宋秀婧 楊鐵波 王明暉 劉仁龍 顧少巖 張 堯

(齊齊哈爾市第一醫(yī)院呼吸內(nèi)一科，齊齊哈爾 161000)

肺癌屬于呼吸系統(tǒng)惡性腫瘤，其發(fā)生機制十分復雜，不僅與環(huán)境等外界因素有關(guān)，還與細胞內(nèi)基因的表達調(diào)控有關(guān)[1]。IL-24是IL-10細胞因子家族成員之一，人體黑素細胞、脾細胞、胸腺細胞等都可以表達IL-24[2]。最近的研究報告顯示，IL-24參與腫瘤的進展，過量的IL-24可以抑制腫瘤的生長，并且對于正常細胞生長沒有影響[3]。在肺癌中的研究報道顯示，IL-24轉(zhuǎn)染后的肺癌細胞凋亡增多，細胞生長受到抑制，而對于正常的支氣管上皮細胞沒有影響，說明IL-24發(fā)揮誘導肺癌細胞凋亡和抑制肺癌細胞生長的作用[4]。還有研究報道表明，IL-24還可以抑制卵巢癌、宮頸癌等腫瘤細胞的侵襲和遷移，并且可以上調(diào)腫瘤細胞中E-cadherin表達水平，IL-24抗腫瘤轉(zhuǎn)移的作用可能與E-cadherin有關(guān)[5,6]。目前對于IL-24對肺癌細胞侵襲和遷移的影響和機制尚不明確。本實驗以明確IL-24對肺癌細胞侵襲和遷移的影響和機制為目的，以肺癌細胞A549作為體外實驗對象，以期為闡明IL-24抗肺癌作用機制提供參考。

1 材料與方法

1.1材料 肺癌細胞A549購自武漢普諾賽生命科技有限公司；pcDNA3.1-IL-24、pcDNA3.1購自北京合生基因科技有限公司；IL-24抗體、MMP-9抗體購自美國Abcam；cDNA合成試劑盒購自美國BIOMIGA；E-cadherin shRNA和shRNA陰性對照購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；MMP-2、E-cadherin、Ki-67抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology；Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen。

1.2方法

1.2.1pcDNA3.1-IL-24轉(zhuǎn)染和過表達效果檢測 肺癌細胞中分別轉(zhuǎn)染對照載體pcDNA3.1和IL-24過表達載體pcDNA3.1-IL-24，記為pcDNA3.1、pcDNA3.1-IL-24，設(shè)置不轉(zhuǎn)染載體的肺癌細胞為對照組。轉(zhuǎn)染試劑為Lipofectamine 2000，步驟同轉(zhuǎn)染試劑說明。細胞轉(zhuǎn)染后2 d，用Real time PCR和Western blot方法測定過表達效果。

1.2.1.1Real time PCR 每組取106個細胞，分別添加800 μl的TRIZOL試劑提取RNA，最后添加DEPC水將RNA溶解，以紫外分光光度計測定A260nm和A280nm比值在1.8～2.0之間。常規(guī)方法合成cDNA，步驟同cDNA合成試劑盒，逆轉(zhuǎn)錄條件為：42℃孵育30 min，85℃孵育10 min。取cDNA，進行PCR反應，PCR包括：0.08 μl的上下游引物(20 μmol/L)、2 μl的cDNA模板、0.4 μl的TaqDNA聚合酶、10 μl的2×定量PCR Master Mix，最后添加ddH2O，共20 μl，PCR反應條件為：95℃孵育3 min ；95℃孵育12 s，62℃孵育40 s，40個循環(huán)。以2-ΔΔCt方法計算IL-24表達水平。β-actin引物：F-5′-GGGACCTGACTGACTACCTC-3′，R-5′-TCATAC-TCCTGCTTGCTGAT-3′。IL-24引物：F-5′-AATAGG-GCTAGCGCCACCATGAATTTTCAACAGAGGCT-3′，R-5′-GAATTCGGTCTCCTCGAGGAGCTTGTAGAATTTCT-GCA-3′。

1.2.1.2Western blot 在細胞中添加裂解溶液，置于冰上孵育40 min，轉(zhuǎn)移至離心管中，4℃，12 000 g離心10 min，吸取蛋白溶液(上清)，常規(guī)BCA方法測定各組蛋白濃度，再添加Loading Buffer煮沸5 min。SDS-PAGE凝膠電泳時每個孔內(nèi)的蛋白樣品量為30 μg，50 V電壓條件下觀察藍色條帶已經(jīng)進入到分離膠及濃縮膠的分界處時，將電壓調(diào)整到120 V，觀察藍色條帶已經(jīng)跑出分離膠時，停止電泳。設(shè)置300 mA電流轉(zhuǎn)膜，把蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜時間共100 min。取出PVDF膜，置于含5%牛血清白蛋白封閉液的平皿內(nèi)反應2 h后，把PVDF膜再放置于抗體孵育袋中，添加IL-24一抗孵育液，封口后，置于4℃環(huán)境中過夜，按照同樣的方法與二抗在室溫中孵育2 h后，ECL發(fā)光，以Vision Workers LS分析條帶的光密度值，內(nèi)參設(shè)置為β-actin。

1.2.2MTT測定IL-24對肺癌細胞增殖影響 按照Control、pcDNA3.1、pcDNA3.1-IL-24分組方法將肺癌細胞接種到96孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。將培養(yǎng)板取出后，分別用移液槍在每個孔內(nèi)添加10 μl的MTT，置于37℃中培養(yǎng)4 h。將培養(yǎng)板取出后，將孔內(nèi)的液體吸棄，每孔加150 μl的DMSO，反應10 min后，置于酶標儀上測定490 nm的A值。

1.2.3Transwell小室測定IL-24對肺癌細胞侵襲和遷移影響 用含有1%胎牛血清的細胞培養(yǎng)液把Control、pcDNA3.1、pcDNA3.1-IL-24細胞均配制成每毫升含有105個的單細胞懸浮液，每組吸取200 μl 添加到Transwell小室的上室，同時吸取600 μl 含血清的細胞培養(yǎng)液至下室內(nèi)，培養(yǎng)2 d 以后，將小室取出，取棉簽將聚碳酸酯膜表面的細胞清除掉，添加PBS將膜洗滌2次，晾干，添加甲醛固定，結(jié)晶紫染色，在400倍光學顯微鏡下計數(shù)細胞遷移數(shù)目。細胞侵襲實驗同上，侵襲實驗前用1∶6稀釋的基質(zhì)膠把Transwell小室濕化。

1.2.4Western blot檢測IL-24對肺癌細胞中E-cadherin、MMP-2、MMP-9和Ki-67蛋白表達影響 取Control、pcDNA3.1、pcDNA3.1-IL-24細胞培養(yǎng)2 d 以后，按照Western blot方法檢測細胞中E-cadherin、MMP-2、MMP-9和Ki-67蛋白表達變化，步驟同1.2.1.2。

1.2.5E-cadherin shRNA和pcDNA3.1-IL-24共轉(zhuǎn)染對肺癌細胞增殖、侵襲遷移影響 在肺癌細胞中共轉(zhuǎn)染E-cadherin shRNA和pcDNA3.1-IL-24，同時共轉(zhuǎn)染shRNA陰性對照和pcDNA3.1-IL-24，分別設(shè)置為pcDNA3.1-IL-24+shRNA-E-cadherin和pcDNA 3.1-IL-24+shRNA-NC。按照上述MTT、Transwell小室和Western blot檢測細胞增殖、侵襲遷移和E-cadherin、MMP-2、MMP-9、Ki-67蛋白表達變化。

2 結(jié)果

2.1pcDNA3.1-IL-24提高肺癌細胞中IL-24表達水平 在肺癌細胞中轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-IL-24，細胞中IL-24 mRNA和蛋白水平均升高。pcDNA3.1-IL-24提高肺癌細胞中IL-24的表達。見圖1和表1。

2.2過表達IL-24抑制肺癌細胞增殖、侵襲和遷移 在肺癌細胞中轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-IL-24，細胞A490、侵襲數(shù)目、遷移數(shù)目及侵襲遷移蛋白MMP-9、MMP-2、增殖蛋白Ki-67表達水平均降低。過表達IL-24抑制肺癌細胞增殖、侵襲和遷移。見圖2和表2。

2.3過表達IL-24上調(diào)肺癌細胞中E-cadherin蛋白表達 在肺癌細胞中轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-IL-24，細胞中E-cadherin蛋白表達水平升高。過表達IL-24上調(diào)肺癌細胞中E-cadherin蛋白表達水平。見圖3和表3。

2.4E-cadherin shRNA逆轉(zhuǎn)過表達IL-24抗肺癌細胞增殖侵襲和遷移作用 在肺癌細胞中共轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-IL-24和IL-24 shRNA，細胞侵襲遷移數(shù)目和A490均高于共轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-IL-24和shRNA陰性對照的肺癌細胞。見表4。E-cadherin shRNA逆轉(zhuǎn)過表達IL-24抗肺癌細胞增殖侵襲和遷移作用。

圖1 Western blot檢測pcDNA3.1-IL-24轉(zhuǎn)染后肺癌細胞中IL-24蛋白表達水平Fig.1 Western blot detection of IL-24 protein expression level in lung cancer cells transfectad with pcDNA3.1-IL-24Note: 1.Control；2.pcDNA3.1；3.pcDNA3.1-IL-24.

GroupsIL-24mRNAIL-24proteinControl1.00±0.090.23±0.04pcDNA3.11.01±0.130.22±0.06pcDNA3.1-IL-242.35±0.241)0.43±0.05F65.70616.403P0.0000.004

Note：Compared with pcDNA3.1，1)P<0.05.

2.5E-cadherin shRNA逆轉(zhuǎn)過表達IL-24抗肺癌細胞中MMP-2、MMP-9和Ki-67蛋白表達作用 在肺癌細胞中共轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-IL-24和IL-24 shRNA，細胞中MMP-2、MMP-9和Ki-67蛋白水平升高，E-cadherin蛋白水平降低，與共轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-IL-24和shRNA陰性對照的肺癌細胞比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖4和表5。E-cadherin shRNA逆轉(zhuǎn)過表達IL-24抗肺癌細胞中MMP-2、MMP-9和Ki-67蛋白表達作用。

圖2 Western blot檢測pcDNA3.1-IL-24轉(zhuǎn)染后肺癌細胞中MMP-9、MMP-2和Ki-67蛋白表達水平Fig.2 Western blot detection of MMP-9,MMP-2 and Ki-67 protein expression levels in lung cancer cells transfected with pcDNA3.1-IL-24Note: 1.Control；2.pcDNA3.1；3.pcDNA3.1-IL-24.

GroupsE-cadherinControl0.13±0.02pcDNA3.10.14±0.04pcDNA3.1-IL-240.25±0.031)F13.759P0.006

Note：Compared pcDNA3.1，1)P<0.05.

GroupsA490NumberofinvasionNumberofmigrationMMP-9MMP-2Ki-67Control0.45±0.0568.54±8.35135.64±12.080.67±0.080.64±0.060.53±0.05pcDNA3.10.44±0.0367.12±7.69133.80±10.650.70±0.060.65±0.040.54±0.03pcDNA3.1-IL-240.26±0.031)31.46±3.271)73.41±6.971)0.28±0.041)0.19±0.021)0.22±0.031)F23.93028.46936.64642.595110.94669.279P0.0010.0010.0000.0000.0000.000

Note：Compared with pcDNA3.1，1)P<0.05.

GroupsA490NumberofinvasionNumberofmigrationpcDNA3.1-IL-24+shRNA-NC0.27±0.0234.81±5.1670.98±8.12pcDNA3.1-IL-24+shRNA-E-cadherin0.38±0.031)54.16±4.781)98.63±7.551)t5.2844.7654.319P0.0060.0090.013

Note：Compared with pcDNA3.1-IL-24+shRNA-NC，1)P<0.05.

GroupsE-cadherinMMP-9MMP-2Ki-67pcDNA3.1-IL-24+shRNA-NC0.29±0.050.24±0.060.21±0.030.21±0.05pcDNA3.1-IL-24+shRNA-E-cadherin0.16±0.021)0.56±0.051)0.35±0.041)0.34±0.051)t4.1817.0974.8503.184P0.0140.0020.0080.033

Note：Compared with pcDNA3.1-IL-24+shRNA-NC，1)P<0.05.

圖3 Western blot檢測pcDNA3.1-IL-24轉(zhuǎn)染后肺癌細胞中E-cadherin蛋白表達水平Fig.3 Western blot detection of E-cadherin protein expression in lung cancer cells after transfection with pcDNA3.1-IL-24Note: 1.Control；2.pcDNA3.1；3.pcDNA3.1-IL-24.

圖4 Western blot檢測 pcDNA3.1-IL-24和E-cadherin shRNA共轉(zhuǎn)染后肺癌細胞中E-cadherin、MMP-2、MMP-9和Ki-67蛋白表達水平Fig.4 Western blot detection of E-cadherin,MMP-2,MMP-9 and Ki-67 protein expression levels in lung cancer cells co-transfected with pcDNA3.1-IL-24 and E-cadherin shRNANote: 1.pcDNA3.1-IL-24+shRNA-NC;2.pcDNA3.1-IL-24+shRNA-E-cadherin.

3 討論

IL-24是新發(fā)現(xiàn)的腫瘤抑制基因，其是在黑色素瘤細胞中發(fā)現(xiàn)的，后續(xù)人們根據(jù)其染色體定位、細胞因子樣特性等方面綜合考慮將其歸于IL-10家族，其可以高效且具有選擇性地發(fā)揮抗腫瘤作用，具有調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)等功效[7-9]。很多研究報道顯示，在腫瘤細胞中轉(zhuǎn)染IL-24可以誘導腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤細胞生長侵襲和遷移，IL-24是一個具有潛力的腫瘤抑制因子[10]。目前在宮頸癌細胞中的研究報道表明，IL-24可以在體外抑制宮頸癌細胞的侵襲和遷移，在黑色素瘤細胞中也發(fā)現(xiàn)IL-24具有抗腫瘤侵襲的作用[11,12]。在肺癌細胞中已經(jīng)驗證發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染IL-24可以抑制肺癌細胞的生長并誘導細胞凋亡發(fā)生，說明IL-24在肺癌中可能也發(fā)揮抑制作用[13]。本次實驗在肺癌細胞中轉(zhuǎn)染IL-24，發(fā)現(xiàn)過表達IL-24后的肺癌細胞增殖、侵襲和遷移能力均降低，這提示，IL-24具有抗肺癌細胞增殖侵襲和遷移的作用，說明IL-24是一個肺癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移抑制因子，對于其在其他各株肺癌細胞和肺癌體內(nèi)轉(zhuǎn)移中的作用尚不清楚，還需要在以后的實驗中進行驗證。

腫瘤細胞的增殖、侵襲及遷移等均受到細胞內(nèi)多種基因的調(diào)控作用，目前已知Ki-67是細胞增殖活性的標志蛋白，其表達水平越高表明細胞增殖能力越強，反之其表達水平降低后標志著細胞增殖能力下降[14]。腫瘤細胞從原來的位置脫落經(jīng)過血管或淋巴管進入到遠端組織惡性增殖形成轉(zhuǎn)移灶的過程需要細胞外基質(zhì)降解酶的作用，腫瘤細胞合成細胞外基質(zhì)降解酶是腫瘤細胞轉(zhuǎn)移和侵襲的基礎(chǔ)[15,16]。MMP-2和MMP-9是基質(zhì)金屬蛋白酶家族，而基質(zhì)金屬蛋白酶是細胞外基質(zhì)降解的主要原因，MMP-2和MMP-9也是目前發(fā)現(xiàn)與腫瘤轉(zhuǎn)移關(guān)系最為密切的蛋白酶[17,18]。本次實驗發(fā)現(xiàn)過表達IL-24后的肺癌細胞中MMP-9、MMP-2和Ki-67蛋白水平均降低，說明IL-24具有抗肺癌細胞侵襲遷移和增殖的作用，這與檢測細胞增殖、侵襲和遷移結(jié)果一致。

目前對于IL-24抗腫瘤機制研究尚不明確，在肝細胞癌細胞中的研究發(fā)現(xiàn)，IL-24高表達后的肝癌細胞中E-cadherin蛋白表達水平升高，后續(xù)在宮頸癌等腫瘤中也證實IL-24可以提高E-cadherin蛋白表達水平，IL-24作用機制可能與E-cadherin有關(guān)[19，20]。本實驗證實，過表達IL-24后的肺癌細胞中E-cadherin蛋白表達水平升高，并且下調(diào)E-cadherin可以逆轉(zhuǎn)過表達IL-24對肺癌細胞增殖侵襲和遷移的作用，這提示IL-24通過上調(diào)E-cadherin的表達抑制肺癌細胞增殖、侵襲和遷移。

總而言之，IL-24具有體外抗肺癌細胞增殖、侵襲和遷移的作用，其作用機制與上調(diào)E-cadherin有關(guān)，這為研究IL-24的抗腫瘤機制提供了參考，在肺癌細胞中表達外源性的IL-24可能是治療肺癌的潛在途徑。