郭燦璨，朱宇珍，2，吳科鋒，2，李立，2，呂應(yīng)年，2，鄭學(xué)寶，葉華，2

1廣東醫(yī)科大學(xué)廣東省天然藥物研究與開發(fā)重點實驗室，廣東湛江524023；2廣東醫(yī)科大學(xué)海洋醫(yī)藥研究院；3廣州中醫(yī)藥大學(xué)

潰瘍性結(jié)腸炎(UC)是一種慢性特發(fā)性腸道疾病，為炎癥性腸病最常見的類型，病變主要累及結(jié)直腸黏膜，臨床表現(xiàn)為腹痛、腹瀉、血性黏液便等，間歇發(fā)作，可持續(xù)數(shù)年甚至數(shù)十年。UC患者罹患結(jié)直腸癌的風(fēng)險是正常人群的5倍[1]。研究認(rèn)為，UC病因與腸道環(huán)境、機體免疫、遺傳基因有關(guān)，但具體發(fā)病機制尚未明確[2，3]。微小RNA(miRNA)是一類進化上非常保守的內(nèi)源性非編碼小分子(18～24個核苷酸)RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因表達[4]。miR-21是較為特殊的miRNA，在人體所有實體腫瘤組織中都呈高表達[5，6]，在炎癥性腸病患者的炎癥組織及血清中均表達上調(diào)[7，8]。因此，miR-21可能成為炎癥性腸病的潛在生物標(biāo)記物。在炎癥刺激下，c-Jun氨基末端激酶(JNK)參與免疫活性細胞協(xié)調(diào)釋放細胞因子及中性粒細胞反應(yīng)，JNK可通過活化轉(zhuǎn)錄因子c-Jun作用于啟動子元件(AP-1)位點介導(dǎo)TNFSF15基因的反式激活，參與炎癥性腸病的發(fā)生。2017～2019年，本研究探討UC小鼠腸道m(xù)iR-21的表達及其與JNK/AP-1信號通路的關(guān)系，為進一步明確UC的發(fā)病機制提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 C57BL/6小鼠16只，雄性，鼠齡7周，體質(zhì)量17～19 g，SPF級，購自廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心，合格證編號：SCXK(粵)2013-0002，飼養(yǎng)于廣東醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心[SYXK(粵)2015-0147]。葡聚糖硫酸鈉(DSS)MW.36000～50000購自美國MP公司，兔抗小鼠p-c-Jun(Ser73)、p-c-Jun(Ser63)、p-JNK Thr183/Tyr185)購自美國CST公司，SP600125購自美國Sigma公司，小鼠隱血試劑盒購自南京建成生物工程研究所，BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒購自碧云天生物科技研究所，TRIzol總RNA提取試劑盒購自美國Life technology公司，熒光定量PCR試劑盒DBI-2043購自德國DBI公司，EZ-ChipTM試劑盒購自美國Merck Millpore公司。組織包埋機購自武漢俊杰電子有限公司，組織切片機RM2235購自德國LEICA公司，穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀和垂直板電泳槽購自美國Bio-Rad公司，MasterCycler Gradient PCR儀購自德國Eppendorf公司。

1.2 UC小鼠模型制備 將小鼠隨機分為對照組和模型組，每組8只。模型組小鼠自由飲用2.5% DSS水溶液6 d建立急性UC模型，對照組小鼠自由飲用雙蒸水。

1.3 小鼠一般情況觀察 每天觀察小鼠進食量、精神狀態(tài)、活動情況等，記錄小鼠體質(zhì)量、大便性狀及便血情況，按Cooper法進行小鼠疾病活動度(DAI)評分。實驗第11天處死小鼠，取結(jié)腸組織，量取結(jié)腸長度。

1.4 結(jié)腸組織中miR-21、JNK1、JNK2及c-Jun mRNA表達檢測 采用RT-PCR法。取小鼠結(jié)腸標(biāo)本，TRIzol法提取RNA，于酶標(biāo)儀上檢測RNA的濃度及純度后，采用SYBR Green I嵌合熒光RT-PCR法檢測miR-21、JNK1、JNK2、c-Jun mRNA表達，引物由Invitrogen公司合成，miR-21上游引物序列5′-GCCGCGTAGCTTATCAGACT-3′，下游引物序列5′-CAGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′；U6上游引物序列5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物序列5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；JNK1上游引物序列5′-AACAGCTCGGAACACCTTGT-3′，下游引物序列5′-TCTCTTGCCTGACTGGCTTT-3′；JNK2上游引物序列5′-AGTGACAGTAAAAGCGATGGTC-3′，下游引物序列5′-AGCACAAACAATTCCTTGGGC-3′；c-Jun上游引物序列5′-AGCAGGGACCCATGGAAGTT-3′，下游引物序列5′-ATGCACAAGCAAAGGTCATCTTT-3′；GAPDH上游引物序列5′-TGTGTCCGTCGTGGATCTGA-3′，下游引物序列5′-TTGCTGTTGAAGTCGCAGGAG-3′。反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃ 10 s，60 ℃ 34 s，40個循環(huán)，72 ℃ 30 s。以GAPDH為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。

1.5 結(jié)腸組織中p-JNK、p-Ser63、p-Ser73蛋白表達檢測 采用Western blotting法。制備結(jié)腸組織蛋白樣品，用BCA法進行蛋白定量，100 ℃水浴變性后備用。配制10%的分離膠和5%的濃縮膠，將處理好的蛋白樣品及蛋白Marker加入樣品槽，恒壓電泳分離(90 V 30 min，120 V 1 h)。轉(zhuǎn)膜封閉后，加入一定比例稀釋的一抗4 ℃孵育過夜；TBST洗滌3次，加入封閉液稀釋好的二抗室溫孵育60 min，TBST洗滌3次，化學(xué)發(fā)光后采集圖像，用Gel-Pro 軟件計算各蛋白的吸光度，以目的蛋白條帶灰度值與GAPDH條帶灰度值的比值計算目標(biāo)蛋白相對表達量。

1.6 結(jié)腸組織中miR-21與c-Jun相互作用檢測 采用染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)實驗。將結(jié)腸組織交聯(lián)裂解超聲后進行DNA片段化檢測，瓊脂糖凝膠電泳分析DNA片段符合預(yù)期目標(biāo)。于樣品管中分別加入Rabbit IgG或c-Jun抗體，4 ℃過夜旋轉(zhuǎn)后進行IP反應(yīng)。洗滌洗脫后進行Protein/DNA解交聯(lián)及DNA純化，根據(jù)miR-21的啟動子AP-1位點設(shè)計以下四對引物進行PCR反應(yīng)。第1對引物上游序列5′-ATGGAACAATTAATATGCC-3′，下游序列5′-ATGGCGTACTCATTTGTGAG-3′；第2對引物上游序列5′-GGATAGCAATCTTGCATGTCTATC-3′，下游序列5′-CGACTTCATTCTAAATATACAGAAT-3′；第3對引物上游序列5′- CCTTCCTTTCCCACCCTCAA-3′，下游序列5′- GGCGTACTCATTTGTGAGACA-3′；第4對引物上游序列5′- ATGCCTTCCTTTCCCACCCT-3′，下游序列5′- CTCATTTGTGAGACACCAACCA-3′。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，拍照。

2 結(jié)果

2.1 兩組一般情況比較 對照組小鼠毛色光澤，飲食、精神及活動均正常，未見隱血陽性；模型組小鼠毛發(fā)色澤灰暗，活動及食量減少，精神萎靡，體質(zhì)量下降，第2天開始相繼出現(xiàn)大便隱血陽性、軟便，實驗后期可見稀血便。與對照組比較，模型組造模第2天開始DAI評分持續(xù)升高，直至實驗結(jié)束。對照組小鼠結(jié)腸整體細長，長度為(5.89±0.26)cm，顏色較淡，腸管內(nèi)充滿成形大便；模型組小鼠結(jié)腸長度為(4.07±0.34)cm，短于對照組(P<0.01)，顏色偏紅，腸壁充血、腫脹，嚴(yán)重者自盲腸端至直腸均為血便。見圖1。

圖1 兩組DAI評分比較

2.2 兩組結(jié)腸組織中miR-21表達比較 對照組、模型組結(jié)腸組織中miR-21相對表達量分別為1.00±0.18、13.92±1.23。與對照組比較，模型組miR-21相對表達量高(P<0.01)。

2.3 兩組結(jié)腸組織中JNK/AP-1信號通路相關(guān)標(biāo)志物表達比較 對照組結(jié)腸組織中JNK1、JNK2、c-Jun mRNA相對表達量分別為1.01±0.19、1.00±0.10、1.00±0.07，模型組分別為0.59±0.01、0.71±0.04、1.99±0.47。模型組結(jié)腸組織中JNK1、JNK2 mRNA相對表達量低于對照組(P均<0.01)，c-Jun mRNA相對表達量高于對照組(P<0.01)。對照組p-JNK、p-Ser63、p-Ser73蛋白相對表達量分別為0.15±0.01、0.14±0.01、0.03±0.005，模型組分別為0.30±0.01、0.81±0.01、0.08±0.006。模型組結(jié)腸組織中p-JNK、p-Ser63、p-Ser73蛋白相對表達量高于對照組(P均<0.01)。

2.4 miR-21啟動子位點AP-1序列與c-Jun的結(jié)合情況 在AP-1孔處并未出現(xiàn)條帶，表明c-Jun蛋白并未與miR-21啟動子區(qū)AP-1位點結(jié)合。

3 討論

miR-21是定位于17p23.2染色體區(qū)域且高度保守的單基因編碼miRNA，可以負向調(diào)控抑癌基因PDCD4表達，從而促進腫瘤生長浸潤和轉(zhuǎn)移，是一種重要的腫瘤生物學(xué)指標(biāo)[9]。miR-21是結(jié)直腸癌組織中研究較多的表達失調(diào)的一種miRNA，其在結(jié)腸癌組織中的表達高于結(jié)腸正常組織[10,11]。同時，miR-21在所有炎癥性腸病患者的炎癥組織和血清中的表達均上調(diào)[7,8]。本研究采用DSS誘導(dǎo)建立小鼠UC模型，發(fā)現(xiàn)模型組結(jié)腸組織中miR-21的表達升高，提示miR-21可能參與UC疾病的進展及UC相關(guān)結(jié)直腸癌的發(fā)生。

UC發(fā)病普遍認(rèn)為是由免疫功能失調(diào)、炎癥介質(zhì)釋放引起的強烈炎癥反應(yīng)。JNK是MAPK超家族的成員之一[12]，JNK1既可以調(diào)節(jié)抗凋亡途徑，也可參與促凋亡活動，其失活可以增強TNF-α引發(fā)的凋亡;JNK2可通過磷酸化Bcl-2家族蛋白，促使細胞色素C釋放、Caspase活化、細胞的死亡來促進細胞凋亡。兩者功能失調(diào)可造成慢性炎癥、缺血再灌注損傷、神經(jīng)退行性變、糖尿病和腫瘤等多種疾病。在炎癥刺激下，JNK參與免疫活性細胞協(xié)調(diào)釋放細胞因子及中性粒細胞[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，模型組小鼠p-JNK蛋白表達高，JNK1、JNK2 mRNA表達低。這可能是由于急性UC小鼠模型激活的免疫細胞促凋亡與抗凋亡平衡失調(diào)，導(dǎo)致具有促炎活性的免疫細胞增殖活力增強，凋亡相對減弱，炎癥反應(yīng)持續(xù)被激活。而研究顯示,JNK1或JNK2基因敲除的小鼠與野生鼠相比反而加劇DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎[14]，與本研究相一致，推測JNK1、JNK2基因可能在UC發(fā)病中起保護作用。

JNK信號通路被外界因素激活后，可進一步使核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子c-Jun的氨基末端第63位和第73位絲氨酸殘基磷酸化，進而激活c-Jun而增強其轉(zhuǎn)錄活性。c-Jun氨基末端的磷酸化還可以促進c-Jun/c-Fos異二聚體及c-Jun同二聚體形成，這些轉(zhuǎn)錄因子可結(jié)合許多基因啟動子區(qū)的AP-1位點，而AP-1活性增加又能誘導(dǎo)c-Jun轉(zhuǎn)錄，形成正反饋調(diào)控[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠p-c-Jun(p-Ser73、p-Ser63)蛋白表達、c-Jun mRNA的表達較對照組高，促使轉(zhuǎn)錄因子AP-1活化，進而與炎性因子的啟動子區(qū)域AP-1位點結(jié)合，調(diào)節(jié)炎性因子的表達，參與UC的發(fā)病。

對miR-21分子結(jié)構(gòu)的研究發(fā)現(xiàn)，其在生物體內(nèi)有很強的保守性，啟動子具有AP-1、STAT3及NFI等多個增強子原件結(jié)合位點[16]，這些增強子原件能夠通過不同的信號通路介導(dǎo)，共同調(diào)節(jié)miR-21的表達。研究發(fā)現(xiàn)，在順鉑治療抵抗的卵巢癌組織中JNK1/c-Jun信號通路可以上調(diào)miR-21表達，導(dǎo)致PDCD4表達下調(diào)，從而發(fā)揮治療作用[17]；姜黃素可通過AP-1位點來抑制miR-21的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，進而抑制結(jié)直腸癌細胞的增殖[18]；白藜蘆醇可以通過MAPK/AP-1途徑調(diào)節(jié)miR-21抑制博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化[19]。本研究通過ChIP實驗分析p-c-Jun與miR-21啟動子位點AP-1序列的結(jié)合，但結(jié)果為陰性，提示在UC中JNK通路不能直接通過其下游轉(zhuǎn)錄因子c-Jun來調(diào)節(jié)miR-21的表達。

綜上所述，UC小鼠結(jié)腸組織中miR-21呈高表達；JNK/AP-1信號通路相關(guān)標(biāo)志物JNK1、JNK2呈低表達，c-Jun、p-JNK、p-Ser63、p-Ser73呈高表達。提示UC小鼠的發(fā)病與miR-21及JNK/AP-1信號通路有關(guān)，但未發(fā)現(xiàn)p-c-Jun與miR-21啟動子位點AP-1序列的結(jié)合，說明JNK信號通路并不是直接通過下游轉(zhuǎn)錄因子c-Jun調(diào)節(jié)miR-21的表達，具體調(diào)節(jié)機制仍需進一步深入研究。