(jié)合后激活JAK家族，促使STAT家族磷酸化穿過核膜進(jìn)入核內(nèi)引起靶細(xì)胞反應(yīng)[18]?；罨腎L-4受體激活JAK1和JAK3，進(jìn)而活化STAT6[19]，提示JAK1激活可能與哮喘有關(guān)。STAT家族是JAK的下游信號(hào)，目前已發(fā)現(xiàn)7個(gè)STAT亞型，其中STAT6與哮喘關(guān)系最為密切。STAT6是誘導(dǎo)Th2細(xì)胞分化的特異性轉(zhuǎn)錄因子，在Th2細(xì)胞的分化中起關(guān)鍵性作用；同時(shí)Th2細(xì)胞分泌的IL-4可誘導(dǎo)STAT6磷酸化激活JAK/STAT6通路，參與杯狀細(xì)胞化生，導(dǎo)致黏液過量分泌[20]，誘發(fā)哮喘。本研究結(jié)果顯示，模型組的肺組織病變嚴(yán)重，JAK1、STAT6蛋白表達(dá)升高，說明RSV病毒能上調(diào)JAK1、STAT6介導(dǎo)信號(hào)因子，從而激發(fā)JAK/STAT信號(hào)通路，誘導(dǎo)病毒性哮喘。經(jīng)MGDH、MGDL治療后，肺組織病變明顯改善，肺組織細(xì)胞JAK1、STAT6蛋白表達(dá)下降。這表明MGD能通過抑制JAK/STAT信號(hào)通路的激活，從而減輕肺組織病理?yè)p傷，對(duì)RSV引起的哮喘有良好的治療作用。

綜上所述，麻杏石甘湯可有效改善RSV誘導(dǎo)哮喘小鼠肺組織炎癥狀態(tài)，其機(jī)制可能與改善Treg/Th17失衡，降低JAK1、STAT6蛋白表達(dá)有關(guān)。但對(duì)Treg、Th17其他細(xì)胞因子以及JAK/STAT上下游信號(hào)通路的作用有待進(jìn)一步研究；同時(shí)在今后課題設(shè)計(jì)上可增加給藥后不同時(shí)間點(diǎn)的觀察，進(jìn)一步探討麻杏石甘湯對(duì)RSV誘導(dǎo)哮喘的作用機(jī)制及時(shí)效關(guān)系。